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DNA纯化的方法

无情的鸡
重要的太阳
2023-01-01 08:42:51

DNA纯化的方法?

最佳答案
失眠的黄蜂
勤恳的大白
2025-07-19 19:31:52

DNA纯化

首先利用琼胶电泳将不同分子量的DNA片段分开,将某一特定分子量区域的琼胶切下,利用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出并浓缩.

实验材料

( 6X gel-loading dye:15% Ficoll 400, 0.25% bromophenol blue,

0.25% xylene cyanol

( 紫外光箱

( 下列试剂来自GeneAid公司所售的Gel/PCR Fragment Extraction Kit:

* DF Buffer

* Wash Buffer

* Elution Buffer:10mM Tris-HCl(pH8.5)

* DF Column

* 2ml Collection Tube

实验步骤

A.将欲分离之DNA混合物以0.7%琼胶电泳分离.

B.电泳后,将琼胶置於紫外光箱上观察,把含有欲纯化之DNA片段的琼胶部位切下.

C.将步骤B的琼胶以蓝色微量吸管尽可能戳碎.

D.加入500ml DF buffer,55oC作用10分钟,每2-3分钟摇晃数次,直至琼胶完全溶解.

E.将步骤D琼胶溶液全部吸入DF Column,并套上Collection Tube(收集过滤液).

F.8000rpm离心1分钟,将过滤液倒掉.

G.加入500ml Wash Buffer,8000rpm离心1分钟,过滤液倒掉.

H.14000rpm离心2分钟.

I.将DF Column转移至上另一乾净的微量离心管.加入15ml Elution Buffer,室温静置2分钟.

J.14000rpm离心2分钟,微量离心管内之液体即为纯化的DNA片段.

K.取0.5ml纯化的DNA加入4.5mlDDW及1ml 6x DNA loading dye,跑0.7%琼胶电泳,与marker比较,估计DNA的浓度.

最新回答
笑点低的微笑
眯眯眼的咖啡豆
2025-07-19 19:31:52

一.酚抽提法:先用蛋酶K、SDS破碎细胞,消化蛋白,然后用酚和酚-氯DNA大小为100-150kb

二.甲酰胺解聚法:破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

三.玻璃棒缠绕法:用盐酸胍裂解细胞,将裂解物铺于乙醇上,然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅,DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

四.异丙醇沉淀法:基本同1法,仅用二倍容积异丙醇替代乙醇,可去除小分子RNA(在异丙醇中可溶状态)

五.表面活性剂快速制备法:用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞,然后用蛋白酶K或酚去除蛋白,乙醇沉淀或透析。

六.加热法快速制备:加热96℃-100℃,五分钟,然后离心后取上清,可用于PCR反应。

七.碱变性快速制备:先用NaOH作用20分钟,再加HCI中和,离心后取上清,含少量DNA。

名词解释:

DNA

DNA,全称Deoxyribonucleic acid,中文名为脱氧核糖核酸,是一种长链聚合物,组成单位称为四种脱氧核苷酸,由碱基,脱氧核糖,磷酸组成。DNA是染色体的主要化学成分,同时也是基因组成的,有时被称为“遗传微粒”。DNA是一种分子,可组成遗传指令,以引导生物发育与生命机能运作。主要功能是长期性的资讯储存,可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的指令,是建构细胞内其他的化合物,如蛋白质与RNA所需。带有遗传讯息的DNA片段称为基因,其他的DNA序列,有些直接以自身构造发挥作用,有些则参与调控遗传讯息的表现。

物理性质

DNA

DNA是高分子聚合物,DNA溶液为高分子溶液,具有很高的粘度,可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线(260nm)有吸收作用,利用这一特性,可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时,吸光度升高,称为增色效应;当变性核酸重新复性时,吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性,即DNA双链碱基间的氢键断裂,双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。

优雅的翅膀
暴躁的黄蜂
2025-07-19 19:31:52
质粒DNA的提取、纯化和电泳检测

摘要

本实验通过碱变性法提取E.coli DH5α(pUC19)的质粒DNA,并且通过一系列的分离纯化技术将其质粒DNA与染色体DNA、RNA、蛋白质等杂质分开从而得到纯化的质粒DNA分子。通过琼脂糖凝胶电泳可以通过DNA条带的位置来大致判断其分子大小,也可以将实际电泳的结果和理论结果相对比,分析差异产生原因,从而完善实验方法,严谨实验步骤。

