有谁能详细说一下全基因组Bisulfite Sequencing的流程

分子生物学实验的基础分子生物学实验的基础知识2006-11-17 16:31

分子生物学的发展，核酸和蛋白质的结构，功能和生命的本质，核酸，蛋白质分子水平上的发病率，诊断，治疗和预后机制的研究学科的生化基础。基因工程（基因技术，基因重组）是一种分子生物学研究的热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物的痕迹对象实现层次分析法是研究基因表达调控，分子水平的疾病的机理，基因诊断和基因治疗方法。转换（转换），转，转，转，通常用自然的方式重组存在，而且人工重组的方式。的重组基因的克隆的目的之一（基因的克隆），克隆理解为与模板完全的基因相同的分子结构的分子基因为模板扩增。需要分析的痕迹的研究，并将该混合靶基因易于纯化，可以是增量的，便于分析。

？外源基因，导致细胞生物性状的变化过程称为转化（转化），噬菌体外源基因导入细菌称为转（转）。载体（噬菌体或病毒）的遗传物质传递从一台主机到另一台主机的过程称为转导（转导）。从转移到另一个过程的基因组的基因中的一个或一组被称为可转位的转位，这些游动的基因，称为转座子。

？，基因工程的常用工具

？（A）载体

？向量（向量）的外源DNA（目标基因）导入宿主细胞的传代，扩增，表达工具。的载体质粒（质粒），噬菌体，噬菌体和粘性末端的单链质粒（粘土），病毒，和类似物。载体具有自我复制另外，为了方便遗传标记的筛选和鉴定外源DNA插入位点本身体积小等特点。

？质粒存在于多种细菌，是独立的染色体（核）组成的双链环状DNA几乎完全裸露，很少的蛋白质结合，比其他的遗传因素。质粒紧与松。严紧型由DNA聚合酶Ⅲ复制，一个细胞可以被复制到1-5质粒。弛张型DNA聚合酶Ⅰ副本，一个细胞可以复制30-50个质粒，氯霉素阻止蛋白质的合成，有效地利用原材料，拷贝质粒载体。将所述质粒转化常用的pBR322，pUC系列各种各样的。这些质粒含有多个基本基因，如复制起始区域（原点的复制ORI），便于复制扩增抗生素抗性标记（氨苄青霉素抗性四月四环素抗性TCR，等）或大肠杆菌的乳糖操纵子（大肠杆菌LacZ基因）等，以促进基因重组体的筛选基因启动子（乳糖操纵子的Lac，色氨酸操纵子的色氨酸，等）和转录终止序列，以方便插入的外源基因的转录，翻译，表达。的质粒的限制性核酸内切酶的切点，即基因的插入位点，也称为基因重组位点，基因的克隆位点。

？常见的噬菌体载体的单链噬菌体M13系统双链噬菌体系统。噬菌体和相应的宿主细胞配合使用。最重要的载体都有自己的特点，灵活应用的方便选择。

（B）工具酶

？工具酶的重组DNA技术是不可缺少的工具。限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶，逆转录酶和核酸内切酶。

？限制性内切酶Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA切割酶分，Ⅱ严格识别核酸序列和切割DNA双链区域的特定核苷酸的认可。它通常被称为是Ⅱ型限制核酸内切酶。四核苷酸和六核苷酸识别序列旋转对称图形。的切口分开始和粘性的端部产生的5'-P和3'-OH端。应用核酸内切酶的品种，要注意的温度，缓冲液的量（平均0.1微克DNA/2-5单位的酶）和其它反应条件。

内切酶识别序列的切口

铝Ⅰ... AGCT ...... AG CT ...四核苷酸

？... TCGA ...... TC GA ...平端的切口

生态R1 ... GAATTC ...... ?AATTC ...六核苷酸

？... CTTAAG ...... CTTAA G ...粘性末端的切口

？连接酶是噬菌体T4 DNA连接酶，T4噬菌体RNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶。 DNA连接酶可连接到的平面侧，并且还连接到的粘性末端。反应中存在的Mg2 +和ATP，pH7.5的-7.6。最佳温度为37℃，30°C或更少的活性显着降低，但考虑到稳定性，以被连接的DNA，和退火温度的粘性末端，用20-25℃，大致平坦的一端连接粘端连接用12℃左右。

