盐酸胍是怎么生产的

包涵体染色的方法有哪些？原理是什么

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包涵体染色的方法有哪些？原理是什么

蛋白包涵体-溶解原理及方法2009年03月15日；维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，；1.遵循标准；包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤；(1)快速溶解的动力学；；(2)与蛋白质的结合是可逆的；；(3)对细胞碎片的分离方法没有干扰作用；；(4)对温度没有依赖作用；；(5)抑制蛋白质酶的降解作用；；(6)与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；；

维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，这种作用力也维持天然蛋白质的稳定性的结构。先前有报道这种作用力是共价键结合的，但是，现在趋向于一致，就是维持包涵体内部的蛋白质的紧密的结构的是非共价键的作用力。二硫键，无论是正确的还是错误的二硫键，在维持内部蛋白质的紧密的结构中都没有发挥直接的作用。最经常的获得活性蛋白质的第一步是溶解这些包涵体蛋白质，溶解液是使这些包涵体蛋白质完全变性的成分，当蛋白质被溶解以后，则进入到蛋白质的体外折叠的过程。

1. 遵循标准

包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤。溶剂的选择会影响后续的操作、最终的各种蛋白质的收率以及最终的成本，必须遵循以下的标准：

(1) 快速溶解的动力学；

(2) 与蛋白质的结合是可逆的；

(3) 对细胞碎片的分离方法没有干扰作用；

(4) 对温度没有依赖作用；

(5) 抑制蛋白质酶的降解作用；

(6) 与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；

(7) 在可能的情况下，选择最低的溶解浓度和廉价的溶剂，并适于以后的复性方法。

2. 溶解包涵体的试剂

最经常使用溶解包涵体的试剂包括离液剂或者去垢剂。

最经常使用的溶解和制备蛋白质的离子型的离液剂最早于1969年Hatefi等人发展的离子型的去垢剂如SDS是另外一种溶解包涵体蛋白质和膜蛋白质的试剂，但是一般不用来大规模的生产，而是用来定性。除了强酸、强碱和利用有机溶剂来提取疏水性很强的蛋白质以外，其他的变性方法如非可逆的共价修饰在工业的大规模生产中很少用到。一旦蛋白质被溶解，蛋白质中的巯基很容易快速地氧化并形成共价的聚集体或者分子内错配的二硫键，然后这些蛋白质就不能再进行折叠。为了防止氧化，可以使这些基团或者利用缓冲液中含有低分子量的疏基试剂保持在还原的状态或形成磺酸盐或者形成混合的二硫键。

（1）去垢剂

去垢剂是一种最经济的溶解包涵体蛋白质的方法，一个最大的优点是溶解的蛋白质有可能保持全部的生物活性，说明在此条件下保持了蛋白质的四级结构。最重要的是稀释以后蛋白质的聚集比其它溶剂生成的很

少。阳离子型、阴离子型的和非离子型的去垢剂都可以使用，使用时的浓度一般高于去垢剂的临界胶束浓度（CMC ），通常是0.5-5%。

SDS仅仅在大量生产牛生长激素、干扰素和白介素-2中用到。SDS由于具有较低的临界胶束浓度（CMC）而使得结合到蛋白质分子上的SDS比较难于除去。由于N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用来溶解包涵体蛋白质并可用稀释的方法使蛋白质复性，残余的去垢剂可以使用阴离子交换色谱或者超滤的方法除去。这种去垢剂是一种比较温和的去垢剂，可以选择性地溶解一些包涵体，但是不能溶解完全的变性的蛋白质的聚集体和大肠杆菌的内膜的蛋白质分子。使用去垢剂一个主要的缺点是对以后的纯化和复性的步骤的干扰，去垢剂结合到蛋白质上的强度大离子交换色谱复性蛋白质小不同，比较难于除去，并干扰离子交换和疏水相互作用色谱的过程，在变性的浓度时超滤膜会吸附这些变性剂。所以复性后需要尽量洗涤这些去垢剂，也可以使用环状糊精链状糊精或者环状淀粉从复性缓冲液中提取去垢剂。

一个不容忽视的问题是去垢剂可以溶解全部的膜蛋白质中的蛋白质酶，这些蛋白质酶的活性在去垢剂的存在的情况下被活化，可能造成溶解和复性过程的收率的降低。蛋白质复性的收率可以通过以下的方法来提高： a) 先期使用可以溶解膜蛋白质但是不溶解包涵体蛋白质的溶剂尽量洗涤包涵体蛋白质；

b) 包涵体的含有的菌体碎片被完全除去；

c) 溶解包涵体的液体中含有蛋白质酶的抑制剂，如EDTA，苯甲基磺酰氟（PMSF ）等 。

（2）离液剂

其它的离液剂也被用来溶解包涵体蛋白质，最主要的溶解包涵体蛋白质的离液剂是盐酸胍和尿素，这是最经常使用的溶解试剂，一般情况下选择6-8mo1/L的浓度，蛋白质浓度在1-10mg/mL。