关键词碱变性法分离纯化技术琼脂糖凝胶电泳

引言

质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外,另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前,已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(DNA)。质粒在基因工程中是一类重要的载体,其作用主要是携带一些基因片段(可以是编码基因,也可以是调控区等),在细胞内环境中进行表达或参与通路的相互作用,通过将质粒转化到宿主细胞可以探究基因相互作用关系,取得蛋白产物,实现特定基因片段的克隆等。总之,质粒在生物科学研究方面具有广泛的作用。

提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-***化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中,碱变性提取法最为经典和常用。碱裂解/碱变性法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的分离方法。在pH12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA恢复原来的构型,保存在溶液中染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,通过离心被除去。最后,质粒DNA用冰乙醇沉淀获得。由于DNA和RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通过酚/***仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。

电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是电泳支持介质,具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动

速度差异,就可以区别各种大小不同的分子。因而,凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。

正文

1.材料和方法

1.1材料和试剂

实验材料:E.coli DH5α(pUC19)。

实验试剂:LB液体培养基、氨苄青霉素(Amp)母液(储存浓度100mg/mL)、溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mM EDTA (pH 8.0)溶液Ⅱ:0.2MNaOH,1% SDS溶液Ⅲ:5MKAc(pH 4.8)TE溶液:10mM Tris-HCl,1mM EDTA (pH 8.0)冰乙醇、70%乙醇、RNase A、Tris饱和酚、***仿/异戊醇混合液、酚/***仿/异戊醇(PCI)(25:24:1)混合液、3M NaAc溶液、灭菌双蒸水ddH2O、50×TAE缓冲液、10mg/mL溴化乙锭(EB)溶液、6×上样缓冲液(6×loading buffer)。

1.2实验方法

大肠杆菌的增值

用牙签从LB固体培养基挑取E.coli DH5α(pUC19)菌落于LB+Amp(Amp工作浓度为100μg/mL)液体培养基中,置于37℃、200rpm培养箱下振荡过夜培养。

实验前准备

(1)用搪瓷杯取一杯冰。

(2)将小烧杯放在天平上,调至平衡。

(3)配置80ml溶液Ⅱ: 将原液10M NaOH,10% SDS配制成0.2M NaOH,1% SDS。取用8ml SDS,1.6ml NaOH和70.4ml蒸馏水配置。

3. E.coil菌株的收获( 4°C操作)

(1)取一个灭菌离心管,称重,标记为W1 14.552g

(2)倒入菌液至距瓶口1/3处,两两配平

(3) 6000rpm,离心5min,弃上清

(4)加入5ml 溶液Ⅰ,涡旋, 6000rpm,5min,弃上清,称重为W2 14.676g,计算W2-W1 0.124g。

4.细胞裂解提取质粒DNA ( 4°C操作)

向菌体沉淀中量加入(按菌体量接近的重新分组,溶液Ⅰ补平)

(1)2.0 mL 溶液Ⅰ,充分涡旋振荡用溶液Ⅰ再次配平

(2)4.0 mL溶液Ⅱ,轻柔颠倒混匀,冰浴3-5mi

(3)3.0 mL 溶液Ⅲ,轻柔颠倒混匀,冰浴5mi

(4)12000rpm, 15min小心转移上清到新的离心管内,记录体积V。

(5)加入2V冰乙醇,颠倒混匀-20℃,15min。

(6)12000rpm,15min,弃上清。

(7)加入5mL70%乙醇,12000rpm,3min,吸弃上清。

(8)重复乙醇洗涤一次37℃风干5-10min。

(9)分次加入0.5mL TE溶液两次,将沉淀吹开吹匀,并移到Ep管中,得质粒DNA粗提物

(10)加入5μl RNase A(10mg/ml),终浓度为50μg/mL,37℃孵育1-2小时。

5.质粒DNA的纯化

将1mL质粒DNA粗提物分出500μL到一新EP管中,使得每组两管。每个EP管进行如下操作:

(1)加入等体积的Tris饱和酚,涡旋振荡,12000rpm,5mi

(2)转移上清V1(两管均为400μL)至新管,加入V1的酚/***仿/异戊醇混合液,涡旋振荡(<1min),12000rpm,5mi

(3)转移上清V2(一管为400μL,一管为378μL)至新管,加入V2的***仿/异戊醇混合液,涡旋振荡(<1min),12000rpm,5mi

(4)转移上清V3(两管均为250μL)至新管,加入1/10 V3的3M NaAc溶液(pH=5.2),再加入2V4(V4=V3+1/10V3)的冰乙醇,震荡混匀,-20℃保存30mi

