实验室小白篇：细胞培养用的液体

童鞋，明白你的问题，很想帮你，不过我的经验有限，只有两点作为提醒：

1。非无菌状态的药品是不适合添加到细胞培养基中的。你最好的解决办法是购买一瓶细胞培养适用，经过厂商无菌处理的2-巯基乙醇，在保持无菌条件下分装和使用。

2。自行过滤来除菌的办法适用于很多水溶液，但是2-巯基乙醇有可能与你的滤膜存在兼容性的问题，必须仔细查看清楚相关资料。我的真实经历是使用PES(聚醚砜，一种常见的滤膜）过滤冻存细胞要用的DMSO二甲亚砜，结果二甲亚砜把滤膜都溶掉了。最后我不得不买了细胞专用的无菌二甲亚砜。

百度知道有这么一句话：“用CTAB法提取的DNA时，不褐变有些品种易发生细胞会产生一定的影响，但它依赖于特定物种的具体影响，以及特定的操作环境不同的方法而定。

“虽然百度知道一点点......但不同物种的信誉是不同的，效果确实是一个普遍的现象。

我做实验的感觉是，事情做好才是王道，准备协议仅供参考。例如，我有使用自己的脱节，与人民和其他文献中不一样的提食谱裂解液的蛋白质。如果你的这个实验室提取方法提取的DNA的质量确实不错，是可重复的，那么这样的工作。该机制的细节，或许物种特异性，氧化性不强，它也有可能是一些一般性质量你巯基乙醇的使用，或与其他的东西混合。如果您想验证，可以尝试购买另一家公司，当然，如果仅仅着眼于DNA，现在已经很不错了，你也不妨继续这样做。不是一个肤浅的认识，但也有其他的小学和中学。

植物学门外汉，一家之言，仅供参考。我希望实验成功=）

试剂配制

（一）母液

1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g

蒸馏水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl

7.4 约17ml

7.5 约16m

7.6 约15ml

8.0 约10ml

1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g

异丙醇 100ml

溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。

0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g

蒸馏水至 500ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO·12H2O（MW 358.14） 71.6g

蒸馏水至 1000ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

10％SDS SDS 10g

蒸馏水至 100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g

超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。

40％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g

甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g

超纯水至 100ml

溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

20％Tween20 Tween20 20ml

蒸馏水至 100ml

混匀后4℃保存。

（二）使用液

单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml

NaCl 0.438g

TritonX-100 0.5ml

蒸馏水至 50ml

混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。

（一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。至于其中每个要加多少量那就自己去算吧，因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了）

0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO 19ml

0.2 mol/L NaHPO4 81ml

NaCl 17g

蒸馏水至 2000ml

（如果用TBST进行洗膜的话，其实PBS用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可，500ml的浓缩液不到50元，很方便）

G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg

95％乙醇 50ml

磷酸 100ml

蒸馏水至 1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。

0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g

蒸馏水至 100 ml

高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g

0.15 mol/L NaCl 1ml

溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。

10％分离胶和4％浓缩校

10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）

超纯水 4.85ml 3.16ml

40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml

1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －

0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml

10％SDS 100 μl 50 μl

10%AP（过硫酸胺） 50 μl 25 μl

TEMED 5 μl 5 μl

加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）

还原型5XSDS上样缓冲液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml

二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g

SDS 0.5g

溴酚蓝 0.025

甘油 2.5ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 3.03g

甘氨酸（MW75.07） 18.77g

SDS 1g

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）

（可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）

转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g

Tris（MW121.14） 5.8g

SDS 0.37g

甲醇 200ml

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。

（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）

（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）

10X丽春红染液 丽春红S 2g

三氯乙酸 30g

磺基水杨酸 30g

蒸馏水至 100ml

使用时将其稀释10倍。

TBS缓冲液 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml

NaCl 8.8g

蒸馏水至 1000ml

（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）

TBST缓冲液 20％Tween20 1.65ml

TBS 700ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

封闭液 脱脂奶粉（国产，光明牌） 5g

TBST 100ml

最好现用现配。

洗脱抗体缓冲液 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 μl（通风厨里加）

SDS 2g

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml

超纯水至 100ml

配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。

（可用可不用）

显影液（5X） 自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）

米吐尔 1.55g

亚硫酸钠（无水） 22.5g

碳酸钠（无水） 33.75g

溴化钾 20.95g

补水至 500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）

定影液 自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠 240g

亚硫酸钠（无水） 15g

冰乙酸 12.6ml

硼酸 7.5g

钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）

加水定容至1000ml，室温保存。

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）

抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便宜，可以多

买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）。

化学发光试剂 分A和B两种试剂，有钱可以购买Amersham、Pierce或者Santa Cruz的，没钱的话碧云天的ECL也能凑合。

操作步骤

（一） 蛋白样品制备

（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3、 按1ml裂解液加10 μ PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4、 每瓶细胞加400 μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

