甲苯胺蓝的介绍

中文名称: 甲苯胺蓝

2,2'-[(9,10-二氢-4,8-二羟基-9,10-二氧代-1,5-蒽二基)二亚氨基]双(5-甲基苯磺酸)二钠盐

中文别名：氯托洛宁托洛氯铵

英文名称: Toluidine blue

Benzenesulfonic acid, 2,2'-[(9,10-dihydro-4,8-dihydroxy-9,10-dioxo-1,5-anthracenediyl) diimino]bis(5-methyl-, disodium salt

Dimethyl toluth ionine, chloride

CAS: 92-31-9

EINECS号：202-146-2

分子式: C28H20N2O10S2·2Na

分子量：305.8256 (一)1.甲苯胺蓝液

甲苯胺蓝0.5g蒸馏水定容至100ml

2.冰醋酸液

冰醋酸0.5ml蒸馏水定容至100ml

染色步骤

1.组织切片常规脱蜡至水

2.入甲苯胺蓝液30min

3.稍水洗

4.入冰醋酸液分化，直到胞核和颗粒清晰。

5.稍水洗，用冷风吹干

6.二甲苯透明，中性树胶封固

(二)

①切片脱腊至水。

②蒸馏水浸洗3次。

③0.1%甲苯胺蓝液浸染10min。

④水洗，洗去多余染液。

⑤各级酒精脱水。

⑥二甲苯透明，中性树胶封固。

试剂的配制

称取0.1g甲苯胺蓝，溶于100ml 0.1M醋酸盐缓冲液中，置室温5天后，即可使用染液于室温下可保存3个月，若放于4℃冰箱则可保存半年左右，但该液的染色效果在早期为最佳，若染液存放时间较长，则染色偏淡，应适应延长染色时间。

甲苯胺蓝 是常用的人工合成染料的一种属于醌亚胺染料类，是碱性染料， 甲苯胺蓝 中的阳离子有染色作用，组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色，可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，可用于尖锐湿疣的初筛及肥大细胞的检测。不推荐用于软骨、胃粘膜等难染组织的染色。

肥大细胞的染色:

（1）组织脱蜡至水。

（2）蒸馏水浸洗2-3次。

（3） 甲苯胺蓝染液 染20-30min。

（4）稍水洗，洗去多余染色液。

（5）95%酒精分色，在镜下控制分色效果。

（6) 用100%酒精脱水。

（7） 二甲苯 透明， 中性树胶 封片。

肥大细胞染色结果：肥大细胞颗粒呈红紫色，胞核呈蓝色。

细胞涂片染色 ：

（1）细胞涂片后，立即放入95%的乙醇中固定，取出放在纸巾上。

（2）滴加1～2滴稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。

（3）后将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。

（4）无需干燥，直接镜检。

细胞涂片染色结果：细胞核、淋巴细胞呈深蓝色；核仁呈紫红色；红细胞呈橘红；细胞质、单核细胞呈淡蓝色。

原位杂交染色 ：

（1）用蒸馏水或去离子水稀释到相应的浓度，凭经验一般稀释比例大于1:10。

（2） 玻片在稀释好的染色液中短暂浸泡。

（3） 在蒸馏水或去离子水浸泡数次。

（4） 按需求进行压片固定。

神经元细胞的染色：

（1）将载有细胞的玻片取出放入4％多聚甲醛中固定1h左右；

（2）到时间后取出用PBS冲洗1～2次即可；

（3）然后加入提前预热的1％甲苯胺蓝溶液，在50度左右的气浴或水浴中染色20～30min；

（4）用梯度酒精已次脱水，分别为75％、90％、100％，也可自定梯度；

（5）在镜下控制分色效果，这一步不太好掌握；

神经元细胞染色结果：可见尼氏小体深蓝色颗粒，细胞核呈淡蓝色，背景基本无色。

北京索莱宝科技有限公司 自产产品 1%甲苯胺蓝染色液 ，货号为 G1220 ，主要用于生化实验中肥大细胞的检测。

相关产品：

G8590 中性树胶

S1080 防脱载玻片

P1110 4％多聚甲醛

P2100 10×多聚赖氨酸

甲苯胺蓝染色，软骨呈鲜艳的紫色（紫红色），其他为浅蓝色，能够清楚地显示软骨形态潮线等结构，观察软骨组织是否有损伤。

甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种属于醌亚胺染料类，是碱性染料，甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用，组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色，可染细胞核使之呈蓝色。

