冰乙醇沉淀的原理

酶切后片段直接用无水乙醇沉淀的方法

把酶切体系先加入等体积氯仿抽提，然后离心去掉氯仿，取水层，加入2倍体积的冷乙醇，混匀放入低温冰箱进行醇沉。然后再离心吸掉乙醇晾干，用纯水溶解就行了

需要注意的就是醇沉之后的离心，因为连接体系一般都是很小的10ul左右，所以沉淀下来的DNA是肉眼根本看不到的，所以可以在离心的时候记住EP管放的方向，那样就能猜出沉淀在管的什么位置.吸乙醇的时候要小心避开。

1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

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蛋白质含量，离子强度，溶液pH值，乙醇浓度，溶液温度。

1。蛋白质含量，愈高，共沉多；反之，分离愈彻底。当然有度。溶液太稀了，成本高。

2。离子强度：这与介电强度有关。

3。怠掸糙赶孬非茬石长将溶液pH值：调到目标蛋白等电点周围。

4。乙醇浓度：一般来说乙醇浓度多少，与目标蛋白的分子量有关：比如8%，可沉淀纤维蛋白原，20%可沉淀球蛋白，40%可沉淀白蛋白等等，当然，乙醇浓度与溶液pH值配合使用。加入乙醇不能过快，防止局部过浓。要边加边摇动。

否则，共沉多！或者局部变性。

5。溶液温度：必须低温，乙醇反应是个放热反应，如果温度高，可引起蛋白质变性，不可逆的变形。

这五变参数，要综合，动态的调整，可达到精确分离蛋白质的作用。

原理：

1.析出溶解在nac1溶液中的dna。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的dna。

3.dna在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：

1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。

5

min

2．溶解dna：

3．析出含dna的黏稠物：蒸馏水300ml，逆时针方向搅拌，缓慢

4．过滤：取黏稠物

5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3

min

6．过滤：取滤液。

7．提取出含杂质较少的dna，逆时针方向搅拌，稍慢。5

min

8．dna的鉴定：沸水浴5min

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dna提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与dna结合的组蛋白。

将dna在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为dna在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取dna的商业化试剂盒。

2.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法②化学试剂法：用sds处理细胞③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

3.dna提取的几种方法

(1).浓盐法

a.

利用rna和dna在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1m

氯

纳提取化钠抽提,得到的dnp粘液与含有少量辛醇的

氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而dna位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将dna

钠盐沉淀出来.

b.

也可用0.15

mnacl液反复洗涤细胞破碎液除去rnp,再以1mnacl提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

c.以稀盐酸溶液提取dna

时,加入适量去污剂,如sds可有助于蛋白质与dna

的分离。在提取过程中为抑制组织中的dnase对dna

的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15mnacl,0.015m柠檬钠,并称ssc溶液,提取dna.

（2）.阴离子去污剂法

用sds或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取dna

.由于细胞中dna与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取dna

（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了dnase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与dna

联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而dna溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含dna

的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀dna

。此时dna是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的dna保持天然状态

（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去rna，然后将沉淀溶于水中，使dna充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6m.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%

，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得dna样品.此法提取的dna中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入sds.

异丙醇比较疏水,能很更好地沉淀核酸,用乙醇的目的是去盐,它比异丙醇更亲水,所以能去掉一些盐离子.有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度.在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2倍体积乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效.

异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中,从而可达到去多糖的作用.但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐

1.加入1/10体积的3 M CH3COONa(pH 5.2)，混匀。

2. 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30～60分钟。

3. 12,000 rpm，4℃离心10 min，回收沉淀。

4. 用1 ml 70%的预冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃离心10 min

哈哈哈 ethanol precipitation讲究太多了你摸不透的。

在ethanol precipitation里面可使用的盐有以下：

使用CH3COONa

使用最多的最普遍的。添加终浓度0.3M

使用CH3COONH4

可去除dNTP或糖类，蛋白质的混入。

注意NH4离子阻碍DNAligase等酶活性。

使用LiCl

适合RNA precipitation。

注意Cl-离子阻碍reverse transcription。

使用NaCl

溶液中如有SDS，为了避免沉淀将需要用NaCl盐。

使用MgCl2

沉淀7-100bp的DNA时用。

没什么特别的就用CH3COONa吧。

至于你的收量问题我推荐你加长离心时间。4度离心一小时试试。