6、 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。

（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100-200μ的裂解液，按照上述操作，直接用200μ裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）

（2） 组织中总蛋白的提取：

1、 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、 加400 μ单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。

3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3、 用枪洗干上清后，加100 μ裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

（二） 蛋白含量的测定

（1） 制作标准曲线

1、 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

3、 按下表在各管中加入各种试剂。

0μg

2.5μg

5.0μg

10.0μ

20.0μg

40.0μ

1mg/ml BSA

－

2.5μl

5.0μl

10.0μ

20.0μl

40.0μ

0.15mol/L NaCl

100μl

97.5μ

95.0μ

90.0μ

80.0μl

60.0μ

G250考马斯亮蓝溶液

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。

（2） 检测样品蛋白含量

1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。

2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。

4、 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μ待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。

（上述方法只是一家之言，可以自我变通，本人就不是按照上述方法进行的）

（三） SDS－PAGE电泳

（1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2） 灌胶与上样

1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶）

2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）

3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩

减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1-2次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（冲洗的话个人感觉可以使用5ml的针筒，当然操作不能太粗暴了）

6、 测完蛋白含量后，计算含20-50μ蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μ样品）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl，胶做得很好的话50μ也是问题不大的）上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。（本人心得：可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：1.EP管容易炸开，样品丢失、2.容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量）

7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）

（3） 电泳：电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。（本人为了加快速度，浓缩胶时用80-100V跑，到分离胶以后用150-200跑，结果也不错，总时间2h左右）电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker，Fermentas的0441和0671比较好，就是有点贵。一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好，不要局限于此说明）。

（四） 转膜

（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）（个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好）

（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上，注：个人感觉就垫1张滤纸也没问题呀），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上

另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教）

（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移3 h。（1.实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜）（2.硝纤膜建议使用0.22μ的小孔径膜，不容易转膜过头）（3.不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件）（4.转膜时电极方向注意是膜正胶负）

（6） 转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。（一般不需要做这步）

（五） 免疫反应（个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，节约抗体）

（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

（3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

（六） 化学发光，显影，定影

（1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

（2） 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。（如果使用柯达的显影定影液，时间很快的，显影结束后最好先用事先准备好的自来水洗一下片子，然后再放到定影液中进

行定影，这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）

应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

（七） 凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

1．细胞中的物质组成

(1)有机物：一般含碳，如糖类、脂肪、蛋白质、核酸等，能燃烧。

(2)无机物：一般不含碳，如水、无机盐、氧气、二氧化碳(虽然含碳，但属无机物)。

2．细胞膜控制物质的进出

一般地说，细胞膜能让有用的物质进入细胞，把其他物质挡在细胞外面，同时，还能把细胞内部产生的废物排到细胞外。

3．细胞中能量的来源

4．多莉羊的诞生：多莉羊与提供细胞核的母羊一模一样，说明细胞核控制生物的遗传和发育。

5．细胞核中被染成深色的物质是染色体，它由蛋白质和DNA组成。DNA上具有遗传信息的片段叫基因。

6．细胞是物质、能量、信息的统一体。

(1)细胞的生活需要物质和能量。细胞膜能够控制物质的进出。叶绿体能将光能转化成化学能，并将化学能储存在有机物中。线粒体能够将有机物中的化学能释放出来，为细胞的生活提供动力。