在溶解色氨酸合成酶A的过程，发现阳离子的溶解能力顺序是Gdm+ >Li+ >K+ >Na+，阴离子的顺序是SCN- >I- >Br- >Cr-。一些离液剂由于它们的溶液比盐酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不适合用于溶解包涵体，因为利用离心和色谱分离起来比较困难。

为了溶解包涵体蛋白质需要的尿素或者盐酸胍的浓度根据蛋白质的不同而不同。如果蛋白质天然形态需要溶解的变性剂的浓度不能获得，则在溶解包涵体时需要首先确定离液剂的浓度。

盐酸胍由于比较贵，所以一般用来溶解一些附加值比较高的药物蛋白质分子，选择盐酸胍作为溶解试剂，是因为盐酸胍是一种比脲更为强烈的变性剂，甚至可以溶解脲所不能溶解的包涵体；尿素，由于可能被自发的形成的氰酸盐或者已有的氰酸盐的污染，特别是在碱性环境中，从而造成蛋白质的自由的氨基被不可逆的修饰。消除此种影响的方法是用阴离子的缓冲系统如Tris-HCl溶解脲或者脲在使用之前利用阴离子交换色谱纯化，并且配制的溶解和复性的缓冲液在当天使用。脲溶液中影响蛋白质变性的因素与盐酸胍的不同。溶在脲中的蛋白质受到pH和离子强度的影响，从而影响电荷的蛋白质残基之间的电荷作用，但是由于盐酸胍含有高浓度的离子强度，所以这两个因素的影响很少。

（3）混合溶剂

一般情况下去垢剂并不联合使用，Lilly等人发现去垢剂和尿素的混合液有效的摩尔浓度较低。尿素和去垢

剂型的盐混合可以使蛋白质变性，但是尿素和非去垢剂的盐如氯化钠反而降低包涵体蛋白质的溶解性，所以要避免使用。

去垢剂结合其他的试剂或者溶解增强剂也被使用，发现尿素和乙酸，尿素和二甲亚枫，尿素和高pH等是比较有效的溶解包涵体蛋白质的方法。

高压（1-2kbar）、超声也可以溶解包涵体蛋白质，此时使用的溶解试剂浓度可以比较低，便于后续的复性步骤。

3. 极端pH

酸碱度也是比较廉价的有效的溶解包涵体的方法。最经常使用酸的是有机酸，浓度在5-80%之间。Gavif和Better使用低的（pH≤2.6）和高温（85℃ ）溶解抗真菌的重组蛋白质的肤段，低温和高PH需要溶解时间要长。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一种麦芽糖结合的蛋白质。但是，同样的一些不可逆的修饰作用或者酸降解会在极端pH下发生，所以此种方法并不是经常使用的溶解包涵体的方法。

高pH（≥12）也被用来溶解生长激素和原胰岛素。在高pH下一些蛋白质同样可能发生非可逆的变性，原因在于半胱氨酸在碱性条件下的脱硫过程。所以这种方法尽管比较简单、廉价，同样仅仅用于一些特定的蛋白质，特别对于药用蛋白质一般不采用这种方法。

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摘要 基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达量高，往往形成无生物活性的包涵体。包涵体必须经过变性和复性的过程才能获得有活性的重组蛋白。如何提高基因重组蛋白质的复性率，是生物工程技术的一个研究热点。对近年来的重组蛋白质的复性方法做一评述，为研究蛋白质折叠以及复性技术的进一步应用提供依据。

关键词 重组蛋白 包涵体 复性 二硫键

到目前为止，人们表达的重组蛋白质已有4000多种，其中用E.coli表达的蛋白质要占90%以上，尽管基因重组技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，然而人们在分离纯化时却遇到了意想不到的困难，即这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包涵体形式存在，重组蛋白不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1~3.0μm的固体颗粒[1]。自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来，人们就一直期望得到高活性、高产量的重组蛋白。不可溶、无生物活性的包涵体必须经过变性、复性才能获得天然结构以及生物活性，因此应该选择一个合适的复性过程来实现蛋白质的正确折叠，获得生物活性，近年来的研究可以使复杂的疏水蛋白、多结构域蛋白、寡聚蛋白、含二硫键蛋白在体外成功复性。

包涵体形成的原因

重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是原核表达体系或真核表达体系甚至高等真核表达体系，都会形成包涵体[2]。主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的[3]。

1、 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2、 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。

3、 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4、 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

5、 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。

减少包涵体形成的策略

1、 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成[4]。

2、 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。

3、 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。

包涵体的分离及溶解

对于生物制药工业来说，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏。由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离，接着，包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解[6、7、8]。

包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS[7]，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸[9]，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子与还原状态的巯基发生氧化反应[10]。

蛋白质的折叠机理

包涵体蛋白在变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳

状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构[11]。然而在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争[1]。对于蛋白质的折叠机制，目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构，总之，蛋白质的具体步骤可用下式描述[12、13、14]：

伸展态→中间体→后期中间体→天然态体→聚集体

在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠；一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。

提高重组蛋白质折叠复性的方法

一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少[15]。

1、 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大[16]。

2、 高蛋白浓度下的复性方法：一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中[17]。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略[4]。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行[18]，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。

3、 添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：a、共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；c、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率[19]；d、小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。f、添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定

1、机械破碎

2、超声破碎

3、化学方法破碎 可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。

变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

复性中常采用

稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

柱上复性：是研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。 还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。

常用的氧化方法有：

空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。

氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG，如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1）。 1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。

2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。

3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。

4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。

5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。

6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。

7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。

8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。

当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。 根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。

1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。

4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。 1、MHCⅡ JBC 269(47）：1994

增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.

