巯基peg可以用来调控距离

【 结构式 】 CH3O（CH2CH2O）nOCCH=CH2 （ n=8～33 ） 【 产品指标 】 产品名称 外观(25 ± 1 ℃) pH(5% 水溶液) 酯含量( %) MPEG- 丙烯酸酯（ 400 ） 无色至浅黄色液体 2-4 ＞ 97 MPEG- 丙烯酸酯（ 750 ） 无色至浅黄色膏体 2-4 ＞ 97 MPEG

Macrogol Esters

中文名称：聚乙二醇酯〔药用辅料〕.

作用：由于在制片的过程中，聚乙二醇酯的可塑性和它可提高片剂释放药物的能力，高分子量的聚乙二醇酯（聚乙二醇酯4000和聚乙二醇酯6000）作为制造片剂的粘合剂是很有用途的。聚乙二醇酯可使片剂的表面有光泽而且平滑，同时不易损坏。此外，少量的高分子量的聚乙二醇酯（聚乙二醇酯4000和聚乙二醇酯6000），可以防止糖衣片剂之间粘接合与药瓶之间粘接。

特点：聚乙二醇酯分子特性（下面虽然是聚乙二醇的特点，但是它的酯仍然适用，因为聚乙二醇的酯酯溶性更强，容易被组织吸收。

（1）聚乙二醇是经环氧乙烷聚合而成的，由重复的氧乙烯基组成。不仅具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、N`N`-二甲基甲酰胺、苯、乙腈和乙醇等有机溶剂，具有线性（相对分子量5000~30000）或支化（相对分子量力40000~60000）的链状结构，线性PEG分子式为H-（O-CH2-CH2）n-OH。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇（mPEG），线性mPEG的分子式为CH3-（O-CH2-CH2）n-OH，在多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰研究中应用最多的是mPEG的衍生物。

（二）聚乙二醇的生理特性

聚乙二醇是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。聚乙二醇即PEG具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。当藕联到药物分子或药物表面时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。聚乙二醇类修饰剂的药物动力学性质因它们的相对分子量和注射给药方式而异，分子量越大，半衰期越长。经过细胞色素P450系统的氧化作用，PEG分解成小分子的PEG，经胆汁排泄。

（三）聚乙二醇修饰及相关技术

（1）药物的聚乙二醇修饰即PEG化，是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上。其中研究得最多的是蛋白质的PEG修饰，始于是20世纪70年代。药物经PEG修饰后，往往会具有以下优点：1、更长的半衰期2、较低的最大血药浓度3、血药浓度波动较小4、较少的酶降解作用5、较少的免疫原性及抗原性6、较小的毒性7、更好的溶解性8、用药频率减少9、提高病人的依从性，提高生活质量，降低治疗费用9、脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用。修饰途径对蛋白和多肽主要有氨基修饰（包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N端氨基的烷基化修饰）、羧基修饰、巯基修饰，还有其它如控制pH实现SC-mPEG选择性修饰蛋白质中的组氨酸侧链的咪唑基团和用谷氨酰胺转氨酶将mPEG-NH2转移到蛋白质的谷氨酰胺侧链上，实现对谷氨酰胺的选择性修饰，其中主要是对N末端或赖氨酸侧链氨基进行酰化修饰，因为蛋白或许多多肽结构中存在多个氨基，所以控制和确定修饰位点及修饰程度一直是蛋白和多肽的聚乙二醇修饰中的难点，肽类化合物的合成中可以通过采用适当的保护策略来实现对氨基的定点修饰，而有机小分子药物的PEG修饰途径主要是将PEG与这些小分子药物上的-OH，-NH2，-COOH相偶联，如待修饰的小分子药物不具备这些功能基团，可通过化学方法引入。

