提rna加0.5倍体积无水乙醇的作用

加完氯仿是用异丙醇析出RNA，我们是用75%的乙醇（用DEPC水来配）洗涤，乙醇是去各种离子的，无水乙醇不能去除离子，洗完之后一定要完全晾干，然后加入适量的DEPC水，在60度中水浴，直至溶解，如果部分沉淀不能溶解，那可能是含有其他物质，你可以将溶解的部分吸到另一个灭菌的管子中，这部分应该是会有溶解有RNA的。

不能溶于酒精

提取中都是用酒精洗脱盐离子使DNA或RNA沉淀下来

本身是不溶于酒精的

混有RNA的话基本是没有影响的

因为RNA比DNA要跑的快

跑完后会在胶的最前段

而且残留的RNA很大部分因为无处不在的RNA酶而降解

所以基本没问题

还有就是跑琼脂糖不用7%的胶

除非是特定大小片段的回收

否则基本用0.8%或1%的琼脂糖做分离就好了

氯仿: RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相.水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩.

接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，可去除所有残留的蛋白质和无机盐. RNA样品中如果含有无机盐, 有可能对后续实验操作中的一些酶促反应产生抑制作用。

因为在70%乙醇里DNA是不溶的，而盐离子却可溶。沉淀DNA时总会加入高浓度的盐,加盐的目的是破坏能使蛋白质保持稳定的两个因素，使蛋白和DNA分离并沉淀下来。而此时盐的阳离子会与DNA结合形成DNA-阳离子盐溶于溶液中，再用无水乙醇可以将DNA-阳离子盐沉淀下来，但这样DNA中就含有较多的盐离子，这会影响下一步实验的进行，所以要用70%乙醇洗涤DNA沉淀。

按照Invitrogen公司的Tizro说明书，在提取RNA过程中进行到加入75%乙醇后，可使RNA沉淀在4度保存一个月，在-20度保存一年。

1、以沉淀的形式保存在无水乙醇中；

2、以溶液的形式冻存在-80冰箱，并且尽量少冻融；

3、按试剂商提供的说法，保存在裂解液中可达2年；

一般这种方法用的比较少，因为每次提RNA都是一气下来，中间没有停顿的，除非一次提很多，上午时间不够用，可进行到加入乙醇未知，然后放到-20度冰箱，下午可继续进行。

背景

反复冷冻-解冻引起冰晶的多次重新形成，损坏了肌细胞的结构、失去肌纤维的完整性，加速了脂肪氧化。

冷冻畜肉在现代肉及肉制品加工工业中起着重要的作用, 是国家储备和调节肉食品市场的重要筹码, 也是肉类产品在进出口贸易和国内地区间流通的主要产品形态。相对与新鲜肉, 冷冻肉的低温条件能抑制大多数微生物生长繁殖、降低酶活性、延长货架期、增加肉制品消费的机动性和可支配性[ 2-3] , 但冷冻过程中会产生大小不一的冰晶。

如何去除RNA提取过程中的蛋白质污染提取RNA时如何去除DNA的污染的方法：注意实验室的标准化问题，注意污染的存在，同时严格按照说明书上的操作应该没有问题。发现DNA污染，用DNAseI消化1小时，37度离心取上清的时候，一定要小心不要取到中间的膜和下面的液体。直接加NaOH溶液与提取液混合搅拌,然后离心就可以了.因为RNA可溶于NaOH溶液,而DNA不可溶,离心后的上清液就不含有DNA了。RNA提取步骤：1.匀浆处理：①组织将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mlTRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。②单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。③细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2.将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。4.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。5.2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。6.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。7.2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。8.用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。注意事项：从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μgRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg，肾3-4μg，骨骼肌和脑组织1-1.5μg，胎盘1-4μg，上皮细胞8-15μg，成纤维细胞5-7μg。