注意事项

1、第一次使用本试剂时建议先取1-2个样品做预实验。样品数量很多时，可使用染色架和染色缸，以便于操作。

2、本产品为1%浓度水溶液，具体使用浓度可自行稀释。

3、由于温度对染料的溶解度与着色力有很大的影响，若快速染色，当室温较低时，可以适当加温。

以上内容参考：百度百科-甲苯胺蓝

概要介绍如下:

一,______ 核酸(DNA和RNA)

(一)__ 化学特性

1.分布: DNA (细胞核内)

RNA(核仁10% 细胞质-核糖体90%)

2. 分子结构:戊糖 + 磷酸 + 碱基

特点:① 大量的磷酸基团→酸性

(嗜碱性的基础)

② 戊糖—被盐酸水解→醛基

(成为Feulgen法显示核酸的基础)

② 戊糖—被盐酸水解→醛基 (成为Feulgen法显示核酸的基础)

③ 可以完全水解或部分水解

④ 可以用RNAase或DNAase消化

[ 对照实验(—)]

_

(一)__ 显示方法

1. 福尔根(Feulgen)反应显示DNA

[ 原理 ] 在60℃温度下,将DNA用1N盐酸水解,DNA双链打开成单链,先释出碱基,然后脱氧核糖释出醛基,该醛基与Schiff氏液形成紫红色沉淀.

[ Schiff试剂显色原理 ]

碱性品红 亚硫酸 → 白亚黄酸

(无色试剂,称为Schiff试剂)

[方法]

固定剂的选择可用一般的组织学固定液,常

用Carnoy固定液.

Carnoy固定液:

纯酒: 氯仿: 冰醋酸 = 6:3:1

(60ml) (30ml) (10ml)

恒冷箱切片机的具体染色步骤如下:

⑴ 切片固定在冰醋酸与纯乙醇(1:3 V/V)

中10分钟.

⑵ 由乙醇降至蒸馏水中.

⑶ 用1N盐酸浸泡.

⑷ 放入预热到60℃的1N盐酸中,留6分钟.

⑸ 放入室温的1N盐酸中.

⑹ 放入Schiff液试剂,保持在暗处,60分钟

⑺ 用新配制的SO2水浸洗3次(脱掉未反应

的Schiff液).

⑻ 蒸馏水浸洗净(必须用蒸馏水→洗净无色品红,

否则,残留试剂→有色品红).

⑼ 脱水透明,封固.

结果:核内DNA染为红紫色.

对照:仅改变第4步为1N盐酸,室温15分钟→(-).

[ 注意事项 ]

⑴ 不用醛类固定剂如Bouin,戊二醛,丙烯醛等.

常用Carnoy液,甲醇等.

⑵ 控制水解时间,不同的固定剂用不同的时间,

如:Carnoy 8分钟Genker 5分钟

Susa 18分钟 ★ 最适条件应自行试验.

⑶ 控制温度,一般1N盐酸60℃

如果5N盐酸18～25度.

⑷ 保证Schiff试剂的纯净度.

⑸ SO2要新配制,除去多余的 Schiff液宜用之.

⑹ 必须对照.

2._ 显示核酸的其它方法

⑴ Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法

⑵ 甲绿派若宁Methy green-Pyronin显示DNA和

RNA法

⑶ 菊花青铬明矾(GC)显示核酸法

⑷ 丫啶橙Acridine Orange显示DNA和RNA法

⑸ 核酸提取法

_一,______ 蛋白质(Protein)

_

(一)蛋白质的分子结构

蛋白质的基本单位是氨基酸,肽键将不同的氨基酸结合在一起,除氨基和羧基之外,还含有其它基团,如:—羟基,硫氢基,二硫基等.依其结构特点可分为:酸性氨基酸 和碱性氨基酸 芳香族氨基酸:苯丙氨基酸,酪氨基酸杂环类氨基酸:组氨基酸,色氨基酸,亚氨基酸,脯氨基酸,羟脯氨基酸.

_

(二)目前应用

1._ 用于蛋白质的一般定性

① 确定是否为蛋白质

② 确定蛋白质的酸碱性

③ 显示蛋白质的特殊基团

2._ 用于蛋白质功能定性和定位

_(三)染色方法

目前,研究蛋白质功能定性和定位时多用酶

组织化学法,配体—受体结合法,免疫组化法以

显示特殊的蛋白质.这里仅介绍一般的染色方法.

