乙酸乙酯碳谱出峰位置

这两者的氢谱差别蛮大的

丙酸甲酯，CH3(1)-CH2(2)-COO-CH3(3)，1号H大概在0.8-1.0ppm的化学位移，三重峰；2号H大概1.8-2.1ppm，四重峰；3号H大概3.78ppm左右，单峰。三者积分值比3:2:3

乙酸乙酯，CH3(1)-COO-CH2(2)-CH3(3)，1号H约在2.1ppm附近，单峰；2号氢大概3.9-4.1ppm，四重峰；3号氢约1.0-1.2ppm，三重峰。三者积分比3:2:3

简单的说，将0.8-1.2ppm附近的出峰积分值定为3，那么：

1.8-2.1ppm附近的氢为单峰，则是乙酸乙酯；若为四重峰，则是丙酸甲酯；积分值为3，则是乙酸乙酯；积分值为2，则是丙酸甲酯。

3.7-4.1ppm附近的氢为单峰，则是丙酸甲酯；若为四重峰，则是乙酸乙酯；积分值为3，则是丙酸甲酯；积分值为2，则是乙酸乙酯。

或者按照低场到高场的积分值顺序，3/2/3的就是丙酸甲酯；2/3/3的就是乙酸乙酯

如果你对氢谱了解足够深入，这两者在使用CDCl3作为溶剂时，3.778ppm出峰的就是丙酸甲酯——一般酯键的甲氧基都是出在这个位置

用乙酸乙酯做溶剂进行气质连用检测，可以用分析纯

乙酸乙酯可以。乙酸不建议用。

其实气相溶剂的范围很广，只要溶剂峰和溶剂中的杂质峰，与待测物质之间不干扰；而且待测物质在溶剂中的溶解度达到理想的效果就可以了。

比较常见的两个万能溶剂是DMSO和DMF，因为沸点高，不干扰，大多数有机物在这两种溶剂中的溶解度都还可以，所以比较常用。

但是乙酸不建议用，因为酸性比较大，对于柱子的填料可能会有一定的损害，从而减少寿命。尽量选择中性的有机溶剂。

恢复一根已受污染的高效液相色谱柱的关键在于了解污染物的性质，然后寻找一种合适的溶剂将其去除。如果污染物是由于一些强保留物质的多次进样积聚而产生，一个除去这些污染物的简单的冲洗过程往往会使色谱柱恢复性能。有时，在经过了等度操作之后，用20个柱体积的90％～100％的溶剂B（二元反相体系中较强的溶剂）将会除去这些污染物。（表二列出了各种型号的高效液相色谱柱的柱体积，所以读者可以很轻易地确定色谱柱的冲洗体积。）例如，脂质类的化合物可以使用一些非水性的溶剂来去除，如甲醇、乙睛、四氢呋喃。如果你正在使用含水的缓冲流动相，则千万不能将流动相直接跳到强溶剂中。将流动相猛然间改到高比例有机相的举动会导致高效液相色谱流动体系的缓冲沉淀，这将会造成更加严重的问题，如使筛板堵塞，接口管路堵塞，泵的密封垫失效，刮伤泵的柱塞杆，使进样阀转子失灵。相反，应使用非缓冲的流动相来冲洗色谱柱（就是用水来代替缓冲液）。在经过了5～10个柱体积的非缓冲溶剂冲洗之后才能允许较强的溶剂流经色谱柱。

有时，流动相中的强溶剂组分是不能充分去除色谱柱中的污染物的。必须另外使用一种更强的溶剂或一系列的溶剂才能清洗色谱柱。假如污染物是非生物性的，则使用者可以通过一种或更多的其他有机溶剂来去除不需要的化合物。可以使用许多种的溶剂和溶剂组合方式。访问一些色谱柱生产厂商的网站可以浏览到一些推荐使用的溶剂系统。

