大家有知道细菌基因组DNA提取试剂盒的吗》哪家的好

这里的论文有，但是要RMB

http://www.cnki.com.cn/Article/CJFD2005-NNXB200502014.htm

我下载了，粘贴如下：

石榴(Punica granatum L．)为石榴科石榴属植物，作为栽培的只有一个种，即石榴．目前石榴的科研工

作还比较薄弱，各地品种混杂，同物异名、同名异物现象十分严重_I]，给生产和科研带来极大的不便，所以

对各地品种进行系统分类鉴定有很大的生产和科研价值．传统的鉴定方法如形态鉴定、花粉鉴定、同工酶

鉴定等都有一定的局限性[ ，随着分子生物学的发展，从DNA水平上进行分子鉴定显示出巨大的优

越性．石榴是多年生果树，育种周期较长，从 DNA水平上进行遗传标记的分析研究，可以对遗传性状进行

预先选择，缩短育种年限．而这些工作的前提是提取高质量的DNA．DNA的提取方法_3 6_在苹果和梨、桃

等方面研究较多，石榴DNA的提取方法研究目前还少见报道，作者对此进行了初步的探讨研究．

1 材料和方法

1．1 材料

试验材料分别来源于四川攀枝花市农科所、云南会理、山东果树研究所、陕西石榴研究所等，选择‘青

皮软籽’、‘甜绿子’、‘泰山红’、‘净皮甜’石榴品种为试验材料．

收稿日期：2005—03一【)8

基金项目：河南省科技攻关项目(0422050013)

作者简介：陈延惠(1963一)，女，河南南阳人，副教授，硕士，主要从事果树遗传育种和教学工作．通讯作者：朱道圩

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第2期 陈延惠等：不同方法对石榴叶片DNA提取效果的影响

1．2 仪器与设备

Hettich D-78532低温高速离心机，Bekaman核酸蛋白分析仪，DYY一8B型电泳仪等，由河南省农科院分

子生物学重点试验室提供．

1．3 试剂

(1)2 X CTAB缓冲液：100 mmol·L 晡s．HCl(pH 8．0)，1．4 tool·L～ NaCl，80 mmol·L～ EDTA，质量分数为

2％ CTAB，体积分数为2％ BME；(2)CTAB沉淀缓冲液：50 mmol·L～Tns—HC1(pH 8．0)，10 mmol·L一1 EDTA(pH

8．0)，质量分数为1％ CTAB(3)质量分数为10％ CTAB／NaC1：质量分数为10％ CTAB，0．7 mo1．L’ Nacl；(4)高

盐TE缓冲液：10 mmol·L 瞄s—HCl(pH 8．0)，0．1 mmol·L EDTA(pH 8．0)，l tool·L～NaC1；(5)TE缓冲液：l0

mmol·L 1hs—HC1(pH 8．0)，0．1 mmol·L。。EDTA；(6)SDS提取缓冲液：10 mmol·L 瞄s—HC1(pH 8．0)，100

mmol·L～NaC1，50 mmol·L EDTA(pH 8．0)，质量分数为2％ SDS，体积分数为2％ BME；(7)PmaseA贮液：l0

mg·mL～；(购于上海生工生物工程公司)(8)5 mol·L～KAC；(9)液氮；(10)I，(氯仿)：I，(异戊醇)=24：l：(11)