（2）PEG修饰的相关技术主要是以下三个方面：1、PEG的相对分子量的选择 现在普遍采用的是分子量大于20000的高分子量的PEG作为修饰剂。分子量的选择要综合考虑生物活性和药代动力学两方面的因素。已有的研究证明，修饰的蛋白药物在体内的作用时间与藕联的PEG数量和相对分子量成正比，在体外的生物活性与偶联的PEG数量和相对分子量成反比，应用分子量过大的PEG修饰蛋白药物会导致药物丧失绝大部分的生物活性。以往采用低分子量（〈20000〉的PEG 修饰蛋白药物结果显示出修饰后的蛋白药物较原型药物在生物活性和药代动力学性质上没有本质的改变，修饰时具体的PEG分子量的选择要根据实验确定，一般选择分子量在40000~60000范围内的PEG作为修饰剂。2、修饰位点的选择 蛋白质PEG修饰时要根据蛋白质构效关系的分析，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，这样修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。有机小分子药物的修饰位点与生物活性无关。理想的PEG修饰技术是根据要修饰的位点选择适当的PEG得到均一性的产品。3、其它化学因素 PEG修饰反应需要高度的特异性和温和的反应条件，为得到高产率的、均一的目的修饰产物，实验过程中要控制反应体系的pH值、药物浓度、反应物间的计量关系、反应时间、反应温度。

(四)、药物PEG修饰的研究及应用进展

1、对蛋白药物修饰的研究及应用进展

蛋白药物的PEG修饰已卓有成效，国际知名的制药公司已经或正在积极推进蛋白药物的PEG修饰，1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被FDA批准上市，近几年上市的有PEG-干扰素、PEG-GSF、PEG-生长抑素。目前处于临床前研究的PEG修饰的蛋白药物有几十种，处于临床实验的有：超氧化物歧化酶（即将上市，Enzon公司）、白介素-2（Ⅱ期，Chiron公司）、水蛭素（Ⅱ期，BASF AG公司）、抗-TNFα抗体片段（Ⅲ期，Pharmacia公司）、牛血红蛋白（Ⅰ期，Enzon公司）、抗-PDGF抗体片段（Ⅱ期，Celltech公司）

2、肽类化合物PEG修饰的研究进展

肽类化合物PEG修饰的研究晚于蛋白质的相关研究，近年来也取得了一些进展，如畦降钙素、表皮生长因子的PEG修饰产物的半衰期和生物活性显著高于原型药物。尤其是肽类化合物在聚乙二醇定点修饰方面较蛋白质更易于实现。在肽类化合物的PEG修饰研究中应用最普遍的是mPEG，先在mPEG的末端引入羧基、氨基或其它活性基团，或者制备经mPEG修饰的氨基酸衍生物，再利用固相或液相法将其偶联到肽序列中去，实现对多肽的N端，C端及某些氨基酸侧链的聚乙二醇化修饰。

