请教实验达人，怎样配制配制10M的醋酸铵

亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)

直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点。测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区，所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列。它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。

第一部分 基因组DNA的提取。

这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：

1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：

1：紫外分光光度计计算OD比值；

2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。

1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；

2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；

3： 42℃水浴30min；

水浴期间配制：

4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）

5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8：50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。

这一步细节：

1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。

2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。

第三部分 修饰后DNA纯化回收

EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。

1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。

2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）

1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；

2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；

3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。

4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。

5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。

6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。

7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。

3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。

4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。

5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。

6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）

7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。

8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。

9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul- 30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。

10：-20℃保存DNA溶液。

此步细节：

1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。

2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。

3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。

此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。

第四部分 修饰后DNA用于PCR

这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：

1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。

2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。

3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。

4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。

5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。

这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分。

第五部分 PCR产物的凝胶回收

这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。

几个细节：

1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。

2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。

3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。

4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。

第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选

1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）

15ul体系

T-easy 1ul

Ligase 1ul

2xbuffer 7.5ul

DNA 5.5ul

4度，过夜。

2：连接产物的转化

1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；

2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；

3）42度， 90秒钟；

4）冰上2分钟；

5）800ul LB培养基；

6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；

7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；

8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）

先涂：X-gar 35ul

IPTG 25ul

后涂：混悬液

过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。

3：取白斑，划种于新板上

新板：先涂：X-gar 35ul

IPTG 25ul

然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。

针头挑白斑划2道于板上相应区域内。

37度，孵箱过夜。

4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。

这一部分的细节：

1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；

2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。

1.总则

为了加强基本农保护工作，使保护耕地工作进入标准化管理轨道，提高耕地保护管理的水平，根据国务院《基本农田保护条例》和北京市《基本农田保护条例》的要求，在全国农业技术推广服务中心的指导下，参照北京市耕地类型与特点，特制定本技术规程，为我市全面详细开展《耕地地力分等定级》做技术准备，以指导全市耕地地力分等定级工作。

1.1 目的

耕地地力分等定级就是综合评定耕地质量的优劣并划分等别。

耕地地力分等定级是为了反映不同质量的耕地在正常的利用与管理水平下的作物产量或收益差异，为公正公平地确定耕地租税费提供科学依据，也为合理利用和保护耕地服务。

1.2 原则

耕地地力分等定级就是划分耕地质量或生产潜力的相对差别。耕地质量或生产潜力的高低取决于耕地各种属性的综合影响。因此耕地地力分等定级应遵循以下原则：

1、主导因素与综合因素相结合的原则。耕地的质量或生产潜力受自然条件、土壤属性和人为活动等诸多因素的影响和制约，不同区域、不同条件下各因素对耕地地力的影响元均不同，但在这些属性中，往往有一个或几个主导因素对耕地地力起着决定性作用，因此耕地地力分等定级时应对影响耕地地力的因素进行综合评价，以耕地的土壤属性为主，找出直接影响耕地地力的限制性因素为主导因素，来衡量耕地地力的高低。

2、定性分析与定量分析相结合的原则。对影响耕地地力的土壤属性等主导因素尽量进行量化分析，以定量计算为主，对难以量化的经济及社会等因素进行定性分析，量化评价。尽量减少人为的主观性，以提高分等定级的精度和可操作性。

1.3 术语

耕地地力：由耕地土壤的地形、地貌、成土母质特征，农田基础设施及培肥水平，等综合构成的耕地生产能力。

2 准备工作

2.1 工作组织

2.1.1成立耕地地力分等定级领导小组和办公室

凡开展耕地地力分等工作的县，成立由主管县长为组长的耕地地力分等定级领导小组，领导小组由土地管理部门和农业主管部门的主要领导组成。办公室设在土地管理部门，由主管局长任办公室主任，负责日常工作。

