乙醇与蛋白质的沉淀和变性实验

蛋白质会发生沉淀现象。

乙醇在医学方面可做为一种消毒剂，乙醇作用于细菌细胞首先起到脱水作用，乙醇分子进入到蛋白质分子的肽链环节，使蛋白质发生变性沉淀；这种作用在70%的含量下显得更强。乙醇可导致蛋白质分子间易形成氢键。

定义：蛋白质变性就是在某些理化因素的影响下,蛋白质的空间结构发生变化,从而引起蛋白质理化性质和生物功能改变。

在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出,这种方法称为盐析.常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等.各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同,故可用于对混和蛋白质组分的分离.例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白,饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来,盐析沉淀的蛋白质,经透析除盐,仍保证蛋白质的活性.调节蛋白质溶液的pH至等电点后,再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好.盐析法分为两类,第一类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶.影响盐析的因素包括：蛋白质浓度、离子强度和类型、PH值、温度等.针对温度这一条,需要强调：在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加.但在高浓度下,蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降.在一般情况下,蛋白质对盐析温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行.

使用硫酸铵沉淀蛋白需要注意：硫酸铵中常含有少量的重金属离子,对蛋白质巯基有敏感作用,使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液,通入H2S饱和,放置过夜,用滤纸除去重金属离子,浓缩结晶,100℃烘干后使用.另外,高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH.

2.有机溶剂沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化；

有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出.该法优点在于：1)分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2)沉淀不用脱盐,过滤较为容易；3)在生化制备中应用比盐析法广泛.但是,在常温下,有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性.例如酒精消毒灭菌就是如此.因此,操作要求在低温下进行.有机溶剂的选择首先是能和水混溶,使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等.

3.等电点沉淀法——此法单独应用较少,多与其它方法结合使用；

两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低,不同的两性电解质具有不同的等电点,以此为基础可进行分离.如工业上生产胰岛素时

1.如果是醇溶蛋白,是不会有反应的,蛋白质不会沉淀.

如:醇溶谷蛋白

因为,这种蛋白质本身就是能溶解于醇的.因为醇,比如乙醇,其烃链属于疏水集团,而羟基属于亲水集团.蛋白质同样有疏水和亲水集团.因此,在蛋白质水溶液中加入醇.蛋白质亲水端与水相似相溶,而疏水端与醇相似相溶.因此,会形成稳定混合液体.

2.如果是不溶于醇的蛋白质,会发生变性而沉淀下来.

乙醇与水间氢键强于水溶性蛋白质与水间氢键.同时存在醇和水,醇会与蛋白质发生氢键作用,从而破坏蛋白质与水间氢键,造成蛋白质结构变化.从而fs了.

蛋白质含量，离子强度，溶液pH值，乙醇浓度，溶液温度。

1。蛋白质含量，愈高，共沉多；反之，分离愈彻底。当然有度。溶液太稀了，成本高。

2。离子强度：这与介电强度有关。

3。溶液pH值：调到目标蛋白等电点周围。

4。乙醇浓度：一般来说乙醇浓度多少，与目标蛋白的分子量有关：比如8%，可沉淀纤维蛋白原，20%可沉淀球蛋白，40%可沉淀白蛋白等等，当然，乙醇浓度与溶液pH值配合使用。加入乙醇不能过快，防止局部过浓。要边加边摇动。

否则，共沉多！或者局部变性。

5。溶液温度：必须低温，乙醇反应是个放热反应，如果温度高，可引起蛋白质变性，不可逆的变形。

这五变参数，要综合，动态的调整，可达到精确分离蛋白质的作用。

原因：加入高浓度的中性盐、加入有机溶剂、加入重金属、加入生物碱或酸类、热变性

少量的盐（如硫酸铵、硫酸钠等）能促进蛋白质的溶解.如果向蛋白质水溶液中加入浓的无机盐溶液,可使蛋白质的溶解度降低,而从溶液中析出,这种作用叫做盐析．

这样盐析出的蛋白质仍旧可以溶解在水中,而不影响原来蛋白质的性质,因此盐析是个可逆过程．利用这个性质,采用分段盐析方法可以分离提纯蛋白质．

2)蛋白质的变性

在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作作用下,蛋白质会发生性质上的改变而凝结起来．这种凝结是不可逆的,不能再使它们恢复成原来的蛋白质．蛋白质的这种变化叫做变性．

蛋白质变性后,就失去了原有的可溶性,也就失去了它们生理上的作用．因此蛋白质的变性凝固是个不可逆过程．

造成蛋白质变性的原因

物理因素包括：加热、加压、搅拌、振荡、紫外线照射、X射线、超声波等：

化学因素包括：强酸、强碱、重金属盐、三氯乙酸、乙醇、丙酮等.

蛋白质含量，离子强度，溶液pH值，乙醇浓度，溶液温度。

1。蛋白质含量，愈高，共沉多；反之，分离愈彻底。当然有度。溶液太稀了，成本高。

2。离子强度：这与介电强度有关。

3。溶液pH值：调到目标蛋白等电点周围。

4。乙醇浓度：一般来说乙醇浓度多少，与目标蛋白的分子量有关：比如8%，可沉淀纤维蛋白原，20%可沉淀球蛋白，40%可沉淀白蛋白等等，当然，乙醇浓度与溶液pH值配合使用。加入乙醇不能过快，防止局部过浓。要边加边摇动。 否则，共沉多！或者局部变性。

5。溶液温度：必须低温，乙醇反应是个放热反应，如果温度高，可引起蛋白质变性，不可逆的变形。

这五变参数，要综合，动态的调整，可达到精确分离蛋白质的作用。

其次，乙醇使得蛋白质的二级、三级、四级结构变化，但是不改变蛋白质的一级结构，也就是说，蛋白质还是原来的两性物质（既有酸性又有碱性，所以能够溶于酸和碱）。

好了

1号管有乙醇，还有缓冲液（缓冲液就是由酸碱组成的），1号管沉淀了，你要说明这是因为乙醇而不是缓冲液啊。

所以你需要二号三号管来证明，酸和碱都没有使蛋白质沉淀（因为变性的蛋白质被酸碱溶解了），而且中和之后就发现沉淀出现了，说明沉淀是因为乙醇而不是酸碱。

至于甲基红，是为了指示酸碱度，你不是要中和嘛，没有指示剂你怎么滴定？