正相色谱法流动相配比选择的原则是什么

手性化合物液相色谱分析方法开发过程中，根据化合物的结构特点或者是进行初步的开发尝试，确定了影响分离有效性的关键因素如色谱柱的类型以及流动相的种类以及操作模式之后，就需要对是否需要使用添加剂以及哪一种添加剂做出选择，一些其他的操作条件诸如流速，色谱柱柱温等进行优化，以此获得良好的分离效果。

一般地，对于手性化合物液相色谱分析方法的开发，我们前期开发关注的主要内容有以下几个方面：选择性因子(α)，主要体现分离度的大小；容量因子(k)，主要体现保留时间的大小；拖尾因子(Tf)，主要体现色谱峰的对称性，分别如下图1-1，图1-2以及图1-3所示。在同一个开发实例中，不一定需要同时对以上三个方面进行调整，需要根据具体的情况以及分析方法开发的接受标准而定。

Fig.1-1 Main factor of α in a chiral method development

Fig.1-2 Main factor of k in a chiral method development

Fig.1-3 Main factor of Tf in a chiral method development

影响选择性因子、容量因子以及拖尾因子的因素，既包括之前涉及的色谱柱、流动相、操作模式，也包括添加剂的种类、色谱仪器的使用条件(流速，柱温、溶解样品的溶剂的种类，样品的浓度与进样量以及DAD检测器的检测波长设置等因素。

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添加剂的种类与选择

一般地，手性添加剂主要是指一些有机酸碱，如常用的有机碱：二乙胺(DEA)，三乙胺(TEA)，乙醇胺(ETA)，异丙基胺(IPAm)，N,N-二甲基乙醇胺(DMEA)等；常用的有机酸：甲酸(FA)，三氟乙酸(TFA)，乙酸(AceticAcid)等，此外还有一些不太常用到的有机酸如，甲磺酸(MSA)，乙磺酸(ESA)添加在拆分碱性化合物的流动相中。

添加剂的添加的方式一般是根据手性化合物所含有的功能基团而定，一般地，酸性化合物添加有机酸类添加剂；碱性化合物添加有机碱类添加剂；两性离子化合物可以选择添加酸性或碱性添加剂甚至同时添加酸碱类添加剂，对于中性待分离的手性化合物而言，流动相中是否添加酸碱添加剂对其分离效果的影响可以忽略不计。

在流动相中添加酸碱有机添加剂的作用，无外乎以下几种作用中的一种或者多种：

(1) 抑制或者促进化合物的官能团的解离；

(2) 抑制固定相基体硅羟基的解离，减小二次相互作用，减小拖尾因子，提高色谱峰的对称性；

(3) 调节待分离化合物的容量因子，得到合适的保留时间；

(4) 调节某一方向上驱动力的大小，实现有效的分离；

一般地，有机酸碱的累计添加量不超过0.5%，否则可能会对色谱柱产生损害以至于减少色谱柱的实际使用寿命。

Fig.2-1 Effect of additives on the retention time

如上图2-1所示，待分离手性样品为含有羧基的有机酸类化合物，由于化合物本身呈现酸性，在流动相中不添加醋酸的时候，化合物本身由于解离呈现出强极性与色谱柱极性固定相之间呈现强结合作用，在40min内未被洗脱出来(如图2-1A所示)。当在流动相中添加0.1%的醋酸之后，由于添加的乙酸抑制了酸性化合物的解离，使得该化合物的极性降低，在10min内就实现了有效分离(如图2-1B所示)。

Fig.2-2 Effect of additives on the peak shape and tailing factor

而对于上面的碱性样品而言(如图2-2所示)，在添加0.1%DEA之前，色谱峰如山包一样，保留时间跨度十分大(如图2-2A所示)；而当添加了0.1%的DEA之后，不仅实现了基线分离而且色谱峰的峰形也十分对称(如图2-2B)。在这个例子中添加的DEA的作用可能有两个，其一是抑制碱性化合物的解离，其二是降低了该化合物的溶剂效应。

有机酸碱类添加剂除了影响手性化合物的保留时间以及改善色谱峰的对称性之外，亦会对手性化合物的分离选择性产生很大的影响，如下图3所示。

Fig.3 Effect of additives on the resolution between the peaks ofisomers

上图两个例子中，流动相的种类，添加剂以及色谱柱的类型完全一致，唯一的区别在于分析的化合物的结构上的差异。在图3a中，随着有机酸FA的添加比例的增加，化合物的保留时间减少且分离度变差；而在图3b中，随着有机酸FA的添加比例的增加，化合物的保留时间大幅度增加且分离度变大，实现了基线分离。