复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.

2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.

复性：10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。

3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270⑴：1990 四对二硫键。

增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.

复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。 一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond<5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。

当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。

从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。 1. 真核细胞表达外源蛋白质的缺点

一些蛋白质需要翻译后的修饰，如糖基化，则必须选用真核细胞。但是无论是正在临床的还是市场上的蛋白质药物，主要的是以大肠杆菌作为宿主细胞。

1982年第一次选用大肠杆菌作为表达重组DNA的宿主细胞，表达的产物是人胰岛素。选择原核细胞作为表达载体，因为真核细胞表达外源蛋白质有其缺点：⑴真核细胞的天然蛋白质的表达和外源蛋白质的表达，表达量相当少，即使有的蛋白质表达量高时，容易出现蛋白质的无活性的现象，或者形成聚集体；而原核细胞表达的蛋白质量比真核细胞大很多；

⑵相对于大肠杆菌，人类对于真核细胞的基因的了解还是有限的，而对大肠杆菌的基因了解的相当透彻，并能进行熟练的基因重组等操作对大肠杆菌的基因进行改造；

⑶真核细胞生长到高密度需要更长的时间（7天左右），并且细胞的最终浓度低，所以需要较大的培养容器，而大肠杆菌可以在几个h以内达到108cells/mL；

⑷动物细胞生长的培养液的造价较高，并且大部分使用血清作为生长液的添加剂，从而提高了产品的造价并且不利于以后的纯化步骤；

⑸原核细胞的坚硬的细胞壁，可以使用简单的搅拌的方法完成传热、传质过程，而大部分的真核细胞需要温和的培养方法及复杂的操作以达到其对培养基的要求。

基于以上的原因，真核细胞尤其是哺乳动物细胞表达外源蛋白质大部分处在研究阶段，大部分重组蛋白质使用的表达载体是大肠杆菌细胞。大肠杆菌表达的外源蛋白质量相当大，有时达到细胞内蛋白质总量的5-20%，甚至达到50%以上。但是，大肠杆菌表达的蛋白质，当含量相当大时，有时由于原核细胞缺少分泌到胞外的机制或者折叠的机制，最后表达的蛋白质往往以无活性的包涵体的形式存在。

2. 包涵体表达蛋白质的优越性

为了研究基因的功能，可以把体内的基因转移到其他表达宿主中，研究基因表达性状以确定基因的功能。但是，外源基因的表达，特别是真核生物基因在大肠杆菌中的表达，由于宿主菌缺乏此种基因表达的调控机制，细胞内的化学环境与其天然环境差异，如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度，以及外源基因的导入，使得表达目的蛋白质的细胞在非正常状态下生长，表达的蛋白质多数以无活性的包涵体的形式存在。

在下游生产过程中特别是在医药生产中，以包涵体形式表达的蛋白质具有一些优越性。

⑴ 异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解，如果重组蛋白质以包涵体形式表达，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击；

⑵ 包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质的失活问题；

⑶ 包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离；

⑷ 有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达；

⑸ 对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性，含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率，不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。

包涵体的形成和蛋白质在等电点或者高盐情况下的沉淀是不同的。在沉淀过程中，分子是通过分子表面的相互作用而形成的分子的聚集，无论在聚集的沉淀状态还是在天然状态，没有明显的构象的变化。因此，当溶液中的pH重新改变，或者沉淀重新溶解的时候，蛋白质的结构和活性会重新获得。蛋白质的包涵体形式的聚集则不同于蛋白质的沉淀，把包涵体蛋白质直接溶解在天然的缓冲液中得不到天然的构象，无活性的聚集体与其天然活性形式之间没有自然的平衡转化的过程。包涵体的形成是由于范氏引力、疏水作用力和二硫键等作用力形成的，破坏这些作用力比较困难，溶解包涵体需要加入强的变性剂破坏多肽链之间的作用力，说明聚集体的多肽链之间的作用力远远大于普通的沉淀的分子间的作用力。当变性剂溶解的包涵体只是简单地通过稀释或者透析除去变性剂，而不是寻找合适的复性的条件的话，聚集体会重新形成，并且，不同于沉淀溶解的100%的活性的保留，包涵体的复性水平往往很低。所以，蛋白质沉淀是活性的天然蛋白质之间的作用力形成的，而包涵体的形成是在细胞内新合成的蛋白质肽链中间体而形成的，体外折叠时的聚集体是折叠过程中折叠中间体形成的。这些折叠的中间体并不一定是形成高级天然结构的中间体，从天然结构也不能推论出折叠中间体的构象。