(5)12000rpm,15min,弃上清

(6)加入500μL 70%乙醇洗涤,12000rpm离心2min,弃上清

(7)重复洗涤一次,吸弃上清,37℃风干5mi

(8)每管加入25μL TE溶解沉淀,合并,得50μL纯化质粒DNA。

6. 1% 琼脂糖凝胶的制备

(1)配制2L 1×TAE:取40mL 50×TAE,用双蒸水将其稀释至2L

(2)正确组装制胶槽、制胶板、样品梳

内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.

第2页 /(共3页)

文档介绍:

(3)取40mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中,称量0.4g琼脂糖,混匀,轻旋瓶盖,微波炉加热沸腾3-4次,至溶液澄清无颗粒

(4)待溶液冷却至60℃左右,加入20μL 1mg/mL的溴化乙锭(EB)溶液,使EB溶液终浓度为0.5mg/L,混匀后倒入制胶槽中,冷却凝固待用(冷却凝固时间要在30min以上)。

7.电泳上样

(1)取2.0μL纯化DNA、2μL双蒸水、1μL上样缓冲液(6×loading buffer),用微量移液器吹吸混匀

(2)将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中,添加1×TAE至高出胶面约1mm

(3)将上述混合好的DNA样品,按照下表顺序,点样到凝胶中。。

8.凝胶电泳与DNA分离

(1)开启电泳仪电源,选择合适的电压120V和时间40mi

(3)将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极,与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极,与电泳仪负极相连

(4)启动电泳,待观察到负极有气泡升起方可离开

(5)电泳结束,关闭电源,取出凝胶,在紫外灯下观察电泳条带。

2.实验结果

表 DNA样品加样顺序

泳道

DNA

样品/

marker

超螺旋marker

UC19

UC19/HindⅢ

1组DNA样品

2组DNA样品

3组DNA样品

4组DNA样品

5组DNA样品

超螺旋marker

样量

6μL

5μL

5μL

5μL

5μL

5μL

5μL

5μL

6μL

泳道

10

11

12

13

14

15

16

17

DNA

样品/

marker

6组DNA样品

6组DNA样品(阳性对照)

7组DNA样品

8组DNA样品

9组DNA样品

10组DNA样品

UC19

HindⅢ

UC19/

样量

5μL

5μL

5μL

5μL

5μL

5μL

5μL

5μL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

5,026

5,026

3,049

2,087

图碱裂解法提取质粒pUC19 DNA的琼脂糖凝胶电泳

泳道1与泳道9 加的样品是Supercoiled DNA Ladder Marker。supercoiled DNA Ladder Marker 由8种超螺旋的质粒DNA 构成,DNA大小分别为:2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp。其中5,026 bp的条带最亮。

泳道2与泳道17加的样品是pUC19质粒。DNA,即超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA,其条带在2.7kb左右,起对照作用。

泳道3与泳道16加的样品是用HindⅢ酶切的pUC19质粒。HindⅢ酶切pUC19的结果是使超螺旋的共价闭合环状结构的pUC19质粒DNA的链断裂成线状的DNA, 线状DNA电泳速率减慢。但是实验中所用的HindⅢ没有将pUC19酶切充分,因此泳道3与泳道16电泳后会形成两条条带,其中暗带是被HindⅢ酶切的pUC19 质粒,明带是没有被HindⅢ酶切的pUC19质粒。

泳道11是没有加RNase的对照组的电泳图像,由于RNA易形成各种高级结构,同样大小的DNA和RNA相比,RNA的电泳速率快。泳道11下方的大量明带即为RNA电泳区域。

除了泳道15存在pUC19质粒所在区域条带,其他组的都无或无明显的pUC19质粒所在区域的条带,包括泳道15在内的所有组的条带位置都偏低,因为碱变性法有缺陷:容易导致不可逆的变性,不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法,质粒在碱性条件下会变性,时间一长,这种变性就是不可逆的了,我们碱变性时间太长,导致质粒DNA的变性不可逆,所以实际条带位置和预估不一样。

