乳酸菌的纸层析实验该用什么指示剂，溴甲酚蓝还是溴甲酚紫

摘要：

〔目的〕探索用细菌学方法检测酵母浸出粉中维生素B族的存在。〔方法〕采用五种乳酸菌接种于含有被测的五种中外产的酵母粉培养基，用细菌学灵敏度、菌落计数和菌落直径测定的方法进行比较。〔结果〕经统计学处理，生长波度、菌落计数和菌落直径试验结果说明五种酵母粉之间有显著性差异，而灵敏度试验则未见显著性差异。〔结论〕酵母浸出粉中维生素B族生长因子的细菌学实验方法估计，可以参考生长浓度、菌落计数和菌落直径等综合性实

指标。

关键词：

乳酸菌；酵母浸出粉；维生素B族生长因子；生长浓度；菌数计数；菌落直径

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http://www.cnki.com.cn/Article/CJFD2002-RPGY200201006.htm

乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验

1 主题内容与适用范围

本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。

本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。

2 引用标准

GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂

3 术语

乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。

乳酸菌菌落总数：检样在一定条件下培养后，所得1mL检样中所含乳酸菌菌落的总数。

4 设备和材料

4.1 温箱：36±1℃。

4.2 冰箱：0～4℃。

4.3 恒温水浴：46±1℃。

4.4 电炉：可调式。

4.5 吸管：容量为1，10和25mL。

4.6 广口瓶或三角瓶：容量为500mL。

4.7 平皿：直径为9cm。

4.8 试管：18×180mm。

4.9 显微镜。

5 培养基和试剂

5.1 改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)。

5.2 改良MC培养基(Modified Chalmers培养基)。

5.3 0.1%美兰牛乳培养基。

5.4 6.5%氯化钠肉汤。

5.5 pH9.6葡萄糖肉汤。

5.6 40%胆汁肉汤。

5.7 淀粉水解培养基。

5.8 精氨酸水解培养基。

5.9 乳酸杆菌糖发酵管。

5.10 七叶苷培养基。

5.11 革兰氏染色液：按GB 4789.28规定执行。

5.12 3%过氧化氢溶液：按GB 4789.28规定执行。

5.13 蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 4789.28规定执行。

5.14 明胶培养基：按GB 4789.28规定执行。

5.15 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂：按GB 4789.28规定执行。

5.16 生理盐水：定量分装于三角瓶和试剂管内灭菌。

6 乳酸菌菌落总数的测定

6.1 检验程序

乳酸菌菌落总数检验程序如下：

（略）

6.2 操作步骤

6.2.1 以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL(或25g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1∶10的均匀稀释液。

6.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。

6.2.3 另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。

6.2.4 选择2～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。

6.2.5 稀释液移入平皿后，应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。

6.2.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养72±3h取出，观察乳酸菌菌落特征(见表1)，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10－4的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为乳酸菌的是4个，则1mL检样中乳酸菌数为：

6.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。

表1 乳酸菌在不同培养基上菌落特征

（表略）

7 乳酸菌的鉴定

对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。

7.1 菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24～48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。

7.2 乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。

7.3 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。

7.4 产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3。

表2 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应

（表略）

表3 乳酸的链球菌的鉴别表

（表略）

参考资料：http://www.hopebiol.com/asphtml/refere85.htm

采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法参照微生物鉴定实验指导

2.生长条件试验

(1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0. 85 、1. 20 和1. 71) (mol/ L)

(2)耐酸碱试验(p H :4. 3 、5. 7 、6. 8 、8. 4 、8. 6 和8. 7)

(3)温度梯度试验(温度: 10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃) 。

分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况。

3.生理生化试验

⑴过氧化氢酶测定

将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。

⑵葡萄糖产酸产气实验

在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和5%吐温-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示剂, 在培养基内放置一小倒管,分装试管置37℃培养24h, 经培养后,指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡,表示产气。

⑶淀粉水解实验

接种新鲜的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY基础培养基中,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照,分别在其中加入卢哥氏碘液.不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全。

⑷明胶液化实验

将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37℃培养,以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应

⑸甲基红（M.R）试验

接种实验细菌于PYG培养基，于37℃培养2天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液，如呈红色，表示阳性。

⑹乙酰甲基甲醇V-P实验

接种新鲜的实验菌种于培养基中, 37℃培养2天后,取培养液1mL在其中

加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性

⑺柠檬酸盐

取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上，适温培养3－7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性

⑻酪素水解试验

牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3－5株菌。适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固

⑼厌氧生长测定

将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性

(10)厌氧硝酸盐产气

接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油（凡士林和液体石蜡为1:1）封管，封油的高度约1厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。

观察结果：培养2－7d，观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生，表示反硝化作用产生氮气，为阳性反应。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡，则只能按可疑或阴性处理。

(11)石蕊牛奶的反应

牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况

(12)糖发酵实验

将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY基础培养基中,按表分装含5mL培养基的试管.分别取0.2mL,被鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中37℃培养24h,振荡培养。检测时取培养液少许置于比色盘内,同时取未加碳水化合物的PY培养液作为对照,滴加试剂比较颜色的变化,记录产酸的强弱.

附一些培养基：

①PY培养基（100mL）：蛋白胨1.0g,酵母提取物1.0g,无机盐溶液4.0mL[盐溶液成分:无水CaCl2 0.2g,MgSO4 20.0g ,K2HPO4 1.0g, ,KH2PO4 1.0g,NaHCO3 10.0g,NaCl 2.0g](将CaCl2和MgSO4一起溶解于300mL蒸馏水中,再加500mL蒸馏水,一边搅拌一边缓慢加入其他盐类.继续搅拌直到全部溶解,加蒸馏水定容至1000mL,混合后贮备于4℃)

②PYG培养基:PY在基础培养液内加入1.0g葡萄糖

③营养明胶 蛋白胨5g、牛肉膏3g、明胶120g、蒸馏水1000mL、pH6.8～7.0；加热溶解、校正至pH7.4～7.6，分装小管，121℃高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.8～7.0

④柠檬酸盐斜面培养基：柠檬酸钠 3g NH4H2PO4 1g MgSO4 0.2g

K2HPO4 1g NaCl 5g 琼脂15—20g 水1000mL 加热溶解后，调pH至7，再加入1.6%溴麝香草酚蓝指示剂10mL,培养基呈绿色，分装试管，每管5mL，121灭菌30min

⑤含硝酸钾的营养肉汤 加入2g硝酸钾入营养肉汤

4.16S rDNA 序列分析

这个LZ另外查好了，很多学问。

5.生长曲线

活菌计数方法：采用涂布法,进行菌落计数，每隔一段时间（2-4小时）测