两步发酵法生产维生素C的特点
制药成本大大降低，原料用量减少，生产安全性增强。
细述如下。
两步发酵法是相对莱氏法而言的，即山梨醇发酵生成山梨糖后，山梨糖又经第二步细菌氧化，直接生成2一氧代古洛糖酸，而废除了丙酮化和化学氧化两个步骤。反应过程为葡萄糖催化加氢制山梨醇，山梨醇经发酵生成L-山梨糖，再经第二步发酵到2-氧代古洛糖酸。
现将1983年的两步发酵法与莱氏法进行同等生产规模的经济指标比较，其优缺点如下：
（1）原料消耗 两步发酵法原料总单耗比莱氏法减少31.2%。
（2）成本 两步发酵法原料成本比莱氏法降低了23．3％，工厂成本降低了3．6%。
（3）质量 差别不大，在外观、含量、烘烤消光值、分解点、细度等主要控制项目上，两步发酵法略优；但在加速破坏试验中，莱氏法产品稳定性较好。
（4）能耗 两步发酵法比莱氏法高出15％。
（5）总收率（对山梨醇） 莱氏法比两步发酵法高出10％左右，主要原因是第二步微生物氧收率仍较低。
（6）安全 两步发酵法由于革除了丙酮、苯（或甲苯）、氯气等大量易燃易爆或有毒的化工原料，有利于安全生产。
莱氏法是维生素C生产的经典方法，是由Reichstein和Grussner研究开发的。系以葡萄糖作为起始原料，经催化加氢制成D．山梨醇，再经醋杆菌深层发酵氧化制得收率很高的L-山梨糖，L一山梨糖经丙酮和硫酸处理（生产上俗称丙酸化）生成双丙酮-L-山梨糖（简称双酮糖），再用苯或甲苯提取，提取液经水法除去单酮山梨糖后蒸去溶剂而后分离出来，用高锰酸钠氧化、水解、酯化、转化、中和便得VC。
除上述两大生产路线之外，还有以下合成方法的报道：（l）葡萄糖三步法，此法步骤较少，但收率低，丙酮用量大，且需用价格昂贵的棚氢化钠和铂；（2）葡萄糖醛酸内酯法；（3）5-氧代葡萄糖酸钙法；（4）2，5-二氧代-D-葡萄糖酸法；（5）利用生物技术，采用重组DNA技术，构成工程菌，实现从葡萄糖到2-氧代-L-古洛糖酸的一步发酵。该技术是目前的研究热点。
豆黄发酵并不能产生苯甲酸钠，首先苯甲酸钠是甲苯在环烷酸钴催化剂存在下，以空气氧化先制取苯甲酸，再以苯甲酸为原料，用碳酸氢钠中和，活性炭脱色，再经过过滤、干燥、粉碎制得产品。苯甲酸钠防止变质发酸、延长保质期的效果。
y＝－60.28x＋其中x－蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M）y－蔗糖转化进程中体系的旋光度值－不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计算。＝66.6×L×C（L＝10cm，C是蔗糖浓度g/mL）通过上述的直线方程，可以测定任何浓度蔗糖转化体系的旋光度值，求出其转化成葡萄糖的浓度x，从而可以求得不同反应时间的葡萄糖浓度。3． 酶比活性的测定配制2.5％的蔗糖溶液100 mL，测定其旋光度。在20℃的条件下加入蔗糖酶5 mL，反应3分钟测定体系旋光度值y，用公式 y＝－60.28x＋ 求出葡萄糖浓度x，及生成葡萄糖的毫克数，即可求出酶的比活性。（上述方法制备的酶，其活性约每毫升20单位。）比活性(单位/mL)＝(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积)4． 蔗糖酶进程曲线的制作取200 mL 0.1 M的蔗糖溶液，在35℃水浴条件下恒温，加10 mL蔗糖酶溶液，每5分钟取出20 mL反应液加5滴5 M NaOH灭活后，测定一次体系的旋光度。求出葡萄糖的浓度，用葡萄糖的浓度对时间作图，得到蔗糖酶催化反应的进程曲线。
时间（分） 5 10 15 20 25 30 35 40
旋光度
葡萄糖浓度