(功能主治)泌尿系统疾病、生殖器感染、支原体衣原体

引起的非淋菌性尿道炎、尿频、尿急、尿痛、前列腺炎、

淋病、梅毒、病毒性湿疹、尖锐湿疣、盆腔炎、宫颈炎、

附件炎、阴道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、肺炎、胆道、肠

道等感

(规格)0．25g／粒X12粒X4盒。

盐酸胍甲环素胶囊

性质

化学药品/抗菌药与抗病毒药

编辑本段药品名称

中文名称：胍甲环素胶囊

编辑本段药品成分

本品含盐酸胍哌甲基四环素，以盐酸四环素（C2 2H24N2O8·HCl）计，应为标示量的90.0%～120.0%。

编辑本段药品信息

【性状】本品内容物为黄色粉末。 【鉴别】取本品的内容物，照盐酸胍甲环素项下的鉴别试验，呈相同的结果。 【检查】盐酸哌嗪双胍 照高效液相色谱法（中国药典2000年版二部附录V D）测定。 色谱条件与系统适用性试验、对照品溶液、供试品溶液的制备与测定 均照含量测定项下要求和方法测定。 含盐酸哌嗪双胍与盐酸四环素的比值应为0.32～0.57。 有关物质 取装差异项下内容物，混合均匀，精密称取适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并制成每1ml中含0.06mg和3.0mg的溶液。滤过，取续滤液，照盐酸胍甲环素有关物质项下试验，含4-差向四环素、差向脱水四环素、脱水四环素分别不得过8.0%、1.0%、1.0%。 溶出度 取本品，照溶出度测定法（中国药典2000年版二部附录XC第二法），以0.1mol/L盐酸溶液900ml为溶剂，转速为每分钟100转，依法操作，60分钟时，取溶液适量，滤过，精密量取续滤液2ml至2.5ml量瓶中；用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度；另精密称取盐酸四环素对照品适量，以0.1mol/L盐酸溶液为溶剂制成0.01mg/ml的溶液，作为对照品溶液。取上述两种溶液照分光光度法（中国药典2000年版二部附录ⅣA），在357nm的波长处分别测定吸收度，按二者吸收度的比值计算每粒的溶出量。限度为75%，应符合规定。 干燥失重 取本品内容物，于105℃干燥4小时，减失重量不得过0.5%（中国药典2000年版二部附录ⅧL）。 其它 应符合胶囊剂项下有关的各项规定（中国药典2000年版二部附录IE）。 【含量测定】取装量差异项下内容物，混合均匀，精密称取适量（约相当于盐酸四环素35mg）置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，滤过；取续滤液，照盐酸胍甲环素项下的方法测定。 【类别】同盐酸胍甲环素 【规格】0.1g（按C22H24N2O8·HCl计算） 【贮藏】密封，在干燥凉暗处保存。 【有效期】暂定2年 曾用名：盐酸胍哌甲基四环素胶囊

氨酚待因片

【药品名称】 通用名：氨酚待因片（Ⅰ） 英文名：Paracetamol and Codeine Phosphate Tablets (Ⅰ) 汉语拼音：Anfendɑiyin Piɑn (Ⅰ) 不良反应和注意：偶有头晕、口干、恶心、嗜睡。 规格：片剂：每片含氨酚500mg，磷酸可待因8.4mg。 生产厂家： 是否医保用药：医保 是否非处方药：处方 其它：肾功能不全者及儿童慎用。 氨酚待因片(Ⅰ) 本品为复方制剂，其组分为：每片含对乙酰氨基酚（C8H9NO2）500mg，含磷酸可待因（C18H21NO3·H3PO4·3/2H2O）8.4mg。 【性状】 本品为白色片。 【规格】 【贮藏】 遮光，密封保存。

编辑本段功能主治

用于各种术后疼痛、牙痛、感冒所致头痛及全身痛、软组织损伤痛及痛经。还有镇咳作用。

编辑本段药理毒理

磷酸可待因为吗啡的甲基衍生物，对延脑的咳嗽中枢有直接抑制作用，镇咳作用强而迅速，强度约为吗啡的1/4。此外，还有镇痛和镇静作用，镇痛作用强度约为吗啡的1/10，但仍强于一般解热镇痛药。系中枢型弱阿片类镇痛药。服用本品，有可能出现消化道反应，呼吸抑制很弱，成瘾性较低。两药合并给药具有镇痛协同作用，同时又仍能发挥各自原有的作用。

编辑本段药代动力学

本品中的对乙酰氨基酚口服经胃肠道吸收迅速、完全，在体液中分布均匀，血药浓度0.5～1小时达到高峰，T1/2约为2～3小时。肾功能不全时不变，但超量用药、某些肝病患者、老年人和新生儿可有延长，儿童则缩短。约25%与血浆蛋白结合，小量时（血药浓度＜60mg/ml）与蛋白结合不明显，大量或中毒剂量则结合率较高，可达43%。90%～95%在肝脏代谢，60%以葡萄糖醛酸化合物，35%以硫酸盐化合物的形式迅速从尿中排出，中间代谢产物对肝脏有毒性，对肾脏可能也有毒性。不到5%以原形由尿排出。磷酸可待因口服后较易被胃肠道吸收，生物利用度为40%～70%，在体内主要分布于实质性器官，如肺、肝、肾、胰脏。蛋白结合率为25%左右。其可透过血-脑脊液屏障，但脑组织内的浓度相对较低；能透过胎盘，可少量由乳汁分泌。口服用药后30～45分钟起效，1小时左右血药浓度达峰值，作用维持约4小时。其在体内主要由肝脏代谢，大部分转化为可待因-6-葡萄糖醛酸，另外约有10%脱甲基而转化为吗啡，然后与葡萄糖醛酸结合，代谢物主要经尿排泄。