3 mo!·L NaAC(pH 5．2)；(12)异丙醇；(13) (苯酚)： (氯仿)=l：l；(14)琼脂糖、Taq酶及引物S 473

(GGAGTGCCTC)(购于上海生物工程公司)(15)体积分数为70％ 乙醇；(16)无水乙醇．

1．4 DNA的提取方法

1．4．1 DNA的提取和纯化取2 g石榴叶片放人预冷的研钵中，加人适量石英砂，液氮快速研磨成粉末．

在粉末融化之前分装于4支I．5 mL离心管中，立即分别加人65 c【=预热的4种提取缓冲液．其中2管分别

加人50OraL 2 X CTAB提取缓冲液，管上分别标记CTAB I，CTABⅡ．另2管分别加人500 gL SDS提取缓冲

液，管上分别标记SDS I，SDSⅡ，轻轻震荡几下，使粉末均匀分布在提取液中，放人水浴锅65℃水浴．CTAB

法保温l h，SDS法保温30 min，其问混匀几次．然后按以下方法分别提取、纯化．

1．4．1．1 SDS I法 (1)加人等体积 (氯仿)： (异戊醇)=24：l，12 000 r·min。。，4℃条件下，离心10 min，

抽提两次．(2)取上清，加人2／3体积冷异丙醇(一20℃)，室温沉淀30 min．(3)10 000 r·min～ ，4℃条件下

离心10rain，沉淀分别用体积分数为70％乙醇和无水乙醇各清洗1次，放在超净工作台上吹干。(4)沉淀溶

于适量高盐TE中，如不能完全溶解，65℃水浴10 min．(5)加人2倍体积无水乙醇，～20℃沉淀30 min．

(6)勾出DNA沉淀，放在超净工作台上吹干沉淀．

1．4．1．2 SDSⅡ法 (1)加人1／3体积冷KAC溶液，立即冰上放置30 min．(2)12 000 r·min～ ，4℃ 条件

下，离心10 rain，取上清，加人等体积的l，(氯仿)：I，(异戊醇)=24：l，12 000 r·min～，4℃条件下，抽提2次．

(3)加入2／3体积(一20℃)冷异丙醇，室温沉淀30 min，10 000 r·min～，4℃条件下，离心10 min，沉淀分别

用体积分数为70％ 乙醇和无水乙醇各清洗1次，放在超净工作台上吹干．

1．4．1．3 CTAB I法 (1)加人等体积I，(氯仿)：l，(异戊醇)：24：l，12 000 r·min～，4℃ 条件下，离心10

fnjn，抽提2次．(2)取上清，加人2／3体积一20％冷异丙醇，室温沉淀30 min．(3)10 000 r·min～，4℃条件

下，离心10 min，分别用体积分数为70％ 乙醇和无水乙醇清洗1次．(4)放在超净工作台上吹干沉淀．

1．4．1．4 CTABⅡ (1)加人等体积l，(氯仿)：l，(异戊醇)=24：l，12 000 r·min。。，4℃条件下，离心10 min

抽提2次．(2)取上清，加人1／10体积65℃ 预热的质量分数为10％ CTAB／NaC1溶’液，加人等体积l，(氯

仿)： (异戊醇)=24：l抽提1次．(3)重复步骤(2)，吸上清加人等体积CTAB沉淀液，65qC，水浴30 min．

(4)用适量高盐TE溶解沉淀，65℃，水浴30 min．(5)加人2／3体积一20℃冷异丙醇，混匀后10 000 r。

mi ～，4℃条件下，离心10 min．(6)加人体积分数为70％ 乙醇和无水乙醇各清洗沉淀1次，在超净工作

台上吹干．

以上各方法所得4种DNA分别溶于100 TE中，各加人3 RNaseA，37℃保温30 min．加人20o TE，加

人等体积l，(氯仿)：I，(异戊醇)=24：l，10(100 r·min～，4c【=条件下，离心10 min．取上清，各加人1／10体积冷

NaAc，再加人2倍体积无水乙醇，一20℃沉淀30 min，用枪头勾出沉淀，用体积分数为70％ 乙醇和无水乙醇各清

洗1次，超净工作台吹干，溶于l00 TE中，一20％长期保存．统计时取4次试验结果的平均值．

1．4．2 DNA的检测方法

1．4．2．1 DNA的纯度和得率检测4种方法所得DNA用核酸蛋白分析仪进行测定，取l L DNA溶液，用

rE稀释50倍，TE作为空白对照，测得相应的OD值，若0D值介于1．8～2．0，则DNA纯度较好，有

DNA得率／( g·g )=A260 x 50 X稀释倍数／叶片质量．

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河南农业大学学报 第39卷

1．4．2．2 DNA的电泳检测 取3～5 tzL DNA混合1／10 loading bufer点样，琼脂糖质量分数1％ ，电解缓冲

液为1XTAE，琼脂加热后冷却到50～60~C时加入3 L EB，电压为96、 ，电泳大约1 h后，在紫外凝胶成像

系统下观察摄像，并检测其分f量．

1．4．2．3 RAPD检测 RAPD反应条件为：94~C 预变性4 min；94~C 变性1 min，37~C退火1 min，72℃延伸2

min，共45个循环，72℃ 总延伸7 min；RAPD反应体系为：反应体系为25 ，内含：模板DNA(60 ng" L一 )1

tzL，引物S 473 l ，10×Reaction Buffer 2．5 ，dNTP混合液2 tzL，Taq酶0．2 tzL，ddH20 18．3 ．

1．4．3 比较不同EDTA浓度的提取效果 分别用20，30，50，80 mmol·L EDTA浓度比较提取效果，DNA的

点样量为2 f』L．

1．4．4 比较不同取材时期对DNA的提取效果 用CTAB I法对甜绿籽扦插幼叶和大田幼叶提取效果进

行比较，以研究本试验是否受材料来源和生长季节的限制．

目前，中国化工产业处于逐步扩张的阶段，但区域发展极不平衡，以石油、天然气等为基础原料的化工产业集群大多都分布在西部，而其输出产品的销售地和下游深加工企业又多集中在东部沿海地带，“产销分离”决定了“危化物流”运输的紧俏。比如，煤化工中的“煤制甲醇”，西北地区产能占到全国总产能的65%，而当前中国甲醇运输以汽运为主，铁路运输、水运其次，在铁路路网地理分布不均衡的背景下，主要干线运输能力已经全面饱和，如京沪、京广、陇海、石太等线绝大部分区段货运能力利用率已达100%，其货运运能不足的矛盾非常突出。