除了位置偏下的质粒DNA带以外,每一组都存在中间位置较弱的杂带(实心箭头所指),我们推测此杂带是没有被沉淀的,在加了有机物后涡旋震荡过程中所产生的线性染色体DNA的碎片,DNA,所以它的位置偏后。这一杂带在泳道4、7、8、10、12和16尤为明显。

个别组在加样孔下方也存在较窄的DNA条带(线性箭头所指),据推测,这种条带的产生是质粒DNA沉淀中少量染色体DNA杂质的存在而产生的,由于染色体DNA片段过大,1%的琼脂糖凝胶的分辨率有限,片段过大的DNA在电泳时速度极慢或很难穿过琼脂糖凝胶的孔径,因此,形成离上样孔近的较窄的杂带。这一杂带在泳道4、7、10和12尤为明显。

个别组在加样孔处也存在较弱的DNA条带(方形箭头末端所指),我们推测可能是没有除尽的蛋白质把加样孔堵住了,导致少数DNA无法从加样孔跑到凝胶当中去。这一杂带在泳道4、7、10和12尤为明显。

我们组的质粒DNA(0.124g)在泳道13,和其他泳道相比,我们的质粒DNA的条带稍微偏弱,这说明我们在组提取质粒DNA时有一定的DNA损失,但是我们组的DNA碎片和染色体DNA杂带也相对较弱,这可能和我们所提取的DNA量较少有关(和泳道4对照,由于此组提取的质粒DNA量较大,所获得的杂带也较明显。因此,不能因为我们组的杂带少而确定我们组的结果好),也有可能是我们的杂质除去得较为充分(和泳道14相比,我们组的杂带明亮程度和他们相近,但是我们的目标带明显比他们亮度高)。

3.讨论

加入5ml 溶液Ⅰ,涡旋的目的是重悬并洗涤菌体。溶液Ⅰ中葡萄糖的作用是为细胞提供等渗环境,

Tris-HCl作为pH缓冲液,为细胞提供适宜酸碱环境,EDTA(pH 8.0时溶于水)是重要金属螯合剂,可以与Mg2+、Ca2+等金属络合,抑制DNase对DNA的降解作用。离心后尽可能去除干净上清液,减少培养基对实验结果的影响。

加入2.0 mL 溶液Ⅰ的作用是重悬并洗涤菌体。

加入4.0 mL溶液Ⅱ的目的:①SDS能断裂分子内和分子间氢键,使分子去折叠,从而破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构而达到裂解细胞的目的。加入溶液Ⅰ后,溶液变得清亮粘稠,变得清亮是由于细胞破碎了,粘稠是由于细胞内蛋白质等有机物析出。加入溶液Ⅰ要慢慢颠倒,使之混匀,不能烈震荡。震荡过于剧烈会使染色体DNA断裂成碎片,导致在质粒DNA中引入杂质。②NaOH的碱裂解作用和碱变性作用:NaOH可以与蛋白质结合(细胞膜含有蛋白质)从而破碎细胞在pH12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,而质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。因此可通过之后对pH值的调节达到分离染色体DNA与质粒DNA的目的。

此步骤等待时间不能过长,因为强碱也会破坏质粒DNA。

加入3.0 mL 溶液Ⅲ(5M KAc(pH 4.8))的作用是使质粒DNA复性,而染色体DNA太长难以复性从而沉淀出来。不能复性的染色体DNA与

落寞的高山
欢喜的香菇
2025-07-19 19:31:52
DNA不溶于乙醇,利用这一性质,可以用乙醇将DNA从溶液中沉淀出来,从而纯化DNA。比如,有机溶剂法提取DNA中,用酚氯仿萃取DNA,此时,DNA存在于水相,作为杂质的蛋白质存在于有机相,萃取后,可以通过有机相将大部分杂质分离,然后在DNA溶液中,加入2.5倍体积的冰冻乙醇过夜,此时,DNA将从溶液中析出,离心,可得纯DNA,再加入一定体积的双蒸水得到纯净的DNA提取液。

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优雅的百褶裙
2025-07-19 19:31:52

DNA纯化的步骤是:

1.2-25倍100%的酒精冰箱中先预冷,降温后再加入DNA中;

2.低温,冰中反应5min至更长时间;

3.低温,离心;

4.加70%乙醇清洗两遍;

5.加TE溶解DNA.