2.1.2 成立技术专家组

聘请中国农业大学、北京市市农业局、北京市土肥工作站和各区县种植业服务中心专家组成专家组，参与耕地地力与评价工作的技术指导、制定项目操作技术规程和实施方案，负责业务指导和成果汇总。

2.1.3编写土地分等任务书

凡开展耕地地力分等定级工作的县，在耕地地力分等定级领导小组的领导下，由耕地地力分等定级办公室组织编写土地分等任务书。土地分等定级任务书内容包括：开展土地分等县的基本情况耕地地力分等定级要完成的任务，包括耕地调查、耕地地力分等定级、耕地地力分等定级图编制和报告编写的要求等耕地地力分等定级工作的组织、人员、实施步骤与方法时间安排和经费预算。检查验收办法

耕地地力分等定级任务书经耕地地力分等定级领导小组批准后，报上级土地管理部门批准实施。

2.1.4组织耕地地力分等定级专业队伍

根据批准的耕地地力分等定级任务书，由耕地地力分等定级领导小组组织耕地地力分等定级专业队伍，确定队领导和技术负责人。

2.1.5确定定点化验室

明确各区县农业科学研究所化验室负责样品的测定，测定方法和质量控制按本技术规程(附录6)的要求执行。

2.2 物资准备

2.2.1 计算机

硬件：计算机(各区县农科所自购)，工程扫描仪(A0)(租用)，彩色喷墨绘图仪(A0)(租用)。

软件 操作系统,数据库平台(通路、SQL服务器),耕地资源管理信息系统及相关的GIS软件。(市土肥工作站购买)

2.2.2 野外调查所需物资

采样工具、样品的包装运输装备、野外调查表格、GPS仪等。(市土肥工作站购买)

2.2.3 分析化验仪器设备

根据工作需要补充必要的检测仪器设备和化学试剂。(各区县农科所提供)

2.3 技术准备

2.3.1 编写实施方案

其主要内容包括：思路与目标、工作内容、组织领导、技术保证、调查与评价方法、预期成果、计划进度和经费安排等。

2.3.2确定评价单元

采用土壤图和土地利用现状图的叠置划分法，相同土壤单元和土地利用现状类型的地块组成一个评价单元，并依据野外的实地调查进行修正。对5亩以下的耕地地块直接以地块为评价单元，对5亩以上的地块，要根据土壤类型、地形等因素，在地块上划分评价单元，每个评价单元的面积不得大于5亩。

2.3.3 调查采样点确定原则

2.3.3.1 布点和采样原则

根据地块大小采取网格法、“S”法或棋盘法布点和分层布点相结合的原则。同时，在布点时要充分考虑土壤类型、分布、作物种类、设施类型等要充分利用的土壤普查资料，在第二次土壤普查采样点取样。

采样点所在的评价单元具有代表性，应避免各种非调查因素的影响。

2.3.3.2 确定调查采样点

根据土地利用现状图,参考第二次土壤普查资料，综合分析，确定调查与采样点位置。

2.3.4 准备野外调查表格

根据调查表样，编制符合当地实际的填表说明。

2.3.5 技术培训和试点

正式调查开展工作之前，进行技术培训与试点(选择平谷区马昌营镇和怀柔的北房镇)工作，以使全体耕地地力分等定级队员熟悉技术规程，掌握调查方法和技术要领。具体包括以下方面：