一般来说，所有的清洗都会遵循一个相似的模式。清洗过程中的溶剂浓度是增加的，通常最后都是使用一些非极性的溶剂（例如：乙酸乙酯，乃至碳氢化合物），它将会有助于溶解一些脂质类和油类化合物。重要的是要确保这一系列的每个溶剂都能与所使用的下一个溶剂互溶。一个清洗循环的结论是，在回到初始的流动相系统之前，可通过中间的可互溶的溶剂反向走。例如，异丙醇就是这个中间步骤的一个极好的溶剂，因为它能够同有机溶剂互溶，如正己烷和二氯甲烷，而且同样也能够和水相溶剂互溶。因为异丙醇有很大的粘度，所以必须确保清洗时流速不能太高，否则会引起泵的压力过载。同样，如果使用了紫外检测器，则需避免使用在紫外光谱区有吸收的溶剂，因为这样会需要大量的清洗溶剂才能去除所有吸收的溶剂以得到一个稳定的基线。对于典型的键合硅色谱柱和无缓冲液的流动相的一个推荐使用的清洗系统就是：

l100％甲醇；

l100％乙睛；

l75％乙睛——25％异丙醇；

l100％异丙醇；

l100％二氯甲烷；

l100％正己烷；

当使用了二氯甲烷或正己烷作为冲洗溶剂后，由于溶剂的不互溶性，需要先用异丙醇冲洗色谱柱，而后才能使用含水的流动相。冲洗色谱柱的清洗溶剂的体积最小为柱体积的十倍。对于一根250mm×4.6mm的色谱柱，分析者可以使用经典的1～2mL/min的高效液相色谱流量。为了要回到原来的流动相，色谱工作者可以跳过颠倒使用该系列的清洗溶剂。推荐使用异丙醇为中间的清洗溶剂，然后用不含缓冲液的流动相冲洗，最后再用最初使用的流动相进行冲洗。四氢呋喃是另一个使用广泛的溶剂，它可以被用来清洗受污染的色谱柱。如果使用者怀疑色谱柱受到了比较严重的污染，则可以用二甲亚砜或二甲基甲酰胺与水以50：50的比例，以小于0.5mL/min的流速进行清洗。成功的反向液相色谱柱的再生需要花费相当多的时间，使用溶剂进行冲洗可以设置梯度程序来进行通宵操作。*

在清洗过程中产生了是否应该将色谱柱颠倒过来冲洗的问题。因为大部分的强保留的污染物都会留在色谱柱的前端，将色谱柱颠倒过来清洗会减少已被溶解的污染物流出色谱柱的迁移距离。就填料层的稳定性而言，大部分的现代高效液相色谱柱都是用比普通操作压要高得多的压力装填的；因此，色谱柱的填料层应该不会受到反向的流速的干扰。然而，如果色谱柱顶端的筛板的空隙要比底部的来得大，这种反向的方式则是有害的。比如说，如果底部筛板的空隙为2µm，则足够容纳装填有平均填料粒径为5µm的色谱柱。（含有粒径5±2µm的尺寸分布）。然而生产商往往在色谱柱的顶端安装空隙度比较大的筛板，以防止其被样品或流动相颗粒所堵塞。如果这种筛板的空隙度要比粒径大小分布的最小微粒大，部分填料会经筛板而流出色谱柱，这样就会产生中空。如果色谱柱上有一个箭头来提醒色谱柱的流向，我觉得应该在反向使用色谱柱之前参考说明使用书，浏览生产商的网站，或与技术支持组进行商讨，以确定这是否是一个安全的举动。无论你是否将色谱柱反向使用，最好要将色谱柱同高效液相色谱检测器断开，使污染物或者颗粒留在筛板上而不流经检测池，因为这些物质会污染检测池。

清洗污染的反相色谱柱的频率依懒于有多少不明物质被注射到柱子中，因为反相色谱柱有时在分辨率损失和外来物质的洗脱前可以忍受大量的污染物, 使用者往往等到他们观察到一些异常现象才对柱子进行清洗。然而，长时间累积的污染物会使色谱柱的清洗工作变得更难。正因为如此，如果你知道自己的色谱柱很容易受到脏的样品基体的污染时，我建议定期清洗你的色谱柱。清洗的次数越多，清洗条件也就越简单。