5． 蔗糖酶米氏常数的测定用缓冲溶液稀释0.5 M的蔗糖溶液成为一系列不同浓度的蔗糖溶液各50 mL，在35℃恒温条件下加入10 mL已知活性的蔗糖酶，反应5分钟，加入1 mL 5 M NaOH溶液终止反应，测定此时溶液的旋光度，从而求出葡萄糖的生成速度V，根据米氏方程用反应速度V对（V/S）作图，直线的斜率-Km，直线的截距为Vmax，从而可以求出米氏常数Km。
加入蔗糖体积(mL) 蔗糖浓度（M） 起始旋光度 结束旋光度 葡萄糖浓度（M） 反应速度V(M/分) V/S
1 1.20 0.01
2 3.60 0.03
3 7.20 0.06
4 10.8 0.09
5 14.4 0.12
6 18.0 0.15
7 21.6 0.18
8 25.2 0.21
五、 数据处理1． 利用(3)中的数据计算酶的比活性。
2． 利用(4)中的数据作酶催化反应进程曲线。3． 利用(5)中的数据计算蔗糖酶米氏常数。六、参考文献[1] 沈同等，“生物化学”，上册，人民教育出版社，1980年版。[2] 复旦大学，“物理化学实验”，上册，人民教育出版社，1979年版。[3] 朱俭等，“生物化学实验”，上海科技出版社，1981年版。附录一直线直线方程一般可表示为：y＝a＋bx（1）式中y和x为由实验数据可确定的量；a和b为待定参数或函数。例如，对Arrhenius公式指数式，y和x分别为lnk和1/T；a和b分别为lnA和（－E/k）。对式[lnr=lnk＋nlnC]，y和x分别为lnr和lnC；a和b分别为lnk和n。由于有实验误差，用n对由实验确定的yi与xi值作y对x图时，一般说来，所得各点并不严格的在同一直线上，于是存在着这样的问题：应如何更合理地作出直线，从而更准确地求解a和b的值？应当指出，若直线选择不当（直线位置画的不当），不大的偏离，将可能导致a和b重大偏差。尤其是当试验测定的x区间范围相对较小时，外推至x＝0，将可使截距a产生较大的误差。例如依Arrhenius对数式以lnk对1/T作图，由实验测定的温度范围外推至1/T＝0，即T＝∞时，所选的直线斜率的较小的偏差将会引起截距lnA产生很大的偏差，致使指前因子A产生更大的偏差。怎样方能使直线位置选择（画）的得当呢？通俗地说，实测点（yi~xi）应均匀分布在直线两侧。严格的说，可采用下述“最小二乘法”确定最佳a、b值，作出最佳直线。若取得的数据实验值yi与xi（i=1、2、…n），一般来说，yi与a＋bxi值并不相等，令其误差为i，则i=yi―a―bxi线性回归，要求适当选择a与b之值，使各对元数据的偏差i之平方和之值为最小。即（2）（3）式中yi、bxi均为已知值。令与分别为yi与xi的平均值。则式（2）、（3）联立，可得（4）（5）由式（4）、（5）确定的a和b，称之为线性回归系数。用线性回归系数确定的直线方程y＝a＋bx，称为回归直线方程。其对应的直线，称为回归直线。
回归直线有下列性质1． 当x＝时，由式（1）、（5）可知y＝，即回归直线必通过（，）点。2． 由式（2）知，回归直线要求y的各次实验值yi与计算值a＋bxi偏差之总和为零，即各实验点均匀分布于回归直线的两侧。欲度量一组实测点与回归直线的相符程度，常引用所谓的相关系数“”作为定量指标，其定义为：（6）当||值在0～1之间，||值越接近于1，表明该组实测点与回归直线吻合性越好。当||=1时，表示所有的实测点均严格地落在回归直线上；||<0.482，则该组x、y间线性关系不明显，此时推求回归直线方程已无意义了。较精密的小型计算器一般配有直线方程的回归计算标准程序，使用十分方便。附录二酶催化反应一、 酶酶与其他催化剂不同，能在机体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，使生物体内的各种物质处于不断的新陈代谢之中。