3、PEG修饰脂质体

PEG修饰后的阿霉素脂质体较原型药物相比：降低了心脏毒性，增强了病人的耐受性，在体内发挥控释和靶向药物的作用

4、PEG修饰有机小分子药物

PEG修饰的喜树碱已进入Ⅰ期临床试验，适当的PEG修饰后的紫杉醇较修饰前有更好的治疗效果、溶解性、选择性和半衰期

2.1 概述

 在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。

 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：

 ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。

 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。

 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。

 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。

 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：

 ①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。

 ②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。

 ③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。

 ④生物材料的破碎和预处理。

 ⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。

 ⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。

 ⑦产物的浓缩，干燥和保存。



 分析测定的方法主要有两类：

 即生物学和物理、化学的测定方法。

 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；

 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。

 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。

要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：

 ①在水和各种有机溶剂中的溶解性。

 ②在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。

 ③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。

 ④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。

 ⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。

 ⑥对其他生物分子的特殊亲和力。

 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。

 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：

 ①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；

 ②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。

 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。

 2.2 生物大分子制备的前处理

 2.2.1 生物材料的选择

 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。

 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。

 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。

 植物要先去壳、除脂。

 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。

 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。

 2.2.2 细胞的破碎

 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。

 (1)机械法：

 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。

 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。

 (2)物理法：

 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。

 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。

 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。

 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。

 (3)化学与生物化学方法：

 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。

 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。

 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。

 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。



 2.2.3 生物大分子的提取

 “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。

 影响提取的因素主要有：

 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；

 由固相扩散到液相的难易；

 溶剂的pH值和提取时间等。

 通常：

 极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；

 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；

 温度升高，溶解度加大；

 远离等电点的pH值，溶解度增加。

 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。

 ⑴ 水溶液提取：

 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：

 1) 盐浓度（即离子强度）：

 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。

 绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。

 为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。



 2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。

 3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。

 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。

 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。

 ⑵ 有机溶剂提取

 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。

 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。

 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。

例如，胰岛素（见讲义p36）。

 2.3 生物大分子的分离纯化

 由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。

 为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：

 沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。

 2.3.1 沉淀法

 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。

 其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。

 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：

 ⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。

 ⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。

 ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。

 ⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。

 ⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。

 2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法）

 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。

 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：

 ①成本低，不需要特别昂贵的设备。

 ②操作简单、安全。

 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。

 ⑴ 中性盐沉淀蛋白质的基本原理

 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图 4”所示。

 ⑵ 中性盐的选择

 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：

 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：

 表2-1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）

 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃

（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103

 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2

 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101









 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵

盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯

度提高了四倍。

 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的

作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的

（NH4）2SO4保存可达数年之久。

 4) 价格便宜，废液不污染环境。

 ⑶ 盐析的操作方法

 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。

 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。

 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。

 ⑷ 盐析曲线的制作

 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下(讲义p39)：

蛋白质量(mg)或酶活力

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱

和度％

 ⑸盐析的影响因素

 1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25 mg/mL～30mg/mL。

 2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。

 3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。



 2.3.1.2 有机溶剂沉淀法

 ⑴基本原理

 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：

 ①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。

 ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。



 有机溶剂沉淀法的优点是：

 ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。

 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。

 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。

 ⑵有机溶剂的选择和浓度的计算

 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。

 为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。

 ⑶有机溶剂沉淀的影响因素

 1) 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。

 一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。

 2) 样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。

 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。



 3) pH值：选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。

 4) 离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。

 沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。

 2.3.1.3 选择性变性沉淀法

 这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯。

 ⑴ 热变性

 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。

 ⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性

 使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。

 ⑶ 选择性酸碱变性

 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。

 2.3.1.4 等电点沉淀法

 利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。

 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。

 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。

 2.3.1.5 有机聚合物沉淀法

 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是

“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 简写为 PEG )，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。

 本方法的优点是：

 ①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。

 ②沉淀效能高，使用很少量的P“EG即可以沉淀相当多

的生物大分子。

 ③沉淀后有机聚合物容易去除。

 2.3.2 透析

 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。

 透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常为1万左右。

 用1％ BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 检查NaCl、KCl等。

 2.3.3 超滤

 超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。

 超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。

 超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。

 微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa，膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。

 超滤所用操作压为4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔径为10—100埃，用于分离大分子溶质。

 反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。

 超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。

 在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。

 超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。

 超滤技术的关键是膜。

 常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，能连续用1～2年。

 超滤膜的基本性能指标：水通量（cm3/(cm2•h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。

 超滤装置由若干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。

 由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。

 2.3.4 冰冻干燥

 冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。

酶分离纯化的最终目的是获得单一纯净的酶，因此，容许在不破坏“目的酶”的限度内，使用各种手段酶与底物和抑制剂的结合常使其理化性质和稳定性发生改变，这种特性已被用于酶的分离纯化。

由于酶及其来源的多样性及与之共存的高分子物质的复杂性，目前还很难找到一种通用的方法以适用于一切酶的纯化。为了使一种酶达到高度纯化，往往需要多种方法协同作用，通过酶活性的跟踪检测确定最佳流程。

扩展资料：

酶的本性是蛋白质，凡可用于蛋白质分离纯化的方法都同样适用于酶，但酶易失活，故分离纯化需在低温(4℃)、温和pH(4<pH>10)等条件下进行。

与蛋白质类似，酶易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，因此操作中应尽量减少泡沫形成，此外重金属易使酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称是分离纯化。

参考资料来源：百度百科——酶分离纯化方法

1.一种阻垢阻燃防腐蚀防沸的防冻液制作方法：按重量比，各组成成份的百分比为：

去离子水30-65.5%、 乙二醇30-60%、 壬二酸二辛脂1-10%、 二乙二醇单甲醚1-10%、 三聚磷酸钠0.2-0.3%， 多聚磷酸钾0.4-0.5%、 丙烯酸盐1.1-1.2%， 磷酸二氢铵0.2-0.4%， 次磷酸钾0.2-0.4%， 亚磷酸钠0.3-0.5%，