以上几个例子说明有机酸碱添加剂及其添加量不仅影响手性化合物色谱峰的拖尾因子以及保留时间同时也会对分离的选择性产生较大影响，而这些作用的程度与作用的方向与具体化合物的结构特点密切相关。

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流速的影响

根据范式方程的图形示意图，如图4所示，不同的色谱柱均具有一个最佳的线速度范围，在该范围之内的理论塔板高度最低，且该范围随着填料颗粒粒径的减小而有所扩大。使用色谱柱供应商推荐的流速范围内的线速度，可以获得最大的理论色谱柱柱效，但需要注意一点，色谱柱的柱效达到最大的时候，对于手性化合物的拆分效果不一定是最好的。

Fig.4 Diagrammatic sketch for Van Deemter

如一根250mm的IC色谱柱(填料颗粒5um)，其推荐的流速为1 mL/min左右，有很多时候，在推荐流速下，色谱峰不能实现良好的分离效果，通过降低流速，可以改善分离度达到基线分离，而此时的色谱柱的柱效，显然不是最大。再如，在推荐流速下，色谱峰之间的分离度远大于1.5，此时，我们可以通过增加流速的方式，减小分析物的保留时间，同时色谱峰的峰形收窄，峰宽降低，表观色谱柱柱效增加。

因此，对于流速的选择，需要根据所遇到的具体的分离情况进行选择，首先可以使用推荐的流速进行初始尝试，根据获得的色谱分离结果，适当调整流速的大小，获得良好的峰形以及分离度。

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溶剂的选择

样品溶解所用溶剂对于手性分析方法的开发的最大影响在于溶剂效应，特别是在正相色谱中，更容易出现溶剂效应。如下图5所示，图中的实例均是溶剂效应的具体表现。

Fig.5 Solvent effect in the chiral method development

归根结底，溶剂效应是由于溶剂与流动相之间的差异过大，二次分配时间过长或者溶解性差异过大导致。一般地，溶剂效应的大小还与进样体积的大小有关，进样体积越大，溶剂效应越明显。

Fig.6 The example of Solvent effect

如上图6所示，待分离样品在以正己烷作为溶剂的时候，随着进样体积的增大，并没有出现明显的溶剂效应，而当改为极性溶剂如异丙醇或者甲醇之后，随进样体积的增加，溶剂效应变得很大。

避免溶剂效应，最好选用流动相作为溶剂或者与流动相混溶的溶剂，此外也与分析物以及固定相的性质有关。

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结论

选择了合适的色谱柱，流动相的组成以及操作模式只是手性分析方法开发成功的必要条件，还需要对色谱仪器的操作条件进行优化，如流动相中的添加剂的种类以及添加量，流动相的流速的大小，溶解样品所用的溶剂等，均对分析方法主要关注点如分离度，拖尾因子，保留时间产生很大的影响。一般地，溶剂以及流动相添加剂的选择需要考虑化合物的结构以及所含有的官能团情况，而流动相的流速的选择，需要根据色谱峰分离情况做出调整，而不必要使色谱柱的理论柱效达到最大。

=0.23,能够刺激人体组织和皮肤.TFA只有轻微的毒性,但是在不流动的地表水中富集则会影

响农业和水生系统[25],并且TFA经历微生物降解产生温室气体CHF3

1. HPLC高效液相色谱溶剂：

? 低紫外吸收

? 非挥发性物质、游离酸、游离碱水含量低

? 用于荧光检测

for HPLC

gradient grade, for HPLC

for LC-MS

for preparative chromatography Prepsolv ?

用途：用于液相色谱（LC）品制备、LC品析、LC-MS析

2. 农残级痕量析高纯溶剂：

? 极低农残背景值（≤5 pg/ml ）挥发性组极少

? GC控制（ECD-PND检测）质量靠稳定性高

? N、P、S等元素背景值低基线平稳经性能测试用于氯联苯（PCBs）、机氯农药、机磷农药残留痕量析及其适用于GC-ECDGC-NPD检测化合物GC、GC-MS析

tfa是三氟乙酸试剂，化学式为CF3COOH，分子量为114.02。

三氟乙酸的概述

三氟乙酸是无色、有辛辣气味的液体，易吸潮，易挥发，能发烟；是乙酸的全氟衍生物，也是最简单的全氟羧酸类化合物；是一个极强酸性的有机酸，同时具有溶解很多无机物及有机物的能力，使之具有优异的反应性能，从而在医药、农药、染料、氨基酸保护、有机合成、材料处理等领域得到广泛的应用。

