为什么硫酸铵沉淀法纯化蛋白质中利用固体硫酸铵而不用硫酸铵溶液

硫酸铵固体会和氢氧化锂，氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铷，氢氧化铯，氢氧化锶，氢氧化钡以及氢氧化镭碱溶液发生反应，化学反应方程式如下：

普通条件下：

（NH4）2SO4+2LiOH=Li2SO4+2NH3·H2O

（NH4）2SO4+2NaOH=Na2SO4+2NH3·H2O

（NH4）2SO4+2KOH=K2SO4+2NH3·H2O

（NH4）2SO4+2RbOH=Rb2SO4+2NH3·H2O

（NH4）2SO4+2CsOH=Cs2SO4+2NH3·H2O

（NH4）2SO4+Sr（OH）2=SrSO4↓+2NH3·H2O

（NH4）2SO4+Ba（OH）2=BaSO4↓+2NH3·H2O

（NH4）2SO4+Ra（OH）2=RaSO4↓+2NH3·H2O

加热条件下：

（NH4）2SO4+2LiOH=Li2SO4+2NH3↑+2H2O（条件：加热）

（NH4）2SO4+2NaOH=Na2SO4+2NH3↑+2H2O（条件：加热）

（NH4）2SO4+2KOH=K2SO4+2NH3↑+2H2O（条件：加热）

（NH4）2SO4+2RbOH=Rb2SO4+2NH3↑+2H2O（条件：加热）

（NH4）2SO4+2CsOH=Cs2SO4+2NH3↑+2H2O（条件：加热）

（NH4）2SO4+Sr（OH）2=SrSO4↓+2NH3↑+2H2O（条件：加热）

（NH4）2SO4+Ba（OH）2=BaSO4↓+2NH3↑+2H2O（条件：加热）

（NH4）2SO4+Ra（OH）2=RaSO4↓+2NH3↑+2H2O（条件：加热）

硫酸铵会水解呈酸性,如果浓度大的话酸性也很强,这样蛋白质可能变性.所以要将硫酸铵慢慢加入血清,见好就收.

器材：试管、玻璃棒

操作：

1、将待测固体溶解在一定量水中

2、取溶液少量加入稀盐酸酸化，然后加入BaCl2溶液，产生白色沉淀，证明含有SO42-

3、取固体，与NaOH固体共同研磨，产生的气体能使湿润的红色石蕊试纸变蓝，证明含有NH4+

同时含有NH4+、SO42-证明是硫酸铵

2、直接根据饱和度表在蛋白溶液中加入适当重量的固体硫酸铵即可。

3、硫酸铵的饱和度随着温度有少许变化：

0度时，每升水可以溶解706.96克硫酸铵（此时重量百分比为41.42%,摩尔浓度为5.35 mol/L，比重1.2428g/cm3）。

25度时，每升水可以溶解769.05克硫酸铵（此时重量百分比为43.46%,摩尔浓度为5.82 mol/L，比重1.2449g/cm3）

至于从某一硫酸铵浓度调节到另一浓度，许多生化手册可以查到表，免去自己计算可能的不准确。

例如：《生物化学制备技术》苏拔贤主编（科学出版社），第58页、59页两个表分别为在25度和0度进行硫酸铵沉淀的表。

一,基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质.用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法.高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来.各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质.这种方法称之为盐析.盐浓度通常用饱和度来表示.硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广.

二,试剂及仪器

1 .组织培养上清液、血清样品或腹水等

2.硫酸铵（ NH 4 ） SO 4

3.饱和硫酸铵溶液（ SAS ）

4.蒸馏水

5.PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 )

6.透析袋

7.超速离心机

8.pH 计

9.磁力搅拌器

三,操作步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀.各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同.通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% .

（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）

1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中.用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 .此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L,25 ° C ）.

2.其它不同饱和度铵溶液的配制

（二）沉淀

1.样品（如腹水） 20 000 ′ g 离心 30 min ,除去细胞碎片；

2.保留上清液并测量体积；

3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中,终浓度为 1 ：1 （

4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 ° C ）,使蛋白质充分沉淀.

（三）透析

1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）.弃上清保留沉淀；

2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中.沉淀溶解后放入透析袋对

PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 ° C ）,每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨；

3.透析液离心,测定上清液中蛋白质含量.

四,应用提示

（一） 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白.

1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中,使浓度为 0.5:1 (v/v) ；

2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜（ 4 ° C ）；3.3000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）,保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ,再次离心得到沉淀.将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨；

4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ,再次离心得到沉淀.将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨；

5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效

（二）为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表 1 ）；硫酸氨沉淀法与层析 技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体.

向饱和食盐水中加入足量的碳酸氢铵固体，会有溶解度较小的碳酸氢钠晶体析出，该反应的化学方程式是NaClNH4HCO3=NaHCO3↓+NH4Cl，要以硫酸铵固体为原料制取较纯硫酸钾晶体，可以

向热的饱和硫酸铵溶液中加足量的氯化钾，有大量固体析出，趁热过滤，故填：

向热的饱和硫酸铵溶液中加足量的氯化钾，有大量固体析出，趁热过滤

．

（或向热的饱和氯化钾溶液中加足量硫酸铵，有固体析出，降温至20℃左右，过滤）