编辑本段适应症

本品为中等强度镇痛药。适用于各种手术后疼痛、骨折、中度癌症疼痛、骨关节疼痛、牙痛、头痛、神经痛、全身痛、软组织损伤及痛经等。

编辑本段用法用量

口服：成人，一次1～2片，一日3次；中度癌症疼痛一次2片，一日3次。7～12岁儿童一次1/2～1片，一日3次（一日不超过2～4片）。

编辑本段不良反应

（1）服用常用剂量时，偶有头晕、出汗、恶心、嗜睡等反应，停药后可自行消失。 （2）本品引起依赖性的倾向较其他吗啡类药为弱，但反复给药可产生耐受性，久用有成瘾性。 【禁忌】 （1）对本品过敏者，呼吸抑制及有呼吸道梗阻性疾病，尤其是哮喘发作的患者应禁用。 （2）多痰患者禁用，以防因抑制咳嗽反射，使大量痰液阻塞呼吸道，继发感染而加重病情。

编辑本段临床研究

【功效主治】 本品为中等强度镇痛药。适用于各种手术后疼痛、骨折、中度癌症疼痛、 骨关节疼痛、牙痛、头痛、神经痛、全身痛、软组织损伤及痛经等。 【化学成分】 本品为复方制剂，其组分为：每片含对乙酰氨基酚（C8H9NO2）500mg，含磷酸可待（C18H21NO3·H3PO4·3/2H2O）8.4mg。 【药理作用】 本品有镇痛作用，并有一定的解热、镇咳作用。两药通过不同的作用机制而发挥镇痛效果。对乙酰氨基酚成分主要通过抑制前列腺素的合成（抑制前列腺素合成酶）及阻断痛觉神经末梢的冲动而产生镇痛作用，后者可能与抑制前列腺素或其他能使痛觉受体敏感的物质（如5-羟色胺、缓激肽等）的合成有关。解热作用是通过下视丘体温调节中枢产生周围血管扩张，通过增加皮肤的血流、出汗及热散失而起作用。磷酸可待因为吗啡的甲基衍生物，对延脑的咳嗽中枢有直接抑制作用，镇咳作用强而迅速，强度约为吗啡的1/4。此外，还有镇痛和镇静作用，镇痛作用强度约为吗啡的1/10，但仍强于一般解热镇痛药。系中枢型弱阿片类镇痛药。服用本品，有可能出现消化道反应，呼吸抑制很弱，成瘾性较低。两药合并给药具有镇痛协同作用，同时又仍能发挥各自原有的作用。 【药物相互作用】 1．本品与抗胆碱药合用时，可加重便秘或尿潴留的症状。 2．与美沙酮或其他吗啡类药、肌松药合用时，可加重呼吸抑制作用。 【不良反应】 1．服用常用剂量时，偶有头晕、出汗、恶心、嗜睡等反应，停药后可自行消失。 2．本品引起依赖性的倾向较其他吗啡类药为弱，但反复给药可产生耐受性，久用有成瘾性。 【禁忌症】 1 对本品过敏者，呼吸抑制及有呼吸道梗阻性疾病，尤其是哮喘发作的患者应禁用。 2 多痰患者禁用，以防因抑制咳嗽反射，使大量痰液阻塞呼吸道，继发感染而加重病情。

编辑本段注意事项

（1）本品为国家特殊管理的第二类精神药品，必须严格遵守国家对精神药品的管理条例，按规定开写精神药品处方和供应、管理本类药品，防止滥用。 （2）不明原因的急腹症、腹泻，应用本品后可能掩盖真相造成误诊，故应慎重。 （3）下列情况慎用：乙醇中毒、肝病或病毒性肝炎，肾功能不全，支气管哮喘胆结石，颅脑外伤或颅内病变，前列腺肥大等。 （4）长期大量应用本品时，特别是肝功能异常者，应定期测定肝功能及血象。 （5）连续使用一般不超过二周，如有必要较长期连续用药时，应遵医嘱。 （6）参阅对乙酰氨基酚与可待因项下的注意事项。 【孕妇及哺乳期妇女用药】 （1）本品所含两主药均可透过胎盘而影响胎儿，如使胎儿成瘾，引起新生儿的戒断症状等。 （2）本品所含两主药均可自乳汁排出，哺乳期妇女及孕妇应慎用。 【儿童用药】 7岁以下儿童不宜使用。 【老年患者用药】 慎用。 【药物相互作用】 （1）本品与抗胆碱药合用时，可加重便秘或尿潴留的症状。 （2）与美沙酮或其他吗啡类药、肌松药合用时，可加重呼吸抑制作用。