？聚合酶DNA聚合酶（DNA为模板合成DNA的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）RNA聚合酶（DNA作为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶），逆转录酶（RNA为模板合成DNA，除了RNA病毒中发现发现，大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶的逆转录酶活性）。

？大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'，3'→5'外切核酸酶活性。 Klenow片段的DNA聚合酶I的酶枯草溶菌素生成的大片段的5'→3'聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性，没有3'→5'外切核酸酶活性。可用于在缺口翻译（尼克翻译）标记的核酸也可以使用用于DNA序列测定，DNA链的贴剂。

？核酸酶的DNA酶，核糖核酸酶，核酸酶S1和等，可水解的相应的DNA和RNA，核酸酶S1降解单链DNA和RNA，增加的可生物降解的双链核酸的量。它可以用于发夹环剖开的ds-cDNA的合成中产生。

末端转移酶选择的单链DNA的3'-OH端的Mg2 +的存在，核苷酸引物的添加，Co2 +离子存在，选择的3'-OH末端添加核苷酸的双链DNA？作为引物，以形成聚核苷酸最新。常用的一个互补的核酸末端标记和核酸连接聚尾巴（连接器）。

？碱性磷酸酶以除去5'-P防止使两个DNA片段的5'末端的P组空间障碍影响DNA分子之间的连接，典型的载体DNA用碱性磷酸酶处理以除去5'末端的P基的P的第一载体3'末端OH基，连接酶目的基因5'端的连接，然后通过复制另一个链固定，从而使两条链完全连接。这种方法大大提高了工作效率结扎（图18-1）。

？

图18-1碱性磷酸酶处理后的载体DNA靶基因的DNA连接

？其次，头

？经常需要研究的基因为目标基因，需要分析的基因为靶基因，被称为插入基因的克隆过程，有时两个，有时三个类似的意思。简单的原核细胞的靶基因可从细胞核中直接分离，但人类基因的分布在23对染色体中，更难以得到直接的方法。简短的目的基因的结构的理解中，或核苷酸序列编码的结构氨基酸的多肽链通过理解合成的基础上。但是，大多数的靶基因的mRNA合成的cDNA（互补的DNA，反转录的DNA）。 CDNA通过各种手段连接到载体，克隆的全长cDNA或其片段，可以得到用于制备探针，序列分析，基因表达等。反映基因的mRNA转录和后续的翻译为研究材料，即反映了外显子基因（DNA）的情况下。 （图18-2）。

？

图18-2靶基因的cDNA合成

？建立的基因库

？基因文库的建立的目的是为了便于保存所需的基因，扩增和纯化。基因库是使用通过基因重组技术建立的工具酶和转化，筛选，克隆过程。实际上，使用较低的生物体，如细菌，病毒，噬菌体和其它特征与一个快速增长，生殖能力，并作为中的核酸扩增的载体，过滤器，以及更高的生物，如人类的基因或它们的片段插入工具酶，重组其中，后筛选，克隆的基因重组靶基因的载流子复合，容易保存，存取方便的基因库。基因库的靶基因之间的沟通，交换实验室常用的方法。

？（A）重组

？许多简单的可以用限制性核酸内切酶，分别在载体和目的籍Yinqie中相应的切口，容易连接的重组方案。也可用于结束连接酶合成的连接器（图18-3）。在最近几年，冈山实验室常用的方案中，该方法可以得到全长的cDNA。

（B）转换

？转换目的是复制的能力，但在细胞外无复制活性的靶基因 - 装入的细胞（E.coli）的载体的重组细胞内的复制，放大，从而使目的基因与载体。实验过程描述如下：

？

图18-3重组的选项之一

？⒈大肠杆菌处理（增加了膜的渗透性，易于进入细胞的基因）大肠杆菌（大肠杆菌细胞）接种于LB琼脂培养基上，37℃培养过夜。选择3至5的菌落接种到50毫升LB培养基中，37℃，振荡培养过夜后，A550测定，需要一定量的细菌（通常是细菌对数生长期），野生型（建议+，5x107cells /毫升）的0.2-0.3，和缺陷的类型（记录，5x107cells/ml）为0.5-0.6。的离心的上清液被丢弃，20毫升的氯化钙，50mmol / L时，悬浮液的细菌。冰上20分钟，并离心。弃去上清液，用2.5毫升冰50毫摩尔/升氯化钙悬浮。 4℃条件下48小时的转换，感受态细胞。

