组织脱水为什么要经过连续梯度的乙醇

是有意义的。

组织脱水经过连续梯度的乙醇主要原因是使脱水效果更好。一般情况下的梯度酒精脱水是85%酒精-95%酒精，无水酒精的梯度进行脱水。是有意义的。

固定：2.5%戊二醛浸泡2小时，用0.1MpH7.2的磷酸缓冲液清洗3次；用1%锇酸固定2小时，磷酸缓冲液清洗3次。

脱水：乙醇梯度脱水，样品用30%，50%，70%，85%，95%逐级浸泡各5分钟，再用100%乙醇浸泡2次，每次5分钟。

冷冻干燥和喷金：这个我是让电镜室的工作人员干的

荧光原位杂交具有那些优点：

1.FISH不需要放射性同位素标记，更经济安全。

2.FISH探针稳定性高，特异性好。

3.FISH通过多次免疫化学反应，使杂交信号增强，灵敏度提高，其灵敏度与放射性探针相当。

4.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列。

荧光原位杂交应用在哪些方面

FISH被广泛应用于乳腺癌、膀胱癌，宫颈癌，肺癌和淋巴瘤等实体肿瘤的靶向治疗和辅助诊断。

FISH在基因定性、定量，整合、表达等方面的研究中颇具优势，目前已经被广泛应用于遗传病诊断、病毒感染分析、产前诊断、肿瘤遗传学和基因组研究等许多领域，在临床检验、教学和研究等方面扮演着重要的角色。

荧光原位杂交技术流程有哪些?

技术路线：

详细实验流程:

一）标本类型

1、遗传病：外周血、羊水、绒毛、胎儿脐带血制备的染色体，或羊水和绒毛的间期细胞。

2、血液病：外周血或骨髓的染色体或间期细胞。

3、实体肿瘤（包括骨髓活检）：理论上讲，任何含有足够癌细胞或DNA的组织、细胞或体液（如胸水、腹水等）标本都可进行相应的基因状态检测，但必须依据相应现行的临床诊治指南来选择。

二）标本固定

1、遗传病和血液病（除石蜡包埋骨髓活检标本外）：染色体或细胞制片后，50～60℃烤片2小时。

2、细胞学标本：细针穿刺标本，取样后应立即95%乙醇固定；胸、腹水标本取样后，优先建议沉渣包埋制备细胞蜡块，离心后，95%乙醇或3.7%中性缓冲甲醛液固定；对于细胞量过少或不具备制备蜡块条件的实验室，取样涂片后立即95%乙醇固定。

3、组织学标本：组织离体后尽可能在30～60分钟内将组织按规范剖开，置于不少于自身体积4～10倍的3.7%中性缓冲甲醛固定液（pH7.2～7.4）中固定6～72小时【1-4】。固定液的pH值会直接影响蛋白及核酸的含量【1,2】。组织学标本过度固定或固定不足都会导致检测结果的变化。

三）标本脱钙

骨组织及钙化病灶固定后，需要先将钙盐除去使组织软化，以便于后续的临床检测。传统的脱钙剂（盐酸）会显著降解DNA和RNA，无法保证荧光原位杂交检测结果的准确性，脱钙剂乙二胺四乙酸（EDTA）可以在脱钙过程中保护DNA，但脱钙时间会延长至48小时【5,6】。

四）组织脱水、透明、浸蜡

实验室需根据自身的实际情况，通过严格的测试，制定标准化的组织脱水、透明、浸蜡流程以及试剂更换程序。建议使用自动组织脱水机和梯度乙醇脱水方案，如70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇×2→无水乙醇×2。根据处理的组织类型和大小以及脱水机的工作效率，每种梯度的乙醇作用时间可设定为60～120分钟。根据处理组织的数量和试剂使用时间及时进行更换，脱水时间不足或试剂更换不及时均会导致后续染色、杂交效果不佳。

五）组织切片

根据检测要求石蜡切片厚度为3～5μm，贴于阳离子或正电荷（或类似的）等专用防脱载玻片上，确保切片与载玻片间没有气泡。切片在空气中略微干燥后应立即烤片，推荐标准温度为65℃烤片不少于2小时。荧光原位杂交未染色的切片置于室温不宜超过6周【3,7】。

二、荧光原位杂交检测步骤

荧光原位杂交检测根据检测标本的不同，操作步骤略有差异，主要流程包括：预处理、变性/杂交、杂交后清洗等环节。荧光原位杂交新项目开展之前，应进行包括方法学及试剂等性能验证，建立符合实验室的标准化操作流程，以确保结果的准确性。

一）脱蜡

烤好的组织切片需经过脱蜡处理，二甲苯脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交效率降低、荧光背景高等，影响实验结果。因此脱蜡使用的二甲苯必须及时更换，通常至少每两周更换一次，并可根据实际情况延长脱蜡时间；脱蜡过程中产生的有机废物需进行回收处理【8-10】。

二）预处理/酶消化

1、切片预处理：在现阶段，预处理常见试剂有1mol/L硫氰酸钠、30%酸性亚硫酸钠、10mmol/L柠檬酸、去离子水等；处理方法有高温水浴、高温高压等；预处理温度50～120℃不等。处理程序会因组织类型不同而有差异。

2、酶消化处理：对切片进行酶消化，常用的蛋白水解酶有胃蛋白酶和蛋白酶K。不同批号、不同厂商的胃蛋白酶活性不同，消化能力也存在一定的差异。酶消化的作用是分解包围靶DNA的蛋白质，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。酶消化注意事项：①酶的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高，会对细胞的结构有一定的破坏，细胞核消失或细胞核辨认不清，也会造成一定程度的组织脱片；②酶消化不足会造成蛋白消化不透彻，降低组织的通透性以及杂交信号的强度和杂交率；③消化酶均为现用现配，且工作液使用时间<24小时【11-13】。