编辑本段药物过量

（1）逾量服用本品时，可很快出现由对乙酰氨基酚和可待因所致的严重副反应，如腹泻、多汗、肝损害、肝性脑病、抽搐、凝血障碍、胃肠道出血、低血糖、酸中毒、心律失常、肾小管坏死、嗜睡、精神错乱、瞳孔缩小如针尖、癫痫、低血压、神志不清、呼吸抑制、循环衰竭，并可致死。 （2）中毒解救：服药过量可洗胃或催吐以排除胃中药物。给予拮抗剂N-乙酰半胱氨酸，不宜给活性炭，以防止影响拮抗剂的吸收，保持呼吸道通畅，必要时人工呼吸，静脉注射纳洛酮拮抗可待因中毒。（参阅对乙酰氨基酚及可待因项下的中毒解救方法）。

编辑本段2010版中国药典修订内容

氨酚待因片（I）质量标准草案（修订后完整版） 氨酚待因片（I） Anfen Daiyin Pian（I） Paracetamol and Codeine Phosphate Tablets（I） 本品每片中含对乙酰氨基酚（C8H9NO2）应为475～525mg，含磷酸可待因（C18H21NO3·H3PO4· H2O）应为7.56～9.24mg。 【处方】 对乙酰氨基酚 500g 磷酸可待因 8.4g 辅料 适量 制成 1000片 【性状】 本品为白色片。 【鉴别】 （1）取本品的细粉约0.1g，加水10ml，振摇使对乙酰氨基酚溶解，滤过，滤液中加三氯化铁试液，即显蓝紫色。 （2）取本品的细粉约0.1g，加稀盐酸5ml，置水浴上加热30分钟，放冷，取该溶液0.5ml，滴加亚硝酸钠试液5滴，摇匀，加3ml水稀释后，加碱性β-萘酚试液2ml，振摇即显红色。 （3）取本品的细粉约0.5g，加水5ml，振摇使磷酸可待因溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，滴加氨试液使成碱性，加三氯甲烷10ml，振摇，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣中甲含亚硝酸2.5mg的硫酸0.5ml，立即显绿色，渐变成蓝色。 （4）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液两主峰的保留时间应与对照品溶液相应两主峰的保留时间一致。 【检查】 含量均匀度 磷酸可待因 取本品1片，在乳钵中研细，加水分次转移至250ml量瓶中，照含量测定项下方法自“加水200ml，”起，依法测定含量，应符合规定（附录X E）。 溶出度 取本品，照溶出度测定法（附录X C第一法），以水900ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作。经30分钟时，取溶液适量，滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。另精密称取含量测定项下对照品溶液5ml，置10ml量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，照含量测定项下方法测定，计算每片的溶出量。限度均为标示量的80%，应符合规定。 其他 应符合片剂项下有关的各项规定（附录I A）。 【含量测定】 照高效液相色谱法（附录V D）测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇-四氢呋喃（800：100：37.5）为流动相，用磷酸调节pH值至4.0；检测波长为280nm。理论板数按磷酸可待因峰计不小于2000。磷酸可待因峰与对乙酰氨基酚峰的分离度应符合规定。 测定法 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于磷酸可待因8.4mg），置250ml量瓶中，加水200ml，超声处理使磷酸可待因与对乙酰氨基酚溶解，放至室温，用水稀释至刻度，摇匀，滤膜滤过，精密量取续滤液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取磷酸可待因对照品与对乙酰氨基酚对照品适量，精密称定，用水溶液并定量稀释制成每1ml中约含磷酸可待因0.03mg和对乙酰氨基酚2mg的溶液，同法测定。按外标法以各自峰面积计算，即得。在计算磷酸可待因含量时，应乘以1.068。 【类别】镇痛药。 【贮藏】遮光，密封保存。

植物蛋白肉的加工分为三个步骤：选择蛋白质来源、隔离分离，和挤出。从所选豆类的蛋白中分离出原始蛋白；通过挤压蒸煮过程中使用高温度水分和压力对蛋白进行形状重塑，形成植物蛋白。植物血红素含铁，在与氧气接触后不仅颜色会变成红色，口感十分接近动物肉。

大豆蛋白

优势：成本低廉，常见易获得；完全蛋白质（含人体必需的8种氨基酸）；拉丝蛋白更有弹性，凝胶乳化性强。

劣势：豆腥味需要改良；含植物雌激素，是潜在过敏原。

大豆蛋白是最常见的植物肉原料之一，是一种完全蛋白质，包含了人体所需的必需氨基酸

豌豆蛋白

优势：低致敏，无植物雌激素

劣势：口味需要改良；成本高于大豆，产能普遍低于大豆；组织蛋白无丝感；尤其适用于乳化肉糜类和粗绞类肉制品的加工。

豌豆蛋白也是主流的植物肉蛋白原料，是低致敏食品，其含有的支链氨基酸对缓解疲劳、肌肉恢复都很重要。

小麦蛋白

优势：成本相对低廉，易于获得

劣势：麦麸是潜在过敏原

小麦蛋白也是常用蛋白原料之一，主要是由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，而小麦面筋中主要含有麦醇溶蛋白和麦谷蛋白[5]。用量1%～5%的小麦面筋作为黏合剂使用在重组化肉制品中，能增加产品的黏弹性和硬度，提高色泽稳定性、出汁率和保水性。