？⒉质粒转化的重组质粒（如基因重组，基因库等创建的）的感受态细胞（BRL公司DH10B菌株，例如）被设置为在冰水浴。虽然Falcon2059（传热系数稳定）塑料管置冰水浴。拍摄100μl的细菌悬浮液（DH10B），再加上10倍，在2059管巯基乙醇加入1μl稀释，在冰浴中被摇动2分钟，静置10分钟。 0.1加入50ng质粒转入试管中，轻轻摇动冰浴30分钟。此地时已经准备就绪，42℃水浴中。和SOC培养基，42℃备用。管被放置在42℃，45秒后，立即成立摆动冰浴中2分钟。因此，主管细胞热胀冷缩，质粒导入细菌细胞。再加上42℃的SOC培养基0.9毫升在试管中，37℃下进行1小时。 1000转离心10分钟，上清液悬浮的细菌200μlSOC介质。 LB-氨苄青霉素（100U/ml）接种在培养皿中，37℃培养过夜。将转化的细胞可以形成菌落（该质粒上的氨苄青霉素抗性基因）。的菌落被确定的基础上，约与靶基因或它们的产品。在LB肉汤培养物和扩大。基因库，转换，滤波，放大和纯化过程是基因的克隆过程。

？LB培养基（1L）：10克蛋白胨，5克酵母提取物，10克氯化钠，pH值7.5，高压灭菌。

？SOB培养基（1L）：20克蛋白胨，5克酵母提取物，0.5克氯化钠，并高压灭菌。单独制备的2mol / L的镁溶液（1mol / L的氯化镁和1mol / L硫酸镁等量混合和过滤灭菌），在使用前加入1ml至百毫升介质。

？SOC培养基（100毫升）：添加1毫升使用前，2mol / L的葡??萄糖通过过滤灭菌。

？第四，分离和纯化的核酸

？的核酸是存在于各种细胞，如病毒，细菌，寄生虫，动物和植物细胞各种标本，如血液，组织，唾液，尿等的其他来源的标本。分离方法是复杂多样的。由于各种的DNA，RNA的丰度的差异，各种分析方法，核酸纯度和量的要求是不同的，因此响应理解和选择之前，在实验中所使用的方法。在一般情况下，裂解细胞的基础上，分离和纯化的核酸分离和纯化，通过使用苯酚和有机溶剂萃取法（核酸溶解在缓冲溶液中，即，水相）的有机溶剂如乙醇，丙酮沉淀收获。由于不同的试样有用SDS加氢氧化钠有用蛋白酶溶解的细胞，一些使用方法，如超声破碎，苯酚提取，使蛋白质变性沉淀物在有机相中，而核酸被保留在水相中，以达到目的的分离核酸。对生物标本最丰富的蛋白质实验。为了除去残留的有机溶剂，在分离过程中，常用的方法是添加冷乙醇和盐以沉淀核酸，核酸中回收通过离心分离，然后用70％-80％的乙醇洗涤沉淀物以除去过量的盐，所以不影响溶解和抑制随后的酶促反应的步骤的核酸。除去蛋白质可与核糖核酸除去核糖核酸，得到纯的DNA，用DNA酶以除去得到的RNA的DNA，以获得纯化的核酸蛋白酶。开发了许多商业核酸分离柱，可以简单且迅速分离，从而获得高纯度的DNA或RNA。分离原理的一些使用中的核酸的分子量的差异，和一些使用的功能需要的分离的核酸，其特异性结合，实现分离和回收的目的。