田间调查技术：包括采样点选择、GPS应用技术(见附录7)、采样技术、调查表填写等。

计算机应用技术：包括数据录入、图件数字化、专家知识库建立等。

化验技能：包括样品前处理、精密仪器使用、化验结果计算、质量控制等。

调查报告的编写：包括报告内容、篇章结构、术语、量纲等。

2.4 资料准备

耕地地力分等定级应收集以下资料：

(1)自然条件资料，包括气候、水文、土壤、植被、地质、地貌、农业区划等资料和图件

(2)土地利用现状调查资料、土地利用现状图和行政区划图

(3)农业生产情况资料，包括耕作制度、各种栽培作物的产量(单产与亩产)、化肥与农药等其他农业生产资料投入情况、良种与农业机械投入情况等资料

(4)社会经济条件资料，包括农业经济、农田基本建设、劳动力文化水平等资料

(5)其他上一级土地管理局下发的用于耕地地力分等定级工作的有关资料和文件。

3 调查与取样

3.1 调查

3.1.1填写耕地采样点基本情况调查表

在选定的调查单元，用GPS确定地理坐标(北京54坐标系)，按照统一的标准和术语填写调查表(附录3)。

3.1.2 填写耕地采样点农户调查表

在选定的调查单元，选择有代表性的农户，调查耕作管理、施肥水平、产量水平、种植制度、灌溉等情况，填写调查表(见附录4)。

3.1.3调查数据的整理

野外调查的数据(基本调查表)，经技术负责人审核后，由专业人员按数据库要求进行编码、整理、录入。

3.2 土样采集方法

为避免施肥的影响，统一在作物收获后采样。采样时，先确定耕层厚度，用“X”法、“S”法或棋盘法，使用木铲、竹铲、塑料铲、不锈钢土钻等工具。采样要求多点混合，每个采样点均匀随机采15-20个小样点，每个小样点的测土部位、深度和数量要求一致。充分混合后，四分法留取1.5公斤。一袋土样用铅笔填写两张标签，内外各具。标签主要内容为：样品野外编号(与大田采样点基本情况调查表和农户调查表相一致)、采样深度、采样地点、采样时间、采样人等。

大田采样深度为耕层0-20厘米、亚耕层为20-40厘米。

蔬菜地采样深度为耕层0-25厘米、亚耕层为25-50厘米。同一样点在同一蔬菜地或同一个日光温室、塑料大棚里采集。

4 测试分析项目

测试分析原则：测试方法要选择准确度高、稳定性好、重现性好的方法灵敏度能够满足分析要求抗干扰能力强或可用适当方法消除所用仪器和试剂易得，操作简便快捷优先等效或参照国际或国家标准可能条件下，采用国内外新技术和新方法(注：非国家标准的测试方法注明出处)。

4.1 物理性状

土壤容重(选择10%～20%的取样点进行分析)

4.2 化学性状

pH值、有机质、全氮、有效磷、速效钾、缓效钾、有效态微量元素(铜、锌、铁、锰、硼)、阳离子交换量和耕层土壤含盐

4.3 测试分析方法

表1 评价指标的测定方法 分析内容 分析方法 土壤容重 采用环刀法 有机质,% 重铬酸钾－硫酸溶液—油浴法 全氮,% 采用半微量开氏法 有效磷，mg/kg 石灰性土或水稻土采用碳酸氢钠提取—钼锑抗比色法 速效钾，mg/kg 采用乙酸铵提取－火焰光度法 水溶态硼 采用甲亚胺－H比色法或姜黄素比色法 有效性铜、锌、铁、锰 采用DTPA提取－原子吸收光谱法或ICP法 pH(水浸) 采用玻璃电极法 阳离子交换量,cmol(+)/kg 氯化铵-乙酸铵法（适石灰性土壤） 耕层土壤含盐 电导法 5 耕地地力评价

参照根据全国耕地地力调查评价指标体系(见附录1)，组织专家根据北京市种植作物的特点，运用经验法或主成分分析法，确定北京市的耕地地力评价因子。具体包括以下几个方面(见表2)：

5.1.1 地形调查

地形调查的目的主要是了解地块的平整程度及其对耕种和水土流失的影响。

(1)地形部位

水田、水浇地和菜地一般均作为平地处理。只对旱地和望天田进行地形调查。对于坡耕地要调查其坡度。

(2)地面坡降

划分为<2，2-5，5-8，8-15，15-25 >25度 共6级

5.1.2 地下水调查

地下水埋深分为4级： <3m，3m～5m，5m～10m, >10m

5.1.3.排灌条件调查

灌溉保证率：指预期灌溉用水量在多年灌溉中能够得到充分满足的年数的出现几率。一般旱涝保收田的灌溉保证率为75%以上。但实际调查时这一数字却不容易得到。因此可描述为以下四种情况：充分满足，可随时灌溉基本满足，在关键时期可保障灌溉一般满足，大旱之年不能保障灌溉无灌溉条件等

