苯酚提取核酸，上清液少是为什么

苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

使用苯酚抽提细胞 DNA 时,苯酚的作用是使蛋白质变性,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而 DNA 溶于水相.

氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组 DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡 产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.

苯酚法提取rna的缺点细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。

将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。

RNA提取时，就变性剂的选择来说，CTAB（CTAB法）比异硫氰酸胍（RIZOL试剂法）和　SDS（改良热硼酸法）更有效。

就CTAB法来说，由于以CTAB为变性剂，同时加入PVP和β一巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等，然后再选择性地分离出RNA。

细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。

本实验采用的0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。

核酸检测有四种方式：

1、口咽拭子检测：通过口腔进入的方法采集口咽部标本，用灭菌棉拭子擦拭咽侧壁及咽后壁数次。做咽拭子之前，不要使用抗菌药物，采样前30分钟内请勿吸烟，喝酒，不吃口香糖等刺激性食物。

2、鼻咽拭子检测：通过鼻孔进入的方式采集鼻咽部标本，将拭子以垂直标方向插入鼻孔，拭子顶端到达鼻咽腔后壁时停留约15秒，轻旋3次。取样者可在侧方采样，暴露的风险较低。

3、深咳痰液检测：患者深咳后，将咳出的痰液收集在标本容器内。目前深咳痰液的检出率高于口咽拭子和鼻咽拭子。

4、肛拭子检测：用拭子插入肛门里面2-3cm，然后旋转四到五圈之后，拔出即可。整个过程大概10秒钟左右，不会有太大的不适感。反而相较于鼻咽拭子舒适度更高。

核酸检测的方法，有定磷法、定糖法、紫外线吸收法和荧光检测法。具体如下：

一、定磷法简单快捷，且灵敏度高，缺点是易受蛋白质和核苷酸影响；

二、定糖法灵敏度也高，但特异性差，且戊糖容易与其他物质产生反应，干扰结果；

三、紫外线吸收法适用于浓度大的核酸溶液，通常人体感染新型冠状病毒后，咽部所含的病毒量极少，所以一般不用此种方法检测；

四、荧光法是目前广泛被使用的检测法，对标本逆转录扩增，使病毒片段达到一定检测数量后进行检测，缺点是由于受采样标本、运输等多种因素影响，可能出现假阴性

氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取RNA时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离.DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和DNA脱离,DNA进入水相.但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离,否则DNA会释放到水相.不管有酚也好,没有酚也好,氯仿本身也对蛋白有变性作用,剧烈的震荡,很容易使得DNA的亲水基团,与水相接触.所以不要剧烈震荡.

异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾.

氯仿的作用有多个方面,一是作为有机溶剂变性蛋白,使其沉淀并通过离心除去,同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚,很多自己配试剂提的方法也用苯酚,抽提蛋白时也会用到苯酚）,苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去会损伤核酸,需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等）,起到一定除杂作用

通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25）,减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫,影响后续操作,不过个人经验感觉加不加没什么太大区别,也许是我的样品里蛋白不多吧

异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样.只不过用量少一点,0.6V~1V就够了,不像乙醇沉淀需要至少2V,一般需要2.5倍体积.在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀.不过感觉效果不如乙醇,偶尔会有沉淀不出来东西的时候

于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生性。

工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。

最近重新研读了分子克隆第三版，有一个有趣的小发现，好像过去没听人说过。一般测核酸浓度都是用260nm的光吸收值来决定，同时用260/280的比值来判断有无蛋白质污染。理想的比值是1.8~2.0左右。分子克隆第三版专门提到这种判断核酸纯度的办法是不可靠的。原因在于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多，即使有相当多的蛋白质污染，这个比值还是接近于理想的比值。另外，260/280比值尤其不能用于评判寡聚核甘酸的纯度，因为嘌呤的消光系数比嘧啶大好多，寡聚核甘酸嘌呤嘧啶组成很可能不平均，所以很可能出现很纯的样品260/280比值却比较小的情况。 

你所说的‘消光系数‘，是否就是吸光值的意思？如果你用连续波长测过核酸的吸光度时，就会发现，OD260,恰好是核酸吸光值最大的时候，从200-750,是一条曲线，260时是波峰，而280时，刚好是曲线下降到一半左右时的吸光值。而恰好280又是蛋白质的最佳吸收值。如果纯的核酸，那曲线就是标准的，260/280就是1.8-2.0之间，如果混有蛋白质，多肽，酚之类的杂质，那280时的吸收峰就变高了，曲线随之发生变形，而260时的吸收峰不变。就如你所说的“原因在 于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多”，因此260的吸收峰几乎不变。但280时却不一样。这时相反，核酸的消化系数比蛋白质小的多，因此，一旦有污染，280上升很快。因此260/280在有污染的情况下就会变小。所以，用260/280的方法，还是比较可靠的。当然更可靠的，就是用200-750的波长，连续扫描。直接观察核酸的整条曲线，那比光靠260,280两个吸收值，肯定要准确很多。其实平时在我们检测时，我们也会检测230,320,两个值。至于这两值的作用，我稍后再说。其实有230,260,280,320,这四个点。基本上也能确定下这条曲线的该一段的形状了。

A 260 / A 280 的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。（320差不多也就是那条曲线刚下降到0的时候）。所以，当我们检测260/280后，如果比值在1.8-2.0之间时，我们可以说其纯度可以，那OD260的值就有效。否则，OD260的值判为无效。你说的嘌噙与嘧啶的吸光值，确实没错。但一般情况下，我们测的都是基因组、tRNA，mRNA、cDNA，所以其CG含量都比较均匀。都适用于这种方法。然而，在测某些CG含量明显不均匀的情况下，比如人工合成的寡核苷酸、引物，在CG含量过大或者过小的情况下，我们就不能用260/280的方法了。不过一般自已合成的引物，都能保证纯度的，买来的引物，或者托公司合成的寡核苷酸，也不需要我们用OD值方法重新测一下。因为产品包装上写着多少个OD，序列长度，都非常详细，纯度也是有保证的。

当OD 260/ OD280值=1.8说明所提的DNA质粒的纯度比较高，所含的RNA或蛋白质污染很少，当 OD 260/ OD280值>1.8，说明有RNA污染，当OD 260/ OD280值<1.8时,说明所提的DNA中有蛋白质或者是抽提时用的苯酚未除净，楼主所体的质粒DNA的260/280在2.0左右，说明有一定的RNA污染，在提质粒DNA中，一般是在提完质粒后，加入TE溶液时加入一定量的RNA酶。抽提1.5ml大肠杆菌过夜菌液时，最后加入20ul的TE溶液时加入1.5ul浓度为10mg/ml的RNA酶，一般就可以完全去除质粒中所含的RNA污染

有关RNA的吸光度说明如下：260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.0之间，当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TEBuffer。