？（A）的分离和纯化该质粒

？含质粒的大肠杆菌细胞由的LB培养基250毫升的扩大培养，倒入50毫升的离心管中，4℃下，至3000rpm，离心15分钟。弃去上清液。应进行消毒处理（丢弃，丢弃液体，以免对环境造成污染）。加裂解缓冲液（50毫摩尔/ L，葡萄糖10毫摩尔/升的EDTA，25毫摩尔/升的Tris-HCl，pH8.0）中，1 - 2毫升所以悬浮。在室温下放置5分钟，加入3.5毫升新鲜的制备SDS /氢氧化钠溶液（1摩尔/升的NaOH8毫升，20％SDS2毫升蒸馏水30ml）中上下摇晃，冰水浴中5分钟。振荡器被禁用，以防止DNA分子断裂），加入2.5mol / L的醋酸钾缓冲液（pH 4.8）中2.65.2毫升，垂直晃动，冰浴5分钟。 4℃，3000转，离心15分钟。沉淀蛋白质。上清液中加入无水乙醇，12-24毫升（上清液两次），以让室温后，万转离心15分钟，弃去上清液。加上约的沉淀物体积的0.4倍TE（10 mmol / l的pH为8.0的Tris-HCl，10毫摩尔/升EDTA）溶解沉淀物，添加0.2倍7.5mol / L乙酸铵。提供旋涡混合器和混合，在冰上10分钟。 4℃，10000RPM离心5min，取上清液丢弃。加上沉淀是0.4倍的10mmol / L的Tris-盐酸，pH为7.5，10毫摩尔/升EDTA缓冲液中，1/10体积为5mg/ml核糖核酸酶，37℃下，30分钟保温。加入等量的酚（苯酚）/ CIAA（480毫升氯仿，异戊醇20毫升），和混合。 4℃，10000RPM，离心5分钟。上层清液，加酚/ CIAA重复。的上清液溶液中加入1/10均为5mol / l的NaCl和2倍体积的无水乙醇中，-20℃过夜或-70℃2小时或更多。 4℃，万转离心10分钟，并弃去上清液。加入80％乙醇，不晃动，直接万转离心，将上清液丢弃，并真空干燥。加入TE溶解适量（约200μL）。内容确定后备用。

？靶基因的（b）的重组质粒的分离和纯化

？先取少量纯化的重组质粒，限制性内切酶消化，电泳分离的靶基因，确认。的200μl含2mg DNA（重组质粒），例如：加入10μl含100μg的DNA，加90μlTE。 ,1-2小时，1/10体积的缓冲液孵育1微克DNA加2-5U的限制性核酸内切酶。的类型的缓冲液和酶反应温度的核酸内切酶的类型的不同而不同。 1/10体积为3mol /升乙酸钠，2倍的乙醇，-70℃下，2小时（-20℃过夜），10,000 rpm下，10分钟离心，弃去上清液（乙醇沉淀）。适当量的沉淀物溶解在TE（切割质粒DNA与靶基因的混合物）电泳分离（同时与相应的分子量DNA标准电泳）和可视化在UV光下的结果的比较，与一个标准的DNA分子量，以确认靶基因和核酸内切酶切割效果。

？⒈电泳条件：

凝胶制剂：1％琼脂糖凝胶琼脂糖（毫克）X50TAE（毫升）EB（溴化乙锭微升）

？？（琼脂糖）1000 2.0 4.0

？总体积（ml）

？100

胶的浓度（％）：0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

长度的DNA（KB）：60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1

电泳缓冲液：X50TAE（毫升）EB（μl）的总体积（ml）

？20301000

？X50TAE：Trisma基地54克，钛57.1毫升0.5M EDTA pH值8.020毫升蒸馏水至1000ml。

？EB：10mg/ml的溴化乙锭。 （EB致癌性，操作应小心）。

电泳后，以适当的DNA（重组质粒）同上条件下切断，用1.5％的熔点低（<65℃熔点）的琼脂糖凝胶电泳分离。？含有该基因的区域的紫外线光下，切出与（凝胶），并放置在离心管中，提取和纯化。

？⒉从低熔点凝胶中提取和纯化的DNA片段加上相同的凝胶体积的TE（10 mmol / l的pH为8.0的Tris-HCl，0.1 mmol / L的乙二胺四乙酸），设定为65℃的水浴中温育5分钟，将凝胶完全溶解。放至室温，并加入等量的苯酚（TE饱和，TE闭合，在上部酚以较低者为准），轻轻混匀（不搅拌），12000rpm进，3分钟离心。重复1-2次。的上清液溶液中加入0.1体积的3mol / L的乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的乙醇??，并进行乙醇沉淀。将纯化的DNA溶解于TE加适量确定的内容，备用（可用于基因结构分析的目的，制备探针，等）。除了的低熔点凝胶回收方法，如一般的一个简短的电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心法，回收DNA片段的凝胶可用透析。