1.四氮化联邻茴香胺法

(Tetra-azotized-o-anisidine)

[ 应用 ] 广泛应用于显示酶的活性

[ 原理 ] 芳香伯胺与亚硝酸作用,在低温下(<

5℃)可生成重氮盐,此即重氮反应.重氮盐可

与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物.上

述反应必须在酸性条件下进行.

本实验,联邻茴香胺在酸性,低温条件

下与亚硝酸作用生成四氮盐.四氮盐有两个

重氮盐,其中一个重氮基在碱性条件下与所

要显示的组氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯环结

合产生偶联反应,另一个重氮基与酚类或奈

类发生偶联反应以增色.因此,可以用生成

的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量.

[ 方法 ]

1._ 四氮盐配制

⑴ 天平称取联邻茴香胺0.25g(有毒,通

风橱内进行).

⑵ 在冰浴下,加入已预冷8%盐酸10ml,

玻璃搅拌,促其溶解,混合后为悬浊液.

⑶ 称NaNO2 0.15g溶于1ml蒸馏水中(冰浴

下).

⑷在冰浴下,将配好的NaNO2溶液分三次倒入邻联茴香胺悬浊液内,每次倒入都须玻棒搅动,因产生NO2可有黄烟冒出,至黄烟停止再倒下一次液体.放入冰箱(4℃)内,约20分钟,待溶液变为黄色.

⑸倾出上清液,勿将沉渣泛起,弃去沉渣.

⑹用NaHCO3细粉(约0.5～0.6g)逐渐加

入上清液内,边加边搅拌(冰浴下).

⑺以刚果红试纸测中和点,待试纸不变蓝即达到中和.收集于标本瓶(或广口瓶)内,置冰箱备用.此液不稳定,置冰箱内可保存两周,若变为橘红色则失效.

_

2._ 偶氮反应

—Carnoy固定的大鼠肝,肠等石蜡切片.

⑴ 切片脱蜡至水.

⑵ 将切片放入下列溶液中(在冰浴中至2～3℃),

浸染10分钟.

用前配制:

四氮化联邻茴香胺溶液 4ml

0.1巴比妥缓冲液 (pH9.2) 20ml

24ml

⑶ 入1N盐酸(冰浴中2～3℃)浸洗10秒,多余盐

酸以滤纸吸干.

⑷ 入H酸饱和液,浸染30分钟(冰浴或冰

箱内).

H酸饱和液配制:H酸 0.4g

0.1M巴比妥缓冲液 20ml

(pH9.2) 过滤后使用!

⑸ 蒸馏水冲洗,脱水,透明,封固(树胶)

[ 结果 ]

酪氨酸,组氨酸,色氨酸染成红棕色(+)

※ 0.1M巴比妥钠50ml配制

① 分析天平称巴比妥钠(MW=206.18)

1.0309g

② 于量瓶内+蒸馏水50ml至刻度即可.

0.1M巴比妥缓冲液,pH9.2(20ml)配

制: 0.1M巴比妥钠 19.1ml

0.1N盐酸 0.9 ml

20 ml

2.其它的显示蛋白质的方法

⑴ 米朗反应(Millon Reastion)→显示酪氨

酸的方法

酪氨酸→羟苯基 亚硝酸 →亚硝基苯+Hg→有色物

注:胶原蛋白不显色,其它蛋白质都显色(+)

⑵二硝基氟苯Dinitro—fluoro—benzene (DNFB)法

DNFB与—NH2,SH和酪氨酸产生弱有色反应,

可被偶氮染料加强.

⑶ 酪氨酸重氮化偶联反应

⑷ 蛋白质硫氢基DDD法(固定时避免

氧化剂)

⑸ 铁—铁氰化钾反应显示SH基

⑹ 高甲酸阿尔辛蓝显示SS基法

⑺ 免疫荧光法显示蛋白质

三,碳水化合物

中性多糖——糖原

碳水化合物 酸性多糖——硫酸软骨素 A,B,

C,肝素,硫酸角

(组织中—多糖类) 质素,透明质酸等

蛋白多糖——粘蛋白,唾酸粘蛋白

糖 脂——脑苷脂类

※ 组织中糖的种类较多,因此,要特异性地显示各种

糖类必须用抑制和酶水解来对照实验.