反相硅胶基质色谱柱中残留蛋白质的清洗

如果一些如血浆、血清的生物物质留在了反相液相色谱柱上，色谱工作者必须使用一些不同的清洗程序。在大部分情况下，一些比较纯的有机试剂如乙睛或甲醇是不能溶解肽和蛋白质的，所以它们不能有效清洗反相液相色谱柱。然而加入了缓冲液、酸或者一些离子对试剂的混合有机溶剂能够有效清洗这些物质。起初，可以尝试含比较高浓度的溶剂B的流动相来冲洗色谱柱。

Freiser和他的同事（4）发现来回反复地梯度洗脱，使用三氟乙酸的水溶液和三氟乙酸—正丁醇可以使污染的反相液相色谱柱再生。Bhadway和Day（5）建议进样100µL的三氟乙醇到250mm×4.6mm色谱柱可以达到清洗的目的。如果这些方案都失败了的话，推荐使用Cunico和他的同事们（6）的强洗脱液和溶解性的试剂（见表三）。然而，在用这些试剂冲洗色谱柱之前，应该参考色谱柱的手册，或和生产商进行商议，以确保其不会破坏色谱柱的填料。硅键合色谱柱的填料往往能够与这些试剂共存，而聚合物色谱柱可能会因为与特定溶剂结合而使填料产生膨胀或收缩，从而影响到色谱柱的性能。

表三 用于HPLC反相色谱柱蛋白质物质除去的清洗溶剂

溶剂组成

乙酸1%的水溶液

三氟乙酸1%的水溶液

0.1%三氟乙酸-异丙醇40：60（V：V）（粘稠的，通常降低流速）

TEA-异丙醇40：60（V：V）（在三乙胺混合前用0.25N的磷酸调节pH到2.5）

尿素或胍的水溶液5-8M（调节pH到6-8）

NaCl，Na3PO4，Na2SO4水溶液0.5-1.0M (Na3PO4 pH 7.0)

DMSO-水 或 DMF-水50：50（V：V）

来自参考文献6。

如果使用了早期的一系列溶剂，则必须确保表三中的溶剂与这个系列中的溶剂都是互溶的。异丙醇是一个良好的中间冲洗溶剂。在体系中的清洗体积最少为20个柱体积。由于一些溶剂清洗系统具有一定的粘滞性，所以必须调整冲洗流速以避免产生超压。在清洗完一根含有胍和尿素的色谱柱后，需要用至少40～50柱体积的色谱级的水进行冲洗。

对于反相高效液相色谱柱来说使用一些如十二烷基磺酸钠（SDS）和Triton的清洗剂来清洗是不妥的，因为这些化合物会强烈地吸附在硅胶基质的表面而难以去除。这些试剂会影响填料表层，改变填料的性质。然而，分离小组的研究发现，肽合成过程中保护基团和净化剂产物对柱子的污染，可以通过在流动相中注射500µL的1％SDS溶液以1mL/min的流速进行冲洗（7）。如果接下来使用含0.1％(V/V)三氟乙酸的5％～95％乙睛的梯度，在开始的条件下进行平衡，多肽的分离效果则可恢复。

CH3COOCH2CH3，一共有三组氢，连C=O的甲基为甲峰，在2左右；连O的CH2在4左右，被相邻的甲基裂分为四重峰；最右边的甲基在1左右，被相邻的CH2裂分为三重峰。下面是标准图谱，标示很清楚了。

看你的试验方法了。主要是在你的试验方法下，溶剂峰和这些样品峰能分开就可以。

一般万能的溶剂二甲基亚砜（DMSO），和N,N-二甲基甲酰胺（DMF），应该都可以。这两种物质的沸点都在一百五往上，基本可以和你的样品分开。

如何科学有效地记录实验数据

在实验学科中，数据起着至关重要的作用，获得科学有效的数据是每个实验者所应具有的素质。在我们实验室近十年工作经验的基础上，结合其他实验室的经验，主要对旋光、核磁及对映体过量（ee值）等数据测定中应注意的事项加以列举。原则是：尽量第一时间收集齐必要数据，否则以后补充数据会花费许多不必要的时间和精力，如果是已知物要和文献数据加以对照。对未知化合物应该收集核磁共振氢谱和碳谱、高分辨质谱或者元素分析、熔点（如果是固体）、旋光（如果是手性化合物）和红外光谱等；对已知化合物应该收集核磁共振氢谱、熔点（如果是固体）和旋光（如果是手性化合物）等。在测试结束后，应及时、准确地将数据记录在实验记录本上（不要先抄写在一张小纸条上，然后再抄到实验记录本上，步骤越多，出错的可能性越大），以备查阅、撰写论文和在以后的研究工作中作为参考。