三氟乙酸的理化性质

三氟乙酸是无色易吸潮挥发性发烟液体，与醋酸气味相似。三氟乙酸能与水、氟代烷烃、甲醇、丙酮、苯、乙醚、四氯化碳和己烷互溶，可经氢化锂铝或硼氢化钠还原为三氟乙醛和三氟乙醇。在205℃以上稳定，但其酰胺和酯则较易水解，因此能以酸或酐的形式,制取糖类衍生物、氨基酸和肽衍生物。

三氟乙酸的应用

1、用作有机合成反应的催化剂

三氟乙酸是极强的质子酸，又能和有机体系互溶，因此被广泛地用作各种有机合成的催化剂，如芳香族化合物的烷基化、酰基化、烯烃的聚合等反应的催化剂。

2、作为溶剂

由于CF3基团的低亲核性和三氟乙酸的化学惰性，因此三氟乙酸是氟化反应、硝化反应以及卤代反应的优良溶剂。

用作医药、农药中间体、生化试剂、有机合成试剂。三氟乙酸用于合成含氟化合物、杀虫剂和染料。是酯化反应和缩合反应的催化剂；羟基和氨基的保护剂，用于糖和多肽的合成。还用作选矿剂。用于有机合成。

三氟乙酸是一种重要的脂肪含氟中间体，由于含有三氟甲基的特殊结构，因此使其性质不同于其他醇类，可以参与多种有机合成反应，尤其用于合成含氟的医药、农药和染料等领域，国内外需求量越来越大，已成为含氟精细化学品的重要的中间体之一。

主要用于新型农药、医药和染料等的生产，在材料、溶剂等领域也有较大的应用开发潜力。三氟乙酸主要用于合成多种含三氟甲基和杂环的除草剂，可以合成多种带有吡啶基、喹啉基的新型除草剂；作为极强的质子酸，它广泛用于芳香族化合物烷基化、酰基化、烯烃聚合等反应的催化剂；作为溶剂，三氟乙酸是氟化、硝化及卤代反应的优良溶剂，特别是其衍生物三氟乙酰基对羟基和氨基的优良保护作用，在氨基酸和多肽化合物合成方面有着非常重要的应用,用于多肽合成中除去氨基酸的叔丁氧羰基（t-boc）保护基；三氟乙酸作为制备离子膜的原料和改性剂，可大幅提高烧碱工业电流效率，延长膜的使用寿命；三氟乙酸还可合成三氟乙醇、三氟乙醛和三氟乙酐。室温下三氟乙酸汞使氟苯起汞化反应（亲电取代），也可将腙转化为重氮化合物。此酸的铅盐可将芳烃转化为酚。

可部分溶解二硫化碳和六碳以上烷烃，是蛋白质和聚酯的优良溶剂。它也是有机反应的优良溶剂，可获得在一般溶剂中难以获得的结果，例如喹啉在一般溶剂中催化氢化时，吡啶环优先氢化，但在三氟乙酸中苯环优先氢化。三氟乙酸在苯胺存在下分解成氟仿和二氧化碳。

在HPLC中的应用：

在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸 （TFA） 作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。三氟乙酸与多肽上的正电荷及极性基团相结合以减少极性保留，并把多肽带回到疏水的反相表面。以同样的方式，三氟乙酸屏蔽了固定相上残留的极性表面。三氟乙酸的行为可以理解为它滞留在反相固定相的表面，同时与多肽及柱床作用。

三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

改变三氟乙酸的浓度，可以细微地调整多肽在反相色谱上的选择性。这一影响对于优化分离条件、增大复杂色谱分析（如多肽的指纹图谱）的信息量是非常有益的。

三氟乙酸添加在流动相中的浓度一般为 0.1% ，在这个浓度下，大部分的反相色谱柱都可以产生良好的峰形，当三氟乙酸浓度大大低于这个水平时，峰的展宽和拖尾就变得十分明显。

三氟乙酸在分离蛋白等大分子的时候效果很好，在实际使用中，大家对于三氟乙酸的浓度都很难控制好，因为它是挥发性的物质，如果配置时间长了，就会挥发一些，改变了浓度。配制好以后一定要封闭好，防止挥发。

MALDI-T0F是一种非常灵敏的方法，其能够用于检测非常少量的组 分。所采用的基质材料通常是小的有机酸。常用的基质材料包括3，5- 二甲氧基-4-羟 基肉桂酸(芥子酸)、a-氰基-4-羟基肉桂酸(a-氰基或a-基质)和2，5_ 二羟基苯甲 酸(DHB)。通常，将该基质材料溶解于高纯水与另一种有机化合物(通常为乙腈(CAN))的 混合物中。通常还加入一些酸，例如三氟乙酸(TFA)，因为酸能够抑制盐杂质对分析物的质 谱的干扰影响。此外，减小基质溶液的PH通常会导致样品的质量提高，例如信号的数量增 加或信号强度增加。