(2)细胞中物质和能量的变化非常复杂，细胞的控制中心就是细胞核。

7．生物体由小长大与细胞的生长、分裂和分化是分不开的。

8．细胞的生长：结果是细胞的体积由小变大，细胞数量不变，遗传物质不变。

9．细胞的分裂：结果是一个细胞分裂成两个细胞，细胞数目增加，遗传物质不变。

(1)步骤

①细胞核由一个分成两个。

②细胞质分成两份，每份各含一个细胞核。

③在原来的细胞中央形成新的细胞膜，植物细胞还形成新的细胞壁。

(2)特点：细胞核分裂时，染色体的变化最明显，它先复制再均分，此时，产生的两个新细胞的染色体数量和形态相同，新细胞与原细胞的染色体数量和形态也相同。

10．细胞的分化：结果是形成不同的组织(细胞)，遗传物质不变。

在发育过程中，通过受精卵分裂出来的细胞在形态、结构上发生变化，使不同细胞具有不同的功能的过程。

11．单细胞生物：身体只由单个细胞构成。如细菌、酵母菌、草履虫、衣藻、眼虫、变形虫。

(1)草履虫的结构图

与运动有关的是纤毛；

与呼吸有关的是表膜；

与摄食有关的是口沟；

与消化有关的是食物泡；

与排泄有关的是表膜、收集管、伸缩泡；

与繁殖有关的是细胞核；

与排遗有关的是胞肛。

(2)单细胞生物与人类的关系：有的有益，有的有害。

12．细胞是完成生命活动结构和功能的基本单位：单细胞生物可以独立完成生命活动；多细胞生物按照一定的结构层次构成生物体，完成生命活动

蛋白标签（Protein tag）技术是指利用基因克隆手段，将具有特定功能的多肽，蛋白质结构域，甚至完整蛋白质与目标蛋白融合在一起，以实现目标蛋白的表达纯化，检测和示踪等应用的技术。蛋白标签融合已经成为蛋白质研究中最常用的技术之一，下面我就为大家盘一盘这些常用标签的特点及应用。

蛋白标签根据其功能，大致可以分为检测标签、表达纯化标签和示踪标签三类。

蛋白质的检测方法包括质谱、酶活检测、免疫分析等，其中应用最为广泛的是免疫分析，常用的方法有：WB（Western Blot）、ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）、IP（Immunoprecipitation）等。免疫分析需要将目标蛋白作为抗原，注射动物，然后从免疫血清中分离抗体，根据抗原-抗体间的免疫反应进行特异性检测。这种方法最大的缺陷就是每更换一个目标蛋白就要制备一个对应的抗体，操作繁琐，成本昂贵。融合标签的使用，使蛋白质免疫分析走向通用化和便利化。我们将特定的标签与目标蛋白融合后，两者是共同表达的，通过检测融合标签，可以得到目标蛋白的表达情况。经过长期的研究，目前已经开发出一些比较成熟的检测标签，下面就挑几个来介绍一下：

1) HA

HA标签，属于小标签，共9个氨基酸，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，对目标蛋白的空间结构影响小, 可融合到N端或者C端，可购买商业化的Anti－HA抗体检测。HA标签常用于蛋白质印迹，免疫荧光和免疫沉淀实验，偶尔用于ELISA和ChIP分析。

2) His

His标签，也是小标签，多指6个组氨酸多肽，该标签对目标蛋白的空间结构影响极小, 可融合到N端或者C端，一般无需切除也不会对目标蛋白功能产生影响，可购买商业化的Anti－His抗体检测。His标签常用于蛋白质印迹实验。

3) c-Myc

Myc标签，包含人类原癌基因Myc的10个氨基酸区段，序列为EQKLISEEDL，可融合到目标蛋白N端或者C端。由于可获得高特异性抗Myc单克隆抗体，因此在Western印迹，免疫荧光和免疫沉淀实验中被广泛使用，但是很少用于蛋白质纯化。目前，市场上已有很多可供选择的商业化c-Myc抗体。

4) Flag, 3×Flag

FLAG标签，是目标蛋白中一种比较流行的短肽标签，序列为DYKDDDDK，可以与蛋白质的C端或N端融合。由于其包含肠激酶的识别位点（DDDDK），可方便去除，因此比较适合融合在目标蛋白N端。Flag标签与同类标签相比，更具亲水性，因此通常不会变性或使与其连接的蛋白质失活，常用于真核表达系统中目标蛋白的检测。目前已经开发出性能更好的3×Flag 标签，共22个氨基酸，分子量2.7KDa。3×Flag标签序列不是唯一的，有文献直接用3个Flag的串联重复，这不利于标签的去除，常用的序列为序列为DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。3×Flag可免疫原性和与抗体的亲和性得到极大增强，适用于真核生物低水平表达的蛋白的检测和纯化。目前，市场上已有很多可供选择的商业化Flag及 3×Flag抗体。