第一部分：测定旋光注意事项

得到产品后，要尽快测定其旋光（这里的旋光为比旋光度），不宜长时间放置后再测定。因为长时间放置可能会导致产品变质，再次测量时瓶子的质量也可能因为天平没有校正而发生变化，从而导致旋光值不准确。

2. 测定旋光前，如果是已知物要查明文献中报道的旋光值，最好多查几篇文献，因为许多文献的数值不一致，尽量选择权威论文的数据，包括浓度、温度、溶剂及旋光值。测定产品的旋光时，可以与文献值比较，做到心中有数。

3. 待测的产品在测量前一定要抽干，以保证称量质量的准确。

4. 配制待测产品溶液所用的溶剂最好用新开封的。因为已开封的溶剂在使用时可能被污染，会有杂质，造成测定数据不准确。

5. 配制的待测产品溶液的浓度要适中，不宜太高，也不宜太低，一般浓度为0.2-1.0（10

mg/mL-100

mg/mL）左右为好。

6. 配制的待测溶液时，产品在其中要全部溶解。若溶解后为浑浊液，应考虑使用溶解度更好的溶剂；若溶解后有小颗粒，证明产品中有杂质，必须先将产品进行处理，除去不溶性的杂质，再进行测定。

7. 测定旋光前最好用一个已知旋光值的物质作为标准，对所用旋光仪进行校准，以保证旋光仪测量数据的准确。

8. 开启旋光仪后需等一段时间再进行测量。因为旋光仪所用钠光灯的正常起辉时间至少20

分钟，之后发光才能稳定，这时测定才会比较准确。

9. 测定管光面两端的玻璃，在测量时不要用手触摸，以免玻璃被污染，影响光路，使测量不准确。如果不干净，用软布或专门的擦拭纸擦净，不要使用普通的纸，以免损伤玻璃面，影响光路。

10. 将装有待测溶液的测定管放入样品室之前，一定要确保光路中没有气泡，否则会对样品的旋光值有较大的影响。

11. 测定时应尽量固定测定管放置的位置和方向，做好标记，以减少测定管及盖玻片应力的误差，使测量数据更准确。

12. 测定旋光时一定要及时记录测定时的温度。因为温度对物质的旋光有一定影响，不同的温度下测定的旋光值可能有所差别。

13. 测定旋光时一定要及时记录所用的溶剂。因为在不同溶剂中，由于缔合、溶剂化和解离等情况的不同，会使比旋度产生变化，甚至改变旋光方向。具有1,3-丙二醇结构的氯霉素Chloramphenical，只有(1R,2R)-(-)-异构体才显示抗菌活性，其在无水乙醇中呈右旋性，比旋光度+18.5~+21.5，而在乙酸乙酯中呈左旋性，比旋光度为-25.5。

14. 测定结束后，将测定管洗净晾干放回原处。数据要立即写在记录本上，最好将文献中的旋光数据也写在记录本上，与所得数据加以对照。

第二部分：核磁测试注意事项

得到产品后，核磁共振要立即测，不宜长时间放置后再去测，因为长时间放置可能导致产品变质。其中一种极端情况是：长时间放置后产物会发生异构化，如反式异构体变为顺式异构体，或者发生重排反应等，从而导致测定的核磁共振数据不准确。