绿豆蛋白

优势：低过敏原，无植物雌激素，具有胶凝和乳化特性

劣势：成本高于大豆

绿豆属于高蛋白植物，蛋白含量达25-28%，以球蛋白和白蛋白含量最多，且白蛋白的氨基酸模式与人体接近。别样肉客的植物牛肉中除了主要成分豌豆蛋白，也包含绿豆蛋白。此外，绿豆有多种与鸡蛋相同的氨基酸，具有胶凝和乳化特性

含蛋白质多的食物包括：牲畜的奶，如牛奶、羊奶、马奶等；畜肉，如牛、羊、猪肉等；禽肉，如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸵鸟等；蛋类，如鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋等及鱼、虾、蟹等；还有大豆类，包括黄豆、大青豆和黑豆等，其中以黄豆的营养价值最高，它是婴幼儿食品中优质的蛋白质来源；此外像芝麻、瓜子、核桃、杏仁、松子等干果类的蛋白质的含量均较高。由于各种食物中氨基酸的含量、所含氨基酸的种类各异，且其他营养素(脂肪、糖、矿物质、维生素等)含量也不相同，因此，给婴儿添加辅食时，以上食品都是可供选择的，还可以根据当地的特产，因地制宜地为小儿提供蛋白质高的食物。

蛋白质食品价格均较昂贵，家长可以利用几种廉价的食物混合在一起，提高蛋白质在身体里的利用率，例如，单纯食用玉米的生物价值为60%、小麦为67%、黄豆为64%，若把这三种食物，按比例混合后食用，则蛋白质的利用率可达77%。生物体内普遍存在的一种主要由氨基酸组成的生物大分子。它与核酸 同为生物体最基本的物质，担负着生命活动过程的各种极其重要的功能。蛋白质的基本结构单元是氨基酸，在蛋白质中出现的氨基酸共有20种。氨基酸以肽键相互连接，形成肽链。

简史1820年H.布拉孔诺发现甘氨酸和亮氨酸，这是最初被鉴定为蛋白质成分的氨基酸，以后又陆续发现了其他的氨基酸。到19世纪末已经搞清蛋白质主要是由一类相当简单的有机分子——氨基酸所组成。1902年E.菲舍尔和F.霍夫迈斯特各自独立地阐明了在蛋白质分子中将氨基酸连接在一起的化学键是肽键；1907年E.菲舍尔又成功地用化学方法连接了18个氨基酸首次合成了多肽，从而建立了作为蛋白质化学结构基础的多肽理论。对蛋白质精确的三维结构知识主要来自对蛋白质晶体的X射线衍射分析，1960 年J.C.肯德鲁首次应用X射线衍射分析技术测定了肌红蛋白的晶体结构，这是第一个被阐明了三维结构的蛋白质。中国科学工作者在1965年用化学合成法全合成了结晶牛胰岛素，首次实现了蛋白质的人工合成；在1969～1973年期间，先后在2.5埃和1.8埃分辨率水平测定了猪胰岛素的晶体结构，这是中国阐明的第一个蛋白质的三维结构。 蛋白质分子在受到外界的一些物理和化学因素的影响后，分子的肽链虽不裂解，但其天然的立体结构遭致改变和破坏，从而导致蛋白质生物活性的丧失和其他的物理、化学性质的变化，这一现象称为蛋白质的变性。早在1931年中国生物化学家吴宪就首次提出了正确的变性作用理论。引起蛋白质变性的主要因素有：①温度。②酸碱度。③有机溶剂。④脲和盐酸胍。这是应用最广泛的蛋白质变性试剂。⑤去垢剂和芳香环化合物。

蛋白质的变性常伴随有下列现象：①生物活性的丧失。这是蛋白质变性的最主要特征。②化学性质的改变。③物理性质的改变。在变性因素去除以后，变性的蛋白质分子又可重新回复到变性前的天然的构象，这一现象称为蛋白质的复性。蛋白质的复性有完全复性、基本复性或部分复性。只有少数蛋白质在严重变性以后，能够完全复性。蛋白质变性和复性的研究，对了解体内体外的蛋白质分子的折叠过程十分重要。主要通过蛋白质的变性和复性的研究，肯定了蛋白质折叠的自发性，证实了蛋白质分子的特征三维结构仅仅决定于它的氨基酸序列。活性蛋白质分子在生物体内刚合成时，常常不呈现活性，即不具有这一蛋白质的特定的生物功能。要使蛋白质呈现其生物活性，一个非常普遍的现象是，蛋白质分子的肽链在一些生化过程中必须按特定的方式断裂。蛋白质的激活是生物的一种调控方式，这类现象在各种重要的生命活动中广泛存在。

很多蛋白质由亚基组成，这类蛋白质在完成其生物功能时，在效率和反应速度的调节方面，很大程度上依赖于亚基之间的相互关系。亚基参与蛋白质功能的调节是一个相当普遍的现象，特别在调节酶的催化功能方面。有些酶存在和活性部位不重叠的别构部位，别构部位和别构配体相结合后，引起酶分子立体结构的变化，从而导致活性部位立体结构的改变，这种改变可能增进，也可能钝化酶的催化能力。这样的酶称为别构酶。已知的别构酶在结构上都有两个或两个以上的亚基。 蛋白质在生物体中有多种功能。