5.1.4.土壤属性调查

(1)成土母质

成土母质是指岩石风化后，在地球表面形成一个没有经过生物作用的疏松表层。根据成土母质的成因类型，岩性特征，化学组成物质等因素，北京市耕地的成土母质一般可分为：

花岗岩、片麻岩母质：主要分布在怀柔、密云县以及昌平县的北部、延庆县的西北部。

石灰岩、白云质灰岩母质：主要分布在门头沟、延庆和房山。

洪积母质：是山区洪流在山前的沉积物。

洪冲积与冲积洪积母质：是过渡性混合成因型的沉积物，主要分布在山前烘积扇之下，这种过渡性沉积物，一般颗粒具有一定分选性，组成物越接近山麓冲积扇顶部颗粒越粗，靠近山麓段有碎石与洪积层，而冲积扇下部地势趋于平坦，颗粒较细。

风积母质：被风力搬运的碎屑物质沉积而成。主要集中分布在潮白、永定两河沿岸。

湖积母质：湖积物是湖泊静水沉积物，颗粒细而均匀，质地粘重。

黄土母质：即第四纪大陆沉积物。

(2)耕层质地调查

土壤质地是指耕层土壤的质地。

质地分为6级：砂土、砂壤、轻壤、中壤、重壤、黏土等

(3)耕层厚度

耕层厚度：植物根系发育所能伸展的厚度。

耕层厚度分为：>30mm，30-25mm，25-20mm，20-15mm，15-10mm，≤10mm共6个级别。

(4)耕层土壤理化性质

有机质含量：指土壤中各种含碳有机化合物。依据北京市第二次土壤普查将其划分为：>6%，6-4%，4-2%，2-1%，1-0.6%，≤0.6% 共6级。

全氮：土壤氮素养分是作物生长必须的大量营养元素之一。

有效磷：磷素对作物生长发育、新陈代谢起着重要作用。

速效钾：钾是作物体内许多酶的活化剂，能促进氮的代谢，加速蛋白质和碳水化合物的合成与运输，培强作物的抗逆境能力。

微量元素：第二次土壤普查的结果表明，北京土壤的微量元素以硼、锌较为缺乏部分土壤中锰含量不足局部缺铁还有的土壤锰铁比失调只有铜含量丰富。依据第二次土壤普查划分微量元素含量的等级标准。

土壤的阳离子交换量：每百克干土所含的全部交换性阳离子的毫当量数，称为土壤的阳离子交换量。土壤阳离子交换量的大小与土壤胶体的数量、成份及外界环境条件有关。阳离子交换能力大小，影响土壤速效养分的保蓄与供应量，以及土壤缓冲能力。

土壤pH值：土壤酸碱度用 pH值表示。

电导率：用来表示土壤的全盐含量。

5.1.5 障碍层次及不利剖面层次

障碍层次：是指在耕层以下，1250px以内出现石灰姜石层、石膏磐层、铁磐层等阻碍根系伸展的层次。如果这些障碍层次在距地表1250px以外出现，则不算作障碍层次。

王海龙杨静祁振国岳秀兰

(包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头014010；赤峰市第一医院’)