本章仅以高碘酸雪夫法(PAS法)说明之,其它的

方法还有Alcian blue法,甲苯胺蓝异染性染色法等.

高碘酸雪夫法 Periodic—Schiff(PAS)method

[ 原理 ] 高碘酸为强氧化剂,它可以氧化多糖

分子内1,2—乙二醇(顺式和反式)而

产生醛基,此醛基再与Schiff试剂结合即

产生红 紫色.

[ 方法 ] 改良的McManus(1946),高碘酸雪夫法

标本:

① Carnoy固定的大白鼠肝,肾,肠石蜡切片

② 大白鼠肝横冷箱切片(未固定)

[ 步骤 ]

(1) 切片脱蜡入水(横冷箱切片免)

(2) 入0.5%高碘酸水溶液,室温,2～5分钟

(3) 蒸馏水涮洗

(4) 入Schiff试剂,洗3次,每次2分钟

(5) 入SO2水中,洗3次,每次2分钟

(6) 自来水洗5～10分钟

(7) 蒸馏水稍洗

(8)入Mayer氏苏木精副复染核1分钟

(9) 自来水5分钟,换蒸馏水

(10)脱水,透明,封固

[ 结果 ]

PAS(+)→红紫色或红色核→蓝色

Carnoy固定,糖原原位定位不佳,有

移位现象.

[ 对照 ]

① 用唾液酸淀粉于37℃消化20～30分钟.

② 苯甲酰或乙酰化法作对照(抑制法)

[ 注意事项 ]

①必须按照规定配方配制试剂,按规定的时间 反应.以避免非特异反应.例如:入高碘酸水溶液时间不宜过长,否则非特异着色.

②多糖大多都易溶于水,固定时应避免扩散或移位.

冰冻切片+苦味酸福尔马林→固定→避免扩散或移位.

③注意溶液的pH值:高碘酸液的pH不应超过5.

④注意温度.反应宜在<25℃的室温下进行,否则可氧化醛基为羧酸.

⑤高碘酸溶液的浓度宜控制在0.5%～1%(0.02—0.1M)浓度过高则会发生非特

异反应.

⑥为充分显示多糖中的糖原,可在过碘酸

中加入5%醋酸或纯乙醇固定,但往往有

溶解和扩散.

⑦为阻止胶原纤维和网状纤维阳性反应,

可使用还原液,于使用Schiff液之前.

[ 分析结果 ] PAS反应阳性物质:糖原,中

性粘蛋白,中性唾液性粘蛋白.

四,脂类

[ 组织中的脂类 ]

单纯脂类 脂肪酸

醇的化合物(如:甘油三脂等)

复合脂类 磷脂(卵磷脂,脑磷脂)

脂类 鞘磷脂

糖脂(脑苷脂,神经苷脂)

衍生脂类 胆固醇

肾上腺素

性激素

[ 显示脂类的基本原理 ]

用易溶于脂类的染料,使之溶于所检

的脂质(如脂滴)中,使组织内的脂类着色.

[ 常用方法 ]

苏丹黑B法,油红O法,硫酸尼罗蓝法

[ 基本要求 ]

⑴ 不用石蜡切片.

⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好.

⑶ 方法:

① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属偶

氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏

丹黑 ,油红O等.

② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸.

③ 选择性提取法(对照)

实验举例:苏丹黑B法

[ 原理 ]

苏丹黑为偶氮染料,具有脂溶性,可

溶于无水酒精,但不溶于水(常用70%酒

精饱和液).当组织切片入染液时,苏丹

黑B便离开染液而溶于组织内的脂质(如脂

滴中)使组织内脂类着色.

标本:

兔肾上腺和睾丸横冷箱切片,10μm厚,不

固定(或用10%Formalin固定10分钟后水洗).

[ 方法 ]

① 入蒸馏水洗

② 于70%乙醇内涮洗

③ 入苏丹黑B 70%B饱和液,染5～10分钟

④ 于50%酒精内浸洗

⑤ 蒸馏水中洗

⑥ 入Mayer苏木精(复染细胞核)1分钟

⑦ 自来水冲洗5～10分钟

⑧ 入蒸馏水

⑨ 甘油明胶(或Apathy糖胶)封固

[ 结果 ] 细胞内脂滴均呈黑色