5) S

S标签，是一段来源于胰腺核糖核酸酶 A（RNase A）N 末端的短肽，氨基酸序列为KETAAAKFERQHMDS。 通常将 S-tag 构建到目标蛋白的 N 末端或 C 末端上，可以使用商业化的 S-tag 抗体进行免疫检测。此外，S-tag与S-蛋白质（同样来自于RNase A）之间有强烈相互作用，因此S-tag可用于蛋白质纯化，但由于洗脱条件较苛刻，为了获得有功能的蛋白质推荐用蛋白酶切割标签，然后洗脱目标蛋白。

6) T7

T7标签，一种源自T7噬菌体衣壳蛋白的表位标签，序列为MASMTGGQQMG，可融合到目标蛋白质的N或C末端，可购买商业化的Anti－T7抗体检测。T7标签常用于蛋白质印迹实验。

7) V5

V5标签，是猿猴病毒5（SV5）副粘病毒P和V蛋白上存在的小表位（Pk）短肽，序列为RNA聚合酶α亚基的95-108位氨基酸残基GKPIPNPLLGLDST，可被融合到目标蛋白的N或C末端。在文献报道中，大多将V5融合到目标蛋白C端，常用于哺乳动物和昆虫细胞表达系统蛋白质印迹，免疫荧光和免疫沉淀检测。

蛋白质纯化的方法有很多，离子交换、疏水层析、分子筛和亲和层析，其中纯化效果最好的无疑是亲和层析，它利用基质与蛋白标签间的特异性结合，以极高的得率和纯度获得目标蛋白。下面就挑几个常用的纯化标签来介绍一下。

1) His

His标签，大多是指六个组氨酸组成的融合标签，即His6，可融合在目的蛋白的C末端或N末端。His标签在蛋白质纯化领域可谓是“最靓的仔”，1987年，Hochuli等首次提出利用组氨酸标签纯化蛋白质，至今His标签在蛋白质纯化领域仍有最广泛的应用。组氨酸残基侧链与固定的镍离子有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)。标签的分子量小，只有约0.84KD，一般不影响目标蛋白的功能，此外His标签也可用于免疫检测，而融合His标签的蛋白免疫原性较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。

2) GST

GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签，是蛋白质纯化最常用的标签之一，GST是大标签，它是一个完整的蛋白质，分子量约26KD。GST一方面具有高度可溶性，能够增加目标蛋白的可溶性；另一方面它可以在大肠杆菌中大量表达，提高目标蛋白的表达量。因此被广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。GST标签融合蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶的亲和树脂进行纯化，用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱，可得到高浓度、高纯度融合蛋白。不过由于GST标签较大，通常需要将该标签切除，因此GST一般融合在靶标的N端。对于目标蛋白为活性酶的情况，如果经过活性验证确认GST对酶的活性没有影响，也可以保留标签。目前，也有很多商业化的GST抗体可用于对目的蛋白进行用特异性检测。

3) MBP

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签，是蛋白质纯化最常用的标签之一，也是大标签，分子量大小在40kDa以上，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加目标蛋白在细菌中的溶解性，尤其是真核蛋白，也可以增加融合蛋白表达量。MBP可以和交联淀粉亲和树脂结合，结合的融合蛋白可用10-20mM麦芽糖在温和条件下洗脱，得到高纯度、高浓度目标蛋白。MBP的特点与使用方法与GST十分相似，也有专门的商品化抗体进行检测。需要注意的是，MBP序列有两种形式，一种N端含有信号肽，适用于毒性蛋白的表达纯化，一般融合在N端；一种不含信号肽序列，可融合在N端或C端，多融合在N端。

4) CBD

CBD标签，一般是指来源于枯草杆菌的几丁质结合结构域，分子量约5kDa，该标签由NEB公司推出，结合其IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系统，用于（毒性）目标蛋白的表达与纯化。在IMPACT系统中，CBD和一个来源于酵母的intein蛋白质组成一个双效的融合标签。Intein是一个蛋白质剪接元件，类似于基因组中的内含子，intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，可以释放出与之相连的目的蛋白。也就是说融合表达产物在挂上亲和层析柱后只需要在低温（4℃）条件下用含DTT，或者巯基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脱，即可将目的蛋白洗脱，而将融合标签留在纯化柱上，而还原剂的小分子可以非常简单的去除。后来NEB推出了IMPACT-CN系统（即融合标签可以选择在目的蛋白的C端或者N端）和更加灵活便利的IMPACT—TWIN系统，感兴趣的可以自己去了解下。