中图分类号(}so3 文献标识码A 文章编号1006—740X(2006)02—0231一o3

蛋白质组学是后基因组时代的一个新领域，它通

过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白

质的定量研究，来揭示生命的过程和解释基因表达控

制的机理⋯ 。蛋白质组学分为表达蛋白质组学(Ex·

pression Proteomies)和细胞图谱蛋白质组学(Cell Map

Pmteomies)，前者指细胞和组织表达的蛋白质的定量

图谱，它依赖二维凝胶电泳图谱和图像分析，它能在整

体蛋白质水平上研究细胞的通路，以及疾病、药物和其

它生物刺激所引起的紊乱，因此它可能发现疾病标志

和阐明生物通路；后者是指通过纯化细胞器或蛋白质

复合物，用质谱鉴定蛋白质组分，确定蛋白质和蛋白质

相互作用的亚细胞位置 】。9O年代以来随着人类基

因组计划的实施，引发了生物信息学(Bioinformaties)

的发展，使蛋白质分析发生了革命性的变化。现在将

高分辨2一维电泳、高灵敏度的生物质谱和快速增长

的蛋白质和DNA数据库三者结合起来，为高通量的蛋

白质组学(High throughout Proteomies)铺平了道路 。

这里主要介绍质谱技术在蛋白质组学中的应用。

收稿日期：2006-03-02

作者简介：王海龙(1951一)，男。大学，副教授。

l 质谱技术的发展历史

1．1 质谱的开发历史要追溯到2O世纪初，Thomson

创制的抛物线质谱装置，1919年Aston制成了第一台

速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。

最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，

随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范

围也在不断扩大，到2O世纪5O年代后期已广泛地应

用于无机化合物和有机化合物的测定。现今质谱分析

的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶

金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及

生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命

科学领域的应用更为质谱的发展注入了新的活力，形

成了独特的生物质谱技术。

1．2 基本原理质谱(Mass Spectrometry)是带电原

子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像。

质谱仪是一类能使物质离化成离子并通过适当的电

场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与

否实现质量比分离，并检测强度后进行物质分析的仪

器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组

成 。

用于分析的样品分子在离子源中离化成具有不同

质量的单电荷分子和碎片离子，这些单电荷离子在加

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232 包头医学院学报 第22卷

速电场中获得相同动能并形成一束离子，进入由电场

和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过

电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角

速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速

度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们

的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生

质量的分离，这样就使具有同一质量比而速度不同的

离子聚焦在同一点上，不同质量比的离子聚焦在不同

的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检

测即可得到不同质量比的谱线，即质谱。通过质谱分

析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中

同位素构成和分子结构等多方面的信息 J。

2 质谱技术种类

2．1 电喷雾质谱技术(Electrospray ionization Mass

Spectrometry，ESI—MS) 是在毛细管的出口处施加一

高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化

成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强

度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷

的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进

入气相⋯ 。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子

而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析

仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分

析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电

荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多

种分离技术联合使用 j。

2．2 基质辅助激光解吸附质谱技术(Matrix Assisted

Laser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是将

分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射

晶体时由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量

蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分