所以说，酶在生物体的生命活动中占有极为重要的地位，研究酶的化学性质及其作用机理，对于人们了解生命活动的规律，从而进一步指导有关的医学实践及工农业生产具有重大意义。酶的本质是蛋白质，酶是具有催化作用的蛋白质。酶蛋白主要由氨基酸组成，同其他蛋白质一样，具有两性电解质的性质，并具有一、二、三、四级结构，也受热、紫外线照射等物理因素及酸、碱、有机溶剂等化学因素的影响而变性或沉淀，丧失酶活性。酶的分子量也很大，其水溶液具有亲水胶体的性质，不能透析。在体外，酶能被胰蛋白酶等水解而失活。根据酶的组成，酶可以分成简单蛋白质和结合蛋白质两类。脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等属于简单蛋白质，其活性仅仅取决于它的蛋白质结构；另一类酶，其中的蛋白质部分——酶蛋白不具有活性，需要加入非蛋白的组分——辅助因子后，才表现出酶的活性，这就是结合蛋白质。酶蛋白与辅助因子结合后形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶就是以Cu+或Cu2+为辅助因子的全酶。在催化反应中，酶蛋白与辅助因子所起的作用不同，酶反应的专一性及高效率取决于酶蛋白本身，而辅助因子则直接对电子、原子或某些化学基团起传递作用。酶的辅助因子包括金属离子（Zn+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+等）及小分子复杂有机化合物。它们本身无催化作用，但参与氧化还原或运载酰基载体的作用。在大多数情况下，可以通过透析等方法将全酶中的辅助因子除去，这种与酶蛋白分子松弛结合的辅助因子称为辅酶。在少数情况下，有一些辅助因子以共价键和酶蛋白较牢固地结合在一起，难以透析除去，这种辅助因子称之为辅基。细胞色素氧化酶与铁卟啉辅基就结合的比较牢固。酶母提取物经透析除去辅酶I(Co I)后，便失去了催化葡萄糖发酵的能力。
根据酶蛋白分子的特点可将酶分为单体酶、寡聚酶和多酶体系。单体酶只有一个多肽链，分子量在1.3万到3.5万之间，一般是催化水解反应的多肽链。寡聚酶由几个甚至几十个亚基组成，亚基之间不是共价键结合，彼此很容易分开，分子量从3.5万到几百万，如磷酸化酶a。多酶体系是由几种酶彼此嵌合形成的复合体。多酶复合体的分子量一般都在几百万以上，它有利于一系列反应的连续进行，如在脂肪酸合成中的脂肪酶合成酶复合体。在酶促反应中被酶作用的物质称为酶的底物。根据酶促反应的性质可将酶分为六大类：1． 氧化还原酶类——催化氧化还原反应A·2H＋BA＋B·2H例如黄嘌呤׃氧化还原酶（习惯称为黄嘌呤氧化酶）2． 移换酶类——催化功能基团的转移反应AB＋CA＋BC例如丙氨酸׃酮戊二酸转移酶（习惯称为谷丙转氨酶或丙氨酸氨基转移酶）3． 水解酶类——催化水解反应AB＋HOHAOH＋BH这类酶包括淀粉酶、蛋白酶等。例如ATP磷酸水解酶：ATP＋H2OADP ＋ 正磷酸ATP是腺苷三磷酸（腺三磷），ADP腺苷二磷酸（腺二磷）。4． 裂合酶类——催化从底物上移去一个基团而留下双键的反应或其逆反应，这类酶包括水化酶、脱羧酶和脱氨酶等。5． 异构酶类——催化异构反应AB例如催化D、L互交，、互交的酶6． 合成酶——催化合成反应，催化一切必须与ATP分解相偶联，并由两种物质（双分子）合成一种物质的反应X＋Y＋ATPXY＋ADP＋Pi二、 酶的分离提纯及活性测定药物用酶、生化试剂用酶，对酶的纯度要求较高；对酶的物理化学性质和催化反应进行研究，亦需要纯度较高的酶或纯酶，所以必须对酶进行分离和提纯。生物体内的酶分为胞内酶和胞外酶两类。胞内细胞存在于细胞之内，必须使细胞破碎才能进行分离。胞外酶则容易分离，例如由动物胰液可分出各种蛋白酶和酯酶。因为酶是蛋白质，故可以用提纯蛋白质的方法来提纯酶。