（我使用过该系统，但效果并不像宣传的那么理想，原因有两个：1）因为要使用DTT作为切割剂，不适合含有内部二硫键蛋白质的纯化 2）融合基因在体内体外均存在较大的自剪切风险，在纯化毒性较大的蛋白质时，很难得到目标蛋白。）

5) Strep-tag

Strep标签，一般指Strep-tag II，是长度8个氨基酸的短肽，序列为WSHPQFEK，可以融合在目标蛋白N端或C端。Strep标签融合蛋白与链霉菌抗生物素蛋白柱上的基质特异性结合，D-生物素或其衍生物可作为洗脱剂，从而实现融合蛋白的特异性纯化。由于，抗体柱十分昂贵，Strep标签在蛋白纯化中并不常用。

6) Halo-Tag

Halo标签，是一种细菌脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的Halo-Tag配基有效地共价结合，分子量为33KDa，可融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系统中表达。

7) SNAP-tag

SNAP-标签，是一种人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的突变体，长度为182个氨基酸，分子量约19 kDa，可与任何目标蛋白质融合，并进一步用合适的配体（例如荧光染料）进行特异性和共价标记。将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。

8) SUMO

SUMO标签，是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-like modifier），在一级结构上与泛素只有18%的同源性，但两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现，SUMO可以作为融合标签，不但可以提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进目标蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。此外，使用SUMO蛋白水解酶，能识别完整的SUMO标签，并高效的把SUMO从融合蛋白上切割下来。该标签主要用于改善目标蛋白的表达，并非常用的纯化标签，要用于纯化可采用双标签。

9) NusA、TrxA、DsbA

NusA标签是一种反转录终止因子，能增加融合蛋白的溶解度和表达；TrxA标签是硫氧还蛋白，几乎存在于所有生物中，它即可能会增加融合蛋白的溶解度，方便地纯化细菌粗周质提取物，也有助于外源基因形成二硫键；DsbA标签是蛋白质二硫键异构酶，能够增加目标蛋白溶解度，有助于形成二硫键。

这三种标签，主要用于改善目标蛋白的表达，本身不用于纯化，必须与另一个亲和标签联用方可实现蛋白质纯化。而且这三种标签均具有细胞周质定位作用，因此一般融合在目标蛋白N端。这三个都属于大标签，可能会影响融合蛋白的性质，一般来说纯化后需要去除。

示踪标签主要是指利用标签本身的荧光或者催化底物发射荧光或者可见光，来检测目标蛋白在生物体内定位、转移、互作的情况。示踪标签一般分子量较大，需要在标签与目标蛋白之间加Linker序列，避免两个蛋白相互影响各自的功能。示踪标签可与检测标签联用，用于目标蛋白的检测分析，也可与纯化标签联用用于后继纯化。

1) GFP、EGFP、YFP

GFP（Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白）标签含有 238 个氨基酸，分子量约为 26.9 KDa，在维多利亚多管发光水母中发现的，在紫外线的照射下会发出绿色的荧光的蛋白，与靶蛋白融合后不会显著地影响天然蛋白质的组装和功能。EGFP 标签是增强型绿色荧光蛋白，与 GFP 相比，具有更高的折叠效率（由于正确折叠的蛋白质比例更高而增加的荧光），荧光强度更强、荧光性质更稳定。YFP（Yellow Fluorescent Protein ，YFP）标签，可以看做绿色荧光蛋白的一种突变体，其荧光向红色光谱偏移。这些标签与目标蛋白融合后，可以通过激光共聚焦显微镜，观察融合蛋白在生物体内的情况，常用于亚细胞定位、荧光共定位分析、在体荧光成像等实验。示踪标签可以加在目标蛋白的N端或C端，这个要视具体的情况而定，比如细胞定位示踪，如果定位序列位于目标蛋白N端，标签就要加在C端；如果定位序列位于C端，标签就要加在N；如果定位序列位于中间，可以加在N端或C端。

2) 萤光素酶

萤光素酶（Luciferase，Luc）常作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶，他们可以催化荧光素底物发射荧光，作为示踪标签常用于活体成像、药物分析等领域。携带荧光素酶标签（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大小鼠体内，之后注入荧光素底物，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