析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为

单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的

质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行

时间检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足

够，检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此质

谱很合适对蛋白质、多肽、核酸和多糖等大分子的研

究。

2．3 快原子轰击质谱技术(Fast Atom Bomebardment

Mass Spectrometry，FABMS) 一种软电离技术，是用快

速隋性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅

出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定

的化合物的分析，特别适于多肽和蛋白质的分析研究。

FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定

样品的元素组成和分子式。而FABMS—MS串联技术

的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而

使其在生物医学分析中迅速发展起来 ]。

2．4 同位素质谱技术是一种开发和应用比较早的

技术，被广泛地应用于各个领域，但它在医学领域的应

用只是近近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定

化合物的能力，该化合物又易于用同位素标示，人们就

想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含

量以达到检测该病原菌的目的，同时也为同位素质谱

在医学领域的应用开辟了一条思路。

3 电泳分离后凝胶上蛋白质的质谱鉴定

电泳分离后凝胶上的蛋白质，先用适当的蛋白内

切酶酶切成肽段，再用质谱鉴定。现有四种制样方法：

3．1 凝胶内酶切凝胶内酶切的灵敏度高，是当前广

泛采用的样品制备方法。最常用的蛋白内切酶是胰蛋

白酶。它在蛋白质主链精氨酸和赖氨酸的C一端进行

切割。文献中有多种凝胶内酶切的方法，这里介绍改

进后的Wilm的方法。

将电泳后凝胶上的蛋白质斑点以最小的体积切

下，并将凝胶块切成约lmm 小颗粒，转入小离心管

内，加入约5O 的lOOmmol／L碳酸氢铵溶液洗胶粒

5min，弃去碳酸氢铵液，加入50pJ乙腈使凝胶脱水1O

一15min。若胶粒未完全脱水再用乙腈脱水～次，弃去

乙腈液。将离心管置入真空离心蒸发浓缩器内，微加

热15rain使胶粒完全干燥。将50pJ新鲜配制的

10mmoVL DTY韵100mmol／L碳酸氢铵溶液加入离心

管内，使胶粒水化。在56℃加热30rain还原样品，弃

去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微

加热干燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙酰胺的

100mmol／L碳酸氢铵溶液，烷基化半胱氨酸残基上的

巯基。室温暗室中放置20 min，弃去上清夜，加入

50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac内干燥。加入2O l

胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使胶粒再水化，

加入1O一2o 碳酸氢铵溶液覆盖胶粒，37cI=保温1小

时后，放置过夜，所得溶液供质谱分析用。

3．2 电洗脱后在溶液中酶解 电洗脱是电泳后从凝

胶上回收蛋白质的经典方法。通常蛋白质量多于0．

O01 mmol。将含SDS的凝胶与MALDI TOF MS分析结

合，可分析亚mmol的蛋白质。Schuh macher等用无

SDS pH2．5的乙酸铵作洗脱缓冲液，电洗脱系统的极

性相反，蛋白质SDS复合物在原位解离，游离的蛋白

质迁移至阴极，用标准蛋白样品实验，回收率达25％

～ 56％ [引

。

3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用于质谱分

析，因为它的灵敏度低于凝胶内酶切。电转移时不是

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第2期 王海龙，等．质谱技术在蛋白质组学中的应用 233

所有的蛋白质都能有效转移，而且在印迹过程中蛋白

质可能丢失。另外从PVDF膜上提取酶切后多肽时效

率不高，提取时加Triton 100可以增加多肽的提取效

率，但去污剂干扰质谱鉴定 J。

3．4 印迹过程中酶切 1999年Bins等报道将固定有

胰蛋白酶的膜，置于凝胶和PVDF膜之间在印迹过程

中使蛋白质样品发生酶切，为了蛋白质完全酶切，印迹

过程需要特殊设计。印迹后的膜用基体溶液浸透后可

用MALDI TOF MS直接分析。该法的主要特点是印迹

过程中平行进行酶切，其灵敏度不如标准方法 J。

4 用肽质量指纹谱鉴定蛋白质

蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定

电泳后凝胶上的蛋白质。质谱技术已取代了生物化学

中经典的Edman降解技术¨。。，这是由于质谱技术能

进行高通量的分析，能分析蛋白质混合物，而且灵敏。

肽质量指纹谱方法最初由Henzel及其同事提

出¨ ，很快成为高通量蛋白质鉴定的选用方法。分析

时用MALDI TOF MS测定凝胶内酶切后多肽混合物的

质量，获得肽质量指纹图谱。蛋白质酶切后生成多肽

混合物，可以在蛋白质序列数据库内进行理论预测，并

对质谱实测多肽混合物与理论预测的数据进行比较，

质谱实测到足够肽段的质量与数据库中一个蛋白质理

论预测肽段质量匹配，蛋白质可明确鉴定_1 。

随着科学技术的进步，质谱也得到了快速发展，特

别是与生物技术的结合，开创了质谱应用的新领域。

质谱已成为生命科学研究中非常重要的工具。其研究

成果也将大大推动人类基因组的研究，并将使人类对

生命的本质，其发生发展过程的认识达到一个前所未

有新高度。

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