3、梯度乙醇脱水：将组织切片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2分钟脱水，自然晾干。注意事项：切片必须充分脱水晾干，避免造成信号减弱或者杂交失败。

三）探针的应用

1、探针的配制：内常用的探针有即用型和非即用型，即用型探针可直接点样杂交，操作简便。非即用型探针是需要操作者将探针与杂交缓冲液按一定比例配制，配制方法参照探针厂商说明书。注意事项：①探针不宜反复冻融，可适当分装；②震荡旋涡时需轻柔；③充分混匀，如果混匀不均，会导致杂交信号微弱或无信号【3,8,9】。

2、探针的加样：参照选用厂商推荐或经过本实验室有效性验证纳入标准化操作流程文件的探针加样量，加到待杂交组织中央处，使用合适的盖玻片，橡胶水泥密封四边。注意事项：①探针的使用和配制遵照本单位选用试剂的产品说明书操作；②盖玻片一般采用硅化盖玻片或无菌的蜡膜；③注意环境光强度，避免太阳光或强烈的光照；④加盖玻片时注意不要留有气泡，避免因气泡造成干片现象，导致无杂交信号或杂交率降低；⑤盖玻片边缘封胶不严密也会出现干片现象。

3、变性及杂交：变性和杂交分为甲酰胺变性杂交（手工操作）和杂交仪变性杂交（自动操作）。前者是将组织切片和探针分开进行变性，后者是在杂交仪中对组织切片和探针共变性，此方法可以在一定程度上降低人为因素的影响。根据所选用厂家探针的要求，设定共变性杂交条件，可选变性温度和时间：72～95℃，3～5分钟，杂交温度和时间：37或42℃，16～18小时。注意事项：为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失及防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。

4、杂交后处理：杂交后处理的目的：①洗去多余的未结合的探针；②洗去非特异度结合的探针片段，有效降低杂交背景。杂交后洗涤一般遵循的共同原则：盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。可选择的洗液有0.3%NP-40/2×SSC溶液、0.1%NP-40/2×SSC溶液、50%甲酰胺/2×SSC等，具体请参照相应厂家的试剂说明书。注意事项：①在漂洗的过程中，切勿使切片干燥；②影响洗涤的因素有：洗液中NP-40的浓度、洗涤时间、洗涤温度、洗液pH值【10,13-15】。

5、对比染色、封片：在杂交区域位置滴加足够量的DAPI复染剂，立即盖上盖玻片，-20℃冰箱内存放。注意事项：①4,6-二咪基-2-联苯基吲哚（DAPI）是一种毒性物质与致癌物，操作过程中应注意个人防护措施。如不慎接触，立即大量水冲洗【11,13】。②注意避光，紫外线会造成荧光淬灭。③宜选用较大盖玻片或是选用指甲油在盖玻片四周封片。可以有效避免阅片时镜油的渗入对信号观察的影响。荧光原位杂交结果应立即照相存档并将切片置于-20℃保存，建议至少保存3个月备查，有条件的可以保存1年以上，仍可见清晰信号。

石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.

石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.

取材

用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定.

取材的注意事项如下:

(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织取病理材料时,应设置对照材料.

(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm小段叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.

(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.

(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行)对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.

(二)固定

将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.

良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.

常用固定液:

简单固定液 以一种化学药品配制的固定液.

⑴ 乙醇 为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.

⑵ 甲醛 为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.

⑶ 醋酸 为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.

2. 混合固定液:

由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:① 优缺点互补② 膨胀与收缩相互平衡③ 强氧化剂与还原剂应分别配置.

常用混合固定液有下列几种:

⑴ FAA 固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇) 广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24 h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.

⑵ 纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存主要用于显示分裂相.

(三)抽气

植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.

一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.

(四)洗涤

固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24 h.

(五)脱水

材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.

脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料.

(六)透明

透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.

二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..

(七)浸蜡

是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.

浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.

每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.

(八)包埋

材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.

操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.

(九)切片

即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.

(十)贴片

是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.

常用的粘片剂有下列二种:

(1) 明胶黏片剂

(2) 蛋清黏片剂

(十一) 染色

即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.

染色方法可分为下列几类:

① 单染 只用一种染料染色.

② 双重染色 两种染料染色,如番红--固绿苏木精---曙红.

③ 多重染色 多种染料染色,如番红—固绿—桔红G酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.

(十二) 封藏

封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.

方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.

冷冻切片法：

冷冻切片的制作方法

（1）低温恒冷箱冷冻切片制作法

1．本室现有Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。

冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。

2．操作方法及步骤：

①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。

⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。

3．冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

4．冰冻切片的快速染色法

冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分钟。

② 水洗。

③ 染苏木素3－5分钟。

④分化。

⑤ 于碱水中返蓝20秒。

⑥ 伊红染色10－20秒。

⑦脱水，透明，中性树胶封固。

冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。

冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。

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原理是：酒精可以置换组织内的水。

乙醇是一种很好的溶剂，能溶解许多物质，所以常用乙醇来溶解植物色素或其中的药用成分；也常用乙醇作为反应的溶剂，使参加反应的有机物和无机物均能溶解，增大接触面积，提高反应速率。

扩展资料：

酒精水溶液中纯酒精的含量就是其浓度，我国是以容量（体积）百分数进行酒精水溶液的浓度计算的。如平常说的五十度酒是指在20℃时100体积酒精溶液中含有50体积纯酒精。

乙醇的用途很广，可用乙醇制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。医疗上也常用体积分数为70%~75%的乙醇作消毒剂等，在国防化工、医疗卫生、食品工业、工农业生产中都有广泛的用途。

参考资料来源：百度百科--乙醇