此种方法具有冰点低、防腐、阻垢、高沸点、阻燃等特点。

温带气候防冻液的配方组成成分：

乙二醇、水、三乙醇胺、羟基乙叉磷酸（HEDP）、水解马来酸酐、EDTA或其钠盐、亚甲基蓝染料 ；

适应于-50℃的寒带气候防冻液的配方组成成分：

丙二醇、水、三乙醇胺、氨基多酰基甲叉磷酸、水解马来酸酐、EDTA或其钠盐、亚甲基蓝染料。

3号：该防冻液具有抑沸、高效阻垢、高效防腐、低温防冻和不燃不爆安全可靠的性能。完全可以满足新时期汽车保养新理念的的各项要求。 可以在最低温度-35℃的地区使用的最佳配方组分包括：

乙二醇、二甲基亚砜、硼砂、钼酸钠、硝酸钠、磷酸钠、硅酸钠、苯并三唑、苯甲酸钠、2-巯基苯并噻唑钠、甲苯基三唑钠、聚乙二醇（600）、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、亚甲基蓝、去离子水；

可以在最低温度-50℃的地区使用的最佳配方组分包括：

乙二醇、二甲基亚砜、硼砂、钼酸钠、硝酸钠、磷酸钠、硅酸钠、苯并三唑、苯甲酸钠、2-巯基苯并噻唑钠、甲苯基三唑钠、聚乙二醇（600）、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、亚甲基蓝、去离子水。

4号：该防冻液用乙二醇和蒸馏水作为降凝剂，加入一定数量有效组分pH值缓冲剂硼砂、稳定剂甘露醇、染色剂荧光黄、防锈剂苯并三唑、对硝基苯甲酸、磷酸钠、硅酸钠、2-巯基苯并噻唑钠与和防腐剂苯甲酸钠组成的。

配方组分包括：乙二醇、蒸馏水、硼砂、硅酸钠20％水溶液、苯并三唑、苯甲酸钠、对硝基苯甲酸、磷酸钠、2-巯基苯并噻唑钠、甘露醇、荧光黄。

5号：该防冻液，组成简单；生产方便。产品造价低廉，可以配制成-10℃到-5O℃范围内防冻的各种防冻液，能在冷却系统的金属表面形成一层保护钝化薄膜，能有效地抑制金属的腐蚀，此外还具有较高的沸点，能有效地防沸，减少水份的蒸发。

配方组分包括：甘醇、重铬酸钾、亚硝酸钠、四硼酸钠、六偏磷酸钠、水。

6号：该防冻液以乙二醇为主要原料，工艺简单、原材料丰富，因而有利于实现高产低成本的宗旨，而且此方法制成的防冻液具有很低的凝固温度。

防冻液的凝固点温度为-27℃的配方组分：乙二醇、巯基苯并噻唑、蒸馏水、磷酸三乙醇胺、硼砂、氢氧化钠、苯甲酸钠；

防冻液的凝固点温度为-37℃的配方组分：乙二醇、巯基苯并噻唑、蒸馏水、磷酸三乙醇胺、硼砂、氢氧化钠、苯甲酸钠；

防冻液的凝固点温度为-45℃的配方组分：乙二醇、巯基苯并噻唑、蒸馏水、磷酸三乙醇胺、硼砂、氢氧化钠、苯甲酸钠。

7号：该防冻液用正磷酸盐和磷酸配合起来调节PH值比用氢氧化钾配合酸式磷酸盐调节pH值优越，因为正确磷酸盐和酸式磷酸盐的防腐作用和程度基本相同，而氢氧化钾是一个单纯的pH值调节剂，磷酸却是个兼有防癌作用的pH值调节剂，从这一点上看，用正磷酸盐和磷酸混合起来调节pH值可进一步降低液体对铁和铝的腐蚀同时正磷酸盐和磷酸都比较便宜有利于降低成本。另外，该防冻液的着色剂，能够指示冷却液酸碱度的变化，着色剂的这一功能对使用者来说是非常重要的，有了这一功能，使用者可以对防冻液的防癌性能进行直观监督与检查。