催化功能 有催化功能的蛋白质称酶，生物体新陈代谢的全部化学反应都是由酶催化来完成的。

运动功能从最低等的细菌鞭毛运动到高等动物的肌肉收缩都是通过蛋白质实现的。肌肉的松弛与收缩主要是由以肌球蛋白为主要成分的粗丝以及以肌动蛋白为主要成分的细丝相互滑动来完成的。

运输功能在生命活动过程中，许多小分子及离子的运输是由各种专一的蛋白质来完成的。例如在血液中血浆白蛋白运送小分子、红细胞中的血红蛋白运送氧气和二氧化碳等。

机械支持和保护功能高等动物的具有机械支持功能的组织如骨、结缔组织以及具有覆盖保护功能的毛发、皮肤、指甲等组织主要是由胶原、角蛋白、弹性蛋白等组成。

免疫和防御功能生物体为了维持自身的生存，拥有多种类型的防御手段，其中不少是靠蛋白质来执行的 。例如抗体即是一类高度专一的蛋白质，它能识别和结合侵入生物体的外来物质，如异体蛋白质、病毒和细菌等，取消其有害作用。

调节功能在维持生物体正常的生命活动中，代谢机能的调节，生长发育和分化的控制，生殖机能的调节以及物种的延续等各种过程中，多肽和蛋白质激素起着极为重要的作用。此外，尚有接受和传递调节信息的蛋白质，如各种激素的受体蛋白等。

发展 蛋白质作为生命活动中起重要作用的生物大分子，与一切揭开生命奥秘的重大研究课题都有密切的关系。蛋白质是人类和其他动物的主要食物成分，高蛋白膳食是人民生活水平提高的重要标志之一。许多纯的蛋白质制剂也是有效的药物，例如胰岛素、人丙种球蛋白和一些酶制剂等。在临床检验方面，测定有关酶的活力和某些蛋白质的变化可以作为一些疾病临床诊断的指标，例如乳酸脱氢酶同工酶的鉴定可以用作心肌梗塞的指标，甲胎蛋白的升高可以作为早期肝癌病变的指标等。在工业生产上，某些蛋白质是食品工业及轻工业的重要原料，如羊毛和蚕丝都是蛋白质，皮革是经过处理的胶原蛋白。在制革、制药、缫丝等工业部门应用各种酶制剂后，可以提高生产效率和产品质量。蛋白质在农业、畜牧业、水产养殖业方面的重要性，也是显而易见的。

蛋白质可作为一种试剂用于筛选能够促进或抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐。进而，这种化合物或其盐以及抑制本发明蛋白质活性的中和抗体可用作治疗或预防支气管哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等的药物。

蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中，起着十分重要的作用。生物的结构和形状都与蛋白质有关。蛋白质还参与基因表达的调节，以及细胞中氧化还原、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动过程。在细胞和生物体内各种生物化学反应中起催化作用的酶主要也是蛋白质。许多重要的激素，如胰岛素和胸腺激素等也都是蛋白质。此外，多种蛋白质，如植物种子（豆、花生、小麦等）中的蛋白质和动物蛋白、奶酪等都是供生物营养生长之用的蛋白质。有些蛋白质如蛇毒、蜂毒等是动物攻防的武器。

蛋白质占人体的20 %,占身体比例最大。胆汁，尿液除外，都是蛋白质合成的。只有蛋白质充足，才能代谢正常。就像盖房子，构建身体的原材料最主要的是蛋白质。

1.蛋白质是构建新组织的基础材料，是酶，激素合成的原料，；维持钾钠平衡；消除水肿。

2.是合成抗体的成分：白细胞，T淋巴细胞，干扰素等，提高免疫力。

3.提供一部分能量。

4.调低血压，缓冲贫血，是红细胞的载体。

5.形成人体的胶原蛋白。眼球玻璃体，视紫质都有胶原蛋白。

7.大脑细胞分裂的动力源是蛋白质；脑脊液是蛋白质合成的；记忆力下降

8.性功能障碍

9.肝脏：造血功能；合成激素，酶；解毒。缺乏蛋白质，肝细胞不健康。有一副好肝脏，人健康就有保障。

10.心脏---泵器官。缺乏蛋白质会出现手脚冰凉；缺氧；心肌缺氧造成心力衰竭----死亡。

11.脾胃：每天都要消化食物，消化酶是蛋白质合成的。缺乏会造成胃动力不够，消化不良，打嗝。胃溃疡，胃炎；胃酸过多，刺激溃疡面你会感觉到疼，蛋白质唯一具有修复再造细胞的功能。消化壁上有韧带，缺乏蛋白质会松弛，内脏下垂，子宫下垂脏器移位。

12.四肢：人老先老腿，缺乏蛋白质肌肉萎缩；骨头的韧性减低，易骨折

13.抗体会减少，易感冒，发烧。