与铁路运力紧张相比，危化品采取水路运输也面临着可选择性极小的困境，因为中国缺乏具备危化品运输资质的水运企业、水运船舶及其配载的容器短缺，长期以来导致水运效率低下。在铁路运力不足、水运容器短缺的情况下，很多企业被迫选择了汽运方式，但其运输成本较高，价格是铁路运输的2倍，水运的3倍，这给企业造成了很大的压力，同时也存在更多不可预知的风险。 近年来，中国危化品仓储建设虽不断发展，但设施总量仍不能满足行业发展的需求，仓库严重短缺，一些经济发达地区缺口达30%以上。加之仓储设施布局不合理，面向市场交易的仓库不多，公共仓库偏少，因而出现了不少地下仓库，危化品异地存放于“黑仓库”的现象十分普遍，带来了安全隐患。

就现实情况来看，危化品仓库的缺口还在不断增大，其原因包括：一是中国危化品产量不断增加，但同期出口量却有所减少，致使大量产品积压；二是中国部分企业盲目投资，引发结构性产能过剩，造成库满仓平。据中国化工信息部门统计，中国硫酸过剩超过25%，甲醇超过50%，黄磷超过60%，纯碱超过25%，烧碱超过30%，电石超过30%；三是危化品仓库建设标准不规范，城市土地紧缺，危化品仓库建设步履维艰，难有立足之地。 目前，中国危化品物流市场缺乏行业标准，国内一些化工生工物流安全仅停留在国家法律法规所要求的最低层面，没有形成通行的行业标准。化工物流行业也未形成通行的自律标准和要求，化工品物流企业良莠不齐，给化工物流安全带来隐患。

在管理上制度缺失、管理缺位，危化品物流管理机制尚不健全。危化品物流行业同时受到公安、交通、质检、环保、卫生以及工商、税务、海关等部门的监督和管理，各部门虽都制定了推动本行业的有关法规和规定，但对于危化品物流的管理缺乏衔接，加上不同地区的监管力度和管理标准也不一样，其管理的差异性非常大。

此外，国际跨国公司的行业标准高于国内标准，使得国内有关部门通过审核和验证的车辆，在跨国企业不予认同，即中国的外企采用欧洲道路危险品运输安全质量评估标准，至使中国危化品物流管理标准概念模糊。 目前，中国有5000多家企业、近10万台车辆、20多万人从事危化品运输业务，每年危化品运量达1-2亿吨，但80%以上的公司没有专业的职业培训师和鉴定师，企业的从业人员缺乏专业性，比如学物流专业的不懂危化品运输的特性，学化工专业的又不懂仓储物流的规范，尤其是高级人才极度匮乏。

从全行业来看，危化品仓储业一线保管人员中，有33.57%是农民工，他们在危险品养护、科学管理方面缺乏深度认识，只能从事简单的出入库业务及装卸搬运工作。而在一线保管员中，有70%-80%的人没有进行过正规的职业技术培训，大多只接受过企业内部简单的职业教育或岗前培训，这也给行业的发展带来弊端。 由于危化品行业的不断发展，一些不具备资质的公司，甚至做普货的公司，也开始大量涌入危化品物流市场。这些企业往往在设备、技术、管理上不愿意进行更多的投入，有的用普通货车直接运输危化品，更有甚者，在普货中夹带危化品。

很多运输企业从自身效益考虑，槽罐混装，各种危化品共用一辆槽罐车，如装了苯酚的车再去装硫酸，除了腐蚀罐体之外，混装还可能产生爆炸。由于运营成本很低，在市场上可以用很低的运价招揽到客户。而低价竞争，不仅抢夺了正规公司的市场份额，还使整个危化品行业开始偏离合理的价格区间，严重影响了市场的正常秩序，加之相关部门执法不严，使得小部分物流公司可以通过超载、不规范操作等手法进一步压缩成本，确保利润。恶性市场竞争使危化品物流市场大有劣币驱逐良币之势。