使用 中量全血基因组DNA提取试剂盒（3ml)提取基因组DNA时，是否需要使用有毒的苯酚等试剂

实验步骤：

1. 提取组织RNA时，每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解：提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；

2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在试问15~30℃下放置5分钟；

3. 在上述EP管中，按照每1mlTrizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15~30℃）放置2~3分钟后，12000g（2~8℃）离心15分钟；

4. 去上层水相置于新EP管中，按照每1mlTrizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30℃）放置10分钟后，12000g（2~8℃）离心10分钟；

5. 弃上清，按照每1ml Trizol加1ml75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2~8℃）离心5分钟，弃上清；

6. 让沉淀的RNA在室温在自然干燥；

7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀

各试剂的作用：

1、 TRIZOL

主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。

TRIZOL是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。

※0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。

※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。

2、 氯仿

为有机溶剂与水互不相溶，RNA（核糖核“酸”的盐型）是离子化合物，溶于水相

3、异丙醇

能与与任意比例的水混合，因此加入异丙醇，能够夺取RNA/DNA周围的水分，RNA/DNA能够聚集而发生沉淀。

细胞裂解液各成分的作用：

1、第一种50mmol/L Tris-HCl是缓冲液，保证细胞裂解时PH值也能稳定，Tris是一种有机碱。

2、第二种1.0 mmol/L EDTA是一种金属螯合剂。

3、第三种150 mmol/L NaCl是等渗体系电解质，用于协调细胞膜内外离子平衡。

4、第四种0.1% SDS是十二烷基硫酸钠，是一种表面活性剂和还原剂，有增溶作用。

扩展资料：

细胞裂解及方法简介：

细胞裂解是改变细胞通透性和活性的重要实验方法。主要分为化学法和机械法，前者比较温和，后者虽然产量高，但反应更剧烈，很有可能造成细胞中的DNA断裂。

裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA 断裂。这两种方法(包括SDS 和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法。

机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA 的断裂。

（1）大多有效成分都是去垢剂，那么去垢剂是什么呢？

去垢剂功能的关键是具有两亲结构。所有的去垢剂都具有亲水“头部”区域和疏水“尾部”区域这一特征，常用的阴离子去垢剂SDS结构如图：

这些结构特性使得去垢剂可以在水性介质中聚集。在足够高的浓度下，每个分子的极性亲水区域朝向极性溶质（水），而疏水区域聚集在一起，形成一个具有疏水核心的热力学稳定的胶束。去垢剂胶束的疏水核心区域与蛋白质的疏水表面结合，形成可溶性的蛋白质-去垢剂复合物。

去垢剂根据其亲水基团的不同分为：阴/阳离子去垢剂、非离子型两性去垢剂、两性去垢剂。

a 阴/阳离子型去垢剂：作用强烈，会更大程度的改变蛋白质的结构，更容易受到pH、离子强度和反离子的性质等因素影响；

b 非离子型去垢剂：作用温和，由于不分离蛋白质-蛋白质键，非离子型去垢剂使得蛋白质可以保留其天然的结构和功能，不易变形（疏水链长度较短的去垢剂更易引起蛋白质失活）；

c 两性去垢剂：相对于离子型去垢剂其更少产生变性，相对于非离子型去垢剂，又可以更有效的破坏蛋白质-蛋白质键并减少聚集。

（2）配置裂解液都需要Tris缓冲液，又是什么呢？

a. Tris学名叫三羟甲基氨基甲烷，它和Tris-base是一个东西，1M的Tris溶液的pH值大约是10～11，即常说的Tris碱；

b. Tris-cl和Tris-HCl是一个东西，就是写法上有所不同，即常说的Tris酸；

c. Tris-HCl就是在Tris-base的溶液中加入适当量的盐酸，调成你所需要的PH值。

2.    常用裂解液种类：

（1）NP40 lysis buffer：

a. 主要成分50mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40。

b. 概述：NP-40是一种很温和的非离子型去垢剂，1%浓度基本可以破坏掉细胞膜，而对核膜的破坏作用较弱，结合特定的缓冲液可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。

c. 用途：常规的Western、IP和co-IP和ELISA，本实验室是做核蛋白的，由于获取核蛋白需要裂解细胞核膜，因此本lab WB实验用1%NP40+0.1%SDS（可使蛋白变形），IP/pull down实验用1%NP40+超声（保留蛋白结构）。

（2）SDS lysis buffer：

a. 主要成分：50mM Tris (pH8.1)，1% SDS

b. 概述：是一种比较强烈的细胞组织裂解液，可裂解核膜。在SDS-PAGE电泳中，SDS能使蛋白氢键和疏水键打开并结合蛋白分子，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度电荷且远远超过蛋白分子原有电荷，从而掩盖蛋白间电荷差别，使得电泳迁移率只取决于分子大小这一因素。

c. 用途：用于常规Western、ChIP等

各种常用裂解液的比较推荐参考碧云天网页： https://www.beyotime.com/lysis-buffer.htm