鳗鱼可乐
健康的绿草
2025-07-19 19:31:52
用乙醇沉淀法浓缩质粒DNA:

提取液中加入等体积预冷的5mol/L

Licl

充分混匀,1000rpm

4℃离心15min,取上清。

加等体积异丙醇,混匀,室温放置10min,10000rpm

4℃离心15min。

弃上清,纯点加入70%乙醇洗涤一次,沉淀风干10~15min。

500ul,含RNA酶的TE(pH8.0)溶解沉淀,室温放置30min。(将质粒RNaesA混合物用酚:氯仿抽提一次,然后用氯仿抽提一次)

用2.5倍体积无水乙醇沉淀质粒,风干10min。

加1ml灭菌水溶解沉淀,加500ul

PEG-MgCl2溶液,充分混合,室温10min,12000rpm

4℃离心15min。

用70%乙醇重悬沉淀,12000rpm

4℃离心15min。

弃上清,沉淀用70%乙醇处理一次,最后将质粒,溶于500ulTE(pH8.0)中,取1ul质粒DNA,100倍稀释后测OD260,计算DNA的浓度,其余封装,-20℃保存备用。

爱撒娇的魔镜
强健的季节
2025-07-19 19:31:52
使用方法因厂家不同而不同,下面是一氪生物技术的核酸纯化试剂使用方法及注意事项,供参考:

步骤一:使用无水乙醇与纯化水配制70%乙醇备用。

步骤二:从2-8℃冰箱中取出磁珠悬浮液,在室温条件下震荡混匀,平衡30min。

步骤三:将充分震荡混匀平衡后的磁珠加入待纯化酶反应或PCR反应产物溶液中。磁珠加入体积分别参考图1和图2,若待纯化产物体积不足,可用纯化水或10mM Tris-HCl(pH8.0)补充至相应体积。

步骤四:用移液器反复吹打10次,将磁珠悬浮液和PCR产物或者酶反应物充分混匀,室温条件下静置5min。

步骤五:将反应板放置在磁力架上,静置2min,待溶液澄清后将上清吸走,转入废液桶内。

步骤六:向反应板中加入200μL新鲜配置的70%的乙醇,室温静置30s。静置结束后将乙醇吸走,转入废液桶内。操作环节不可将反应板从磁力分离架上拿下或将磁珠吹散。

步骤七:重复步骤六。

步骤八:保持反应板置于磁力架上状态,室温开盖晾干2min以去除残存的乙醇。

步骤九:将反应板从磁力架上取下来,加入50μL洗脱液,移液器反复吹打10次混匀,室温静置3min。洗脱液加入量根据实际需要而定,但应不少于5μL。

步骤十:将反应板重新放置在磁力架上,室温静置1min,上清液即纯化后的DNA产物。

步骤十一:将上清液转入新的反应管或者反应板中,供下一步反应或检测使用。

自信的火车
甜美的大雁
2025-07-19 19:31:52
可以这么说,先使用95%酒精和醋酸钠或异丙醇洗涤,之后用75%酒精洗涤,目的是洗去加入的盐,乙醇浓度太高达不到脱盐效果,太低DNA会融掉,异丙醇沉淀以后有人用无水乙醇洗一遍,目的是加速DNA的干燥,因为异丙醇的挥发性没有乙醇好 ,

主要目的还是为了除盐,前面沉淀DNA时加入的盐会影响你后续的克隆操作,如酶切和PCR

冷酷的苗条
高高的飞机
2025-07-19 19:31:52
分离质粒时,可以将质粒去得很干净。方法为:先用TE之类的试剂将菌液悬浮起来,再用NaOH和SDS将菌液裂解(起裂解作用的主要是NaOH,但此时,SDS可以与蛋白很好的结合)。第三步,加入酸中合第二步中的碱,并且将SDS沉淀下来,同时,SDS和蛋白也一起沉淀下来,而基因组上面有很多的蛋白,这样基因组就一起沉淀下来,上清只有质粒了。上清的质粒用乙醇沉淀,这样得到的质粒基本没有基因组。而分离基因组时,一般也是用SDS裂解(想对于碱裂解,SDS比较温和)。同时还用蛋白酶K处理,将基因组上的蛋白降解掉,这样就得到了基因组DNA。再用乙醇沉淀,去掉其他的东东。如果菌中含有质粒,质粒也一起提出来,无法去掉。至于后来的试剂盒,如柱式,前其原理一样,不过最后一步纯度是用柱子的方法。