盐析法是最常用的，盐析沉淀的蛋白质保持其天然构象，能再溶解。用于盐析的中性盐以硫酸铵为最好，因为它在水中的溶解度很高（20℃，760g/L）且其温度系数较小。其他提纯方法还有调节pH、等电点沉淀、有机溶剂（乙醇、丙酮、异丙醇等）分级分离等。因为酶是生物活性物质，所以在提纯时必须要减少活性的损失，全部操作需在0～5℃低温下进行。用有机溶剂分级分离则在-15～-20℃进行。为防止重金属使酶失活，有时需在抽提溶剂中加入少量的EDTA螯合剂；为了防止酶蛋白－SH基被氧化失活，需要在抽提溶剂中加入少量的巯基乙醇；为避免产生大量泡沫使酶变性，在分离提纯过程中不能过度搅拌。
为进一步提纯得到纯度更高的酶制剂，常用磷酸钙凝胶吸附、离子交换纤维素分离、葡聚糖凝胶层析、离子交换－葡聚糖凝糖胶层析，凝胶电泳分离及亲和层析分离法。为便于保存，需将酶制品浓缩、结晶。有三种保存方法：1、保存浓缩的酶液：用硫酸铵沉淀或硫酸铵反透析法使酶浓缩，使用前再透析除去硫酸铵。2、冷冻干燥：对于已除去盐分的酶液可以先在低温结冻，再减压使水分升华，制成酶的干粉，保存于冰箱中。3、浓缩液加入等体积甘油，于-20℃保存。在分离提纯过程中，必须经常测定酶的比活性，以指导提纯工作的进行。酶活性的大小也称为酶活力，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活性的高低是研究酶的特性、进行酶制剂的生产及应用时的一项必不可少的指标。酶的活性的大小可以用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速度来表示。酶催化的反应速度愈大，酶的活性就愈高。所以测定酶的活性就是测定酶促反应的速度，这实质上就是酶的定量测定。酶反应速度可用单位时间内底物浓度的减少或产物浓度的增加来表示。以产物浓度C对反应时间t作图（见图1－1）。酶反应速度即为该曲线的斜率。图1-1 酶反应的速度曲线从酶反应的速率曲线可以看出，反应速度在开始一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。下降的原因是由于底物浓度的降低、酶在一定pH及温度下部分失活、产物对酶的抑制、产物浓度的增加而加速了逆反应的进行等。因此，研究酶的反应速度应以酶促反应的初速度为准。这时上述各种干扰因素尚未起作用，速度保持不变。在测定酶反应速度时，常常测定的是产物浓度的增加而不是底物浓度的减少。这是由于实验中，底物的浓度往往是过量的，反应时底物浓度的减小微乎其微，难以准确测定；而产物则从无到有，只要方法足够灵敏，其浓度就可以准确测定。酶活性的高低用酶活性单位来表示。酶含量可以用每克或每毫克酶制剂含有多少个活性单位来表示（单位/克或单位/毫克）。例如淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示，也可以用每小时催化1毫升2％可溶性淀粉液化所需要的酶量作为一个酶单位。
￥
5.9
百度文库VIP限时优惠现在开通,立享6亿+VIP内容
立即获取
实验一 酶催化蔗糖转化反应
实验一 酶催化蔗糖转化反应（~28学时）
一、 目的和要求
1． 用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定。
2． 了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定。
3． 学会米氏常数的测定。
二、 实验原理
蔗糖转化反应
蔗糖 ＋ 水 ——→ 葡萄糖 ＋ 果糖
第 1 页
这个反应在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的进行。蔗糖及其转化产物都有不对称的碳原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系在反应过程中旋光度的变化来描述反应进程。
溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度与反应物浓度C成线形关系，即
＝kC
作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为66.6；生成物的葡萄糖也是右旋性的物质，其比旋光度为52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为－91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质。因此，随着反应的进行，体系的右旋角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完全转化，这时体系的左旋角达到最大值。
制药企业在生产过程中，一般选用熔点低、挥发性好的有机溶剂，如甲醇，甲苯，正乙烷等，这些溶剂在使用过程中容易挥发，挥发的气体会造成有机废气污染。在发酵和干燥过程中，会产生大量的异味气体。发酵过程，生物制药厂会产生含氨废气。如果不进行处理和排放，将对车间员工和周围环境造成很大影响。制药企业在车间生产废气有几种工序，每道工序的特点如下：
1、进料：少量敏感物料采用真空泵送，大量敏感物料采用泵送或泵送至高位槽投料。
2、反应：溶剂冷凝回收后排出反应器排气口
3、溶剂回收：蒸馏釜排气口经冷凝回收后排放。如果采用真空蒸馏，则废气进入真空系统排放，回收的溶剂暂存在接收罐中
4、过滤、离心：采用开式离心机或开式过滤器，采用闭式离心机和过滤器卸料时，敏感物料直接暴露在空气中。
5、烘干：干燥废气进入缓冲罐后排放，敏感物质排放时直接暴露在空气中。
制药企业甲醇废气属于有机废气，但同时由于甲醇废气属于爆炸性气体，甲醇废气的处理方法有活性炭吸附法、燃烧法、UV光解法等。
1、活性炭吸附法
活性炭吸附法是一种常用的废气处理方法。吸附法是利用多孔活性炭、硅浴土、无烟煤等吸附有机气体分子到其表面，从而净化废气。
2、燃烧法
燃烧法分为直接燃烧法和催化燃烧法，主要用于高浓度VOCs废气的净化。对于不能自行燃烧的中低浓度尾气，通常需要助燃剂或加热，由于其热回收率高(大于95%)，从而起到了节能的效果
3、UV光解法
UV光解法是利用设备发出特制的高能UV紫外线光束，照射恶臭气体，使H2S、硫化物、VOC、苯、甲苯、二甲苯等分子链结构断裂，使有机或无机大分子恶臭化合物的分子链降解为低分子化合物，如在高能紫外光束照射下的二氧化碳、水等。利用高能紫外光束打破臭气中细菌的分子键，破坏细菌的核酸，进行臭氧氧化反应，达到彻底除臭杀菌的目的。感兴趣的朋友可以点击网页链接，了解更多详情。
一、隔离法：
隔离法是通过特殊的过滤材料，把废气隔离在外的一个过程，这种技术主要针对烟雾，没有技术要求，并且操作还特别简单，但是有一个缺点就是不能有效的去除有机物。
二、燃烧法：
这种处理技术顾名思义就是燃烧，利用高温将有机废气直接燃烧，这种处理方法净化率较高，几乎上可以完全处理掉有机废气，但是在燃烧时产生的氮氧化物等会对环境造成二次污染。
三、吸收法：
吸收法是利用吸收液充分的和废气接触，吸收液吸收废气中的有害物质，从而使废气得到净化，这种技术投资很小，但是处理效率较低，也有二次污染。
四、冷凝法：
是降低废气的温度，使废气中的有害物质转化为液态，从而从空气中分离出来，使其净化，这种处理净化效率高，但是投资较大，对于操作人员也有一定的要求，并且能量消耗也比较大。
不仅是上述的处理方法，还有其他的有机废气处理技术，例如等离低温催化氧化法、活性炭吸附装置吸附法等。