2. 实验室测试所用核磁管一般内径为5

mm，(微量样品用3 mm的样品管)氘代试剂溶解后的样品体积在核磁管中高度约3.5 cm，体积约0.5

mL，溶剂量太少会影响匀场，溶剂量过多则造成浪费。

3. 氢谱测试所需样品量较少，约3-7 mg，碳谱测试所需样品量较多，一般需要多于20

mg，测试氢谱时浓度太低则噪音较大、基线不平；浓度太高则谱峰裂分不好，请适当掌握；测试13C时浓度高可缩短测试时间，噪音小，基线平直，谱图漂亮。若1H、13C谱同时做，要保证管装样品量大于20

mg。

4. 为保证谱图质量，核磁管必须清洗干净，样品的纯度越高越好，其中残余溶剂必须除净，否则严重影响谱图的解析。样品在氘代试剂中溶解度要好（送样人要提前选好合适溶剂），溶解后溶液均匀透明，若有固体微粒必须首先过滤，否则仪器不能测试，并且样品中不得含顺磁性物质。

5. 核磁管要及时清洗，先加入对样品溶解性最好的溶剂冲洗，一般使用丙酮，清洗2-3次后，使用核磁管刷（末端绑上棉花）清洗，再用丙酮清洗干净。核磁管在干燥箱中最好不要平放，一定要多支捆绑在一起立着放，这样能保证核磁管在高温下不变形。

6. 有些样品在常温下两个构象异构体转化的能垒较高，不能迅速达到平衡，这时核磁共振谱图上会出现一些宽峰，甚至消失或不出现。这时如果把做核磁共振的温度提高，两种构象异构体异构体能迅速达到平衡（具体的例子，可参考：J.

Org. Chem. 2005, 70, 1679），这样就能得到正常的核磁共振谱图。

第三部分：对映体过量（ee值）测试注意事项

高效液相色谱测对映体过量（ee值）时，需要的样品量不多，但是需要消旋的样品作为对照，否则无法区分杂质与样品的峰值（尤其是ee值高时）。同时也要注意以下几个方面：

需要的样品量在色谱图上浓度在80-200

mAU之间为好，太少噪音峰容易造成干扰，太多可能会在柱上残留，信号峰强度最好不要超过500 mAU,

以防堵塞色谱柱。测试前可以在硅胶板上用毛细管点样用紫外灯显色后根据经验观察浓度是否合适。

2. 样品纯度要高，否则杂质可能会与目标峰完全重合或是部分重合，从而造成测定数据不准确，不能得到漂亮的色谱图；另外，若是样品中含有较多的杂质，特别是粉末状杂质，则会堵塞手性柱。因此，在配制样品时，应使样品完全溶解，或使用过滤器过滤得到澄清溶液。

3. 配置前样品中的残余溶剂要除净，防止因溶剂峰过高而不能得到漂亮的色谱图。溶解样品的溶剂最好选择和流动相相同的溶剂，或者是流动相中的溶解性较好的那种溶剂。

4. 配置样品时，要将样品完全溶解后，取一到两滴转移到专用的液相测量瓶中，再加入溶剂稀释到合适的浓度。对固体样品，一定要将样品完全溶解后配制，因为在固体样品中，各部分ee值可能不同（如外消旋化合物，一部分可能为100%

ee，另外一部分可能为0%

ee），这样可能造成数据重复性很差。所以对于固体样品，一定要将样品全部溶解后取适量于样品瓶中，再稀释到需要浓度。

5. 样品一般需要现场配制，长时间放置后容易变质。

6. 使用手性柱测定HPLC数据时，要注意柱压不要超过50

bar。如使用异丙醇/正己烷作为流动相时，溶剂体积比为90/10时，流速一般不超过1.0 mL/min, 为80/20时，流速一般不超过0.8 mL/min,

选择更大极性的流动性时，流速相应也要降低，以使柱压不超过50

bar.

7. 测定样品时，要注意流动相的体积变化，当少于总体积的20%时，应及时添加流动相，以防止体系中进入气体。

8. 测定后的数据要及时记录在实验记录本和专用的HPLC数据记录本上。

以上为根据经验所总结的测定旋光、核磁和ee值中所需要注意的事项，要获得科学的实验数据请参照上述经验进行操作。原则是：尽量第一时间收集齐所有的必要数据。对未知化合物应该收集核磁共振氢和碳谱、高分辨质谱或者元素分析、熔点（如果有）、旋光（如果有）和红外光谱等；对已知化合物应该收集核磁共振氢和碳谱、熔点和旋光（如果有）等。若有不足或不当之处，请指正。