？（C）的样品DNA的分离和纯化

吗？5-10毫升的1xNTE（，EDTA的Tris-HCl pH7.4的10毫摩尔/升的NaCl 100毫摩尔/ L，1mmol / L的pH值8.0），以调节细胞是2×107（组织应切碎设置在液氮中冷冻，高速度搅拌切粉，和缓冲液）中的溶液。 λ/10~~λ/20体积（V）的10mg/ml的蛋白酶（Sigma公司Ⅷ型），1/20v 10％SDS，37℃下进行2小时。加入等量的苯酚/ 3xNTE的（3xNTE的信件）和混合（至少7分钟）。 4℃，3000rpm时10分钟。的上清液，加入2ml TE（的Tris-HCl，10毫摩尔/ L，pH值7.5，EDTA 1毫摩尔/ L，pH值8.0），调匀。乙醇沉淀。 2mlTE溶解的沉淀物。加1/30xNTE，蛋白酶K（10mg/ml的）被用来代替蛋白酶重复2-4步骤。含量的测定。

？（四）的样品，纯化的RNA被隔离

？纯化含有106细胞溶液等量的溶液[4 mol / L时，胍基硫氰酸酯，25毫摩尔/ L的柠檬酸pH值7.0，0.5％肌氨酸盐（十二烷基肌氨酸钠）和0.1mol / L的2 - 巯基乙醇]。总体积的细胞沉淀的4-5倍，并混合。加0.1体积为2ml / L，醋酸钠（pH为4.1），1倍体积的苯酚（重蒸水密封），振动筛，0.2体积CIAA剧烈混合10秒钟。冰水浴中15分钟。 10000xg4℃，20分钟。离心（不带刹车）。小心去除上清。添加等量的丙酮（或乙醇（2次）），-20℃，60分钟或更长。 10000×g下，4℃下进行20分钟离心。弃去上清液，。加上约0.3毫升纯化溶液与1.5ml离心管，3）的步骤被重复，离心10分钟，弃去上清液。 75％的乙醇，4℃10分钟离心，10000×g离心。弃去上清液，。在真空下干燥15分钟，和待机时间。

？五探针制备

？探针制备是标记的靶基因，核酸标记的缺口翻译方法，随机引物法，末端标记法和等常用的方法。该标记物质的放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素，地高辛，等）。 32P是最常见的核苷酸标记的同位素标记的dNTP的磷酸基团，容易标记，其特征在于，高活性，最多9000Ci/mmol发射高能量的β-射线，最多1.70MeV的标记的自显影时间探测与其所短，灵敏度高。 32P的半衰期为14天，超过标准的，一般标记，使用一个星期内，即使它的不方便，但利用废物处理，以减轻压力。 32P标记应注意保护，1-1.5cm厚的聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃隔离保护动作，应避免直接接触。胸部的经营者应穿戴个人仪表，定期检测。的实验中，应用程序特定的探测器（盖革 - 米勒探测器），检查的工作区，手，衣服等，以避免污染发生。其他同位素标记的，还应当指出的辐射防护。

？的非放射性标记的ELISA和化学符号。的ELISA法和免疫测定ELISA方法是类似的，除了被标记，而不是该核酸的标记抗体，其实，也称为标记抗体作为探针，应当指出的文献读取。许多商品是生物素（生物素），分别与地高辛，生物素-dUTP标记，生物素的DATP地高辛-dUTP的，等等。血凝素（抗生物素蛋白）是已知的一个非常高的亲和性和生物过氧化物酶或碱性磷酸酶（血凝素 - 酶），血凝素标记时，最终形成的杂交反应：探针 - 生物素数 - 血凝素 - 酶复合物（A，B，C）。酶催化底物显色，观察结果。不同于一般的酶反应底物，ABC法底物显色不溶物，观察结果。酶的复数形式，重现性差，成本高，但易于运输保存，灵敏度和辐射标记的相当可观的。某些化学??标记是使用相应的酶标记的抗体，以形成特定的复合物，上述方法比较，和一些可以是自发光的。化学标记方法简单，成本低，但灵敏度相对较低。