3) Gus

Gus标签，是细菌β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase），能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，初始产物并不带颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝染料，此靛蓝染料使具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色，可用肉眼或在显微镜下观察到。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因。用作融合标签时，gus标签可放在目标蛋白的N端或C端，所产生的融合蛋白一般仍具有GUS活性，这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件。

当然不是，几乎任何标签都可以作为检测标签。不过上面这些标签应用比较广泛，检测灵敏度较高，对应抗体、试剂等也比较成熟，是最为常用的检测标签，在加检测标签时，可以作为首选。

当然也不是，检测标签、纯化标签、示踪标签，在功能上没有绝对的界限，所有的检测标签也可以用于纯化，只不过需要先制备对应的抗体固定到纯化基质上，比如S标签需要S蛋白固定到纯化树脂上，这就需要购买专门的纯化柱料，十分昂贵。当然也可以采取通用的做法，比如通过protein A吸附抗体，再利用抗体吸附融合的目标蛋白，但是这样做纯化效率可能不太高，吸附能力也有限，而且成本较高（protein A柱料的价格是Ni-NTA柱料的5-10倍），虽然这种方法可以得到极高的纯度，但并没有被普遍采用。

标签选好了，那到底是该加在N端还是C端呢？在较多的报道中，标签一般加在目标蛋白的C端，因为蛋白质折叠是从N端开始的，加在N端有被目标蛋白包埋的风险。但是，目前没有统一的标准，要具体情况具体分析，最好参阅相关文献。

一般检测标签都是小标签，对目标蛋白的功能与结构影响不大，N端C端皆可。需要注意的是采用双标签的情况，如果是两个小标签，那就一边一个，一般不建议串联两个不同的标签，比如一个3×Flag检测标签，一个His纯化标签，那就应该把3×Flag放在N端，His放在C端，因为纯化之后大概率需要切除3×Flag，如果两者交换位置就无法实现这样的目的。

His标签是应用最广泛的标签，既可以用于纯化也可以用于检测，而且大多数情况不需要切除，加在N端存在提前终止翻译和无法终止翻译的可能，产生的副产物不利于分离纯化；加C端时存在次级翻译起始的可能，产生的副产物也不利于分离纯化，双端His有利于目标蛋白的准确检测与纯化，但可能影响酶的活性。

纯化标签分子量较大，多数情况下要被切除，因此一般放在目标蛋白N端，检测标签放在C端，如过必需将大的纯化标签放在C端，检测标签可放在目标蛋白N端或者融合蛋白C端。但检测标签不能放在目标蛋白与纯化标签之间。

对于GFP标签，大多用于目标蛋白的细胞定位，应此标签的位置就由定位序列位置决定，定位序列在C端，GFP就应该放在N端，检测标签应该放在GFP的N端；反之，GFP应放在C端，检测标签放在GFP的C端。

当融合标签对目标蛋白的功能与结构没有影响时，不需要切除融合标签，这不是只针对小标签，大标签如GST、MBP等也是如此，NEB公司纯化的一些核酸工具酶就是融合了MBP标签的，我曾融合表达了MBP-APOBEC3A，MBP并不影响APOBEC3A的C→T活性，基因编辑技术中的AE和CE点编辑系统，就是基于Cas蛋白与APOBEC蛋白各自的功能实现的。两者分子大小相差极大但功能互不影响，就是因为各自的功能结构域折叠比较稳定，且无蛋白质间相互作用。如果融合标签与目标蛋白也满足这种关系，基本是不用去除标签的，不过这种影响是不可预料的，可以参考相关文献或者做预实验确定。

常用的去除蛋白标签的蛋白酶，及其识别序列如下表。

[1] Protein tag[维基百科], https://en.wikipedia.org/wiki/Protein_tag

[2] Kimple M E, Brill A L, Pasker R L. Overview of affinity tags for protein purification[J]. Current protocols in protein science, 2013, 73(1): 9.9. 1-9.9. 23.

[3] Marintcheva, B. Viral Tools for Protein Expression and Purification. Harnessing the Power of Viruses, 2018, 103–131.

[4] Terpe, K. Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 60: 523–33.

[5] Nilsson, J. et al. (1997) Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins. Protein Expr. Purif., 1997, 11: 1–16.

[6] Malhotra A. Tagging for protein expression[M]//Methods in enzymology. Academic Press, 2009, 463: 239-258.