配方组分包括：乙二醇、磷酸钠、硝酸钠、硅酸钠、苯并三氮唑、硼砂、磷酸、中性红和亚甲基蓝。

在接种10d后采收病叶，在0.02mol/L的磷酸缓冲液（pH8），含有0.02mol/Lβ-巯基乙醇和Al203（每1g叶片+1.4m1缓冲液+0.15g.A12O3）中研磨。在1500r/min下离心15～20min后，将上清液与磷酸钙溶液（0.8ml/g叶片组织）充分混合。继续在1500r/min下离心15～20min。收集上清液，在78000r/min下离心3h。将沉淀物溶于0.01mol/LEDTA（pH6.0），并用柠檬酸调至pH5.0，再离心使病毒粒子沉淀。再用NaOH调上清液至pH6.0，通过高速离心富集病毒粒子。将沉淀物溶于0.01mol/LEDTA（pH6.0）中，在此条件下，病毒粒子保持良好的稳定性。以曼陀罗作为病毒提取源的植物可以获得400μg/g组织的产量。有些分离物不能采用这种方法提纯，需要在研磨时加入聚乙二醇（PEG.6000）和0.1mol/L.NaCl。详细参见Fulton，R.W.Virology.1967，32：153。另一种从Nicotiana.edwardsonii组织中提纯病毒的方法是利用Triton.X-100，程序包括采用碳素冻融法和二乙醚-CC14对叶片提出物进行澄清。

电镀铜中间体包括碱铜CB系列和酸铜系列。碱铜的CB系列有四种中间体：CB-1，CB-4，CB-5和CB-6，公司仍然为客户提供全套的产品和一揽子服务。酸铜系列中间体有：聚二硫二丙烷磺酸钠(SPS)、3-巯基丙烷磺酸钠(MPS)、N,N-二甲基二硫代羰基丙烷磺酸钠(DPS)、异硫脲丙磺酸内盐(UPS)、3-(苯骈噻唑-2-巯基)-丙烷磺酸钠(ZPS)、四氢噻唑-2-硫酮(H1)、聚乙烯亚胺季铵盐(PNP)、2-巯基苯骈咪唑(M)、乙撑硫脲(N)和聚乙二醇(P-6000)。

SPS为聚二硫二丙烷磺酸钠，主要应用于电镀酸性镀铜。作为酸性镀铜中间体，属于镀铜添加剂中的主要添加成份，能起到使镀层结晶细化，有效提高电流密度的作用。SPS在传统的M、N体系的酸铜光亮剂中是最主要的光亮剂，即使在目前市场上最先进的染料型酸铜光亮剂中，它也是重要的成分之一。在整个酸铜光亮剂市场上，此产品需求量很大，应用效果优良

醋酸换人，苯液（ 10毫升， 20 ％瓦/五）

烷基卤化物还含0.5 g的聚乙二醇或tergitol添加

以1.5克的固体，干燥醋酸钾和由此产生的悬浮

加热回流。样品进行了定期撤回注射器

对气相色谱分析烷基卤化物失踪和产品醋酸

外观。这些浓度来计算

伪一阶速率常数表一应当指出

该利率获得这个程序的功能是所有

系统参数包括搅拌速度，体积的比率，并

容器的几何形状。这些参数进行了常数

允许比较不同衬底。

该酸酯的硫二甘醇为原料，通过添加

2 -巯基乙醇，以醋酸乙烯酯？ *核磁共振氢谱（ CDCl ） 4.41 （吨，

2小时，甲烷， 02C ） ， 4.07 （秒， 1小时，俄亥俄州） ， 3.90 （吨， 2小时，甲烷，氢） ， 2.86 （男，

4小时，甲烷，硫） ， 2.14 （秒， 3小时， CHJ含量。

烷基化反应。 Tergitol或聚乙二醇（ 0.5 g ）项增加了10毫升的

20 ％ （ V / V ）的溶液中苯乙腈烷基卤化物，和

那么这个解决办法是增加了10毫升的60 ％ （宽/ W型）水

氢氧化钾。由此产生的两相体系的搅拌

磁在室温下。样本撤回

一个真实的样本编制的同一过程。在烯烃

被删除的变暖系统60 “ C和收集

液态氮陷阱： '核磁共振（ CDCl ） ， 6.39 （ 9 ， 1小时，甲烷） ， 5.01

氧化。这种反应是相同的表现

消除，但60 ％的氢氧化钠溶液代替

用5 ％次氯酸钠。

致谢。我们非常感谢金融

支持这项研究由美国陆军研究办公室（ DAAG29 - 82 -的K - 0181 ） 。