三氯乙酸与硫脲对酶活影响的异同

看是什么酶了，比如我们做过的蛋白酶就是：

样品管处理：吸取0.5%酪蛋白溶液2 mL置于试管中，在40℃水浴中预热5分钟后加入同样条件下预热好的酶液1 mL，立即计时。反应10分钟后，由水浴取出，并立即加入10%三氯乙酸溶液3 mL，室温下放置15分钟后，4℃、6000转/分离心10分钟。

↓

对照管处理：同时另作一对照管，即取酶液1 mL，先加入3 mL10%的三氯乙酸溶液，然后再加入0.5%的酪蛋白溶液2 mL，40℃水浴中保温10分钟，室温放置15分钟，4℃、6000转/分离心10分钟。

↓

显色：取3支试管，编号。分别加入样品处理及对照处理上清液和水各1 mL，然后各加入0.55mol/L的碳酸钠溶液5 mL，混匀，立即加入Folin试剂1 mL，立即混匀，40℃水浴中显色15分钟。

↓

吸光度测定：以加水的那一管作为空白，测定样品及对照在680nm下的吸光度A680。

希望有用

1.多酚氧化酶的催化作用（按表1加入各试剂）

加入各试剂后混匀

37

℃保温

8min

现象：

1

号试管变成深褐色，

2

、

3

号试管颜色无明显变化。

结论：有底物和酶同时存在的情况下才发生反应。

2.多酚氧化酶的化学性质（按表2加入各试剂）

加入各试剂后混匀

37

℃保温

10min

现象：

1

号试管变成深褐色，

2

号试管颜色无明显变化。

结论：

5%

三氯乙酸很明显的降低了多酚氧化酶的活性，为抑制剂。

3.底物的专一性（按表3加入各试剂加入各试剂后混匀

37

℃保温

9min

现象：

1

号试管变成深褐色，

2

号试管无明显变化。

结论：多酚氧化酶对邻二苯酚有专一性。

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一、抗坏血酸含量测定

【原理】

还原型抗坏血酸(AsA)可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉(4，7－二苯基－1，10－菲咯啉，BP)反应形成红色螯合物。在534nM波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸(DAsA)可由二硫苏糖醇(DTT)还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型AsA，即为DAsA含量。

【仪器与用具】

离心机；分光光度计；研钵；试管。

【试剂】

5％三氯乙酸(TCA)；

20％TCA；

无水乙醇溶液；

0�4％磷酸—乙醇溶液；

0�5％BP—乙醇溶液；

0�03％FeCl3—乙醇溶液；

0�6g／L DTT；

NA2HPO4—NAOH溶液：以0�2Mol／L NA2HPO4和1�2Mol／L NAOH等量混合；

60MMol／L DTT—乙醇。

【方法】

1.制作标准曲线配制浓度为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14Mg／L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1�0Ml于试管中，加入1�0Ml 5％TCA、1.0ml乙醇摇匀,再依次加入0�5Ml 0�4%H3PO4—乙醇、1�0Ml 0�5％BP—乙醇、0�5Ml 0�03%FeCl3—乙醇，总体积5�0Ml。将溶液置于30℃下反应90Min，然后测定A534。以AsA浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。

2.提取取植物叶片1�0g，按1∶5(W／V)加入5%TCA研磨，4000r／Min离心10Min，上清液供测定。

3.测定

(1)AsA测定取1.0Ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。

(2)DAsA测定向1.0Ml样品液中加入0�5Ml 60MMol／L DTT—乙醇溶液，用NA2HPO4—NAOH混合液，将溶液PH调至7～8,置于室温下10Min，使DAsA还原。然后加入0�5Ml 20％TCA，把PH调至1～2。按AsA相同方法进行测定，计算出总AsA含量，从中减去AsA,即得DAsA含量。

二、抗坏血酸过氧化物酶(AsA－POD)活性

【原理】

AsA－POD催化AsA与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸(MDAsA)。随着AsA被氧化，溶液中290nM波长下的消光值(A290)下降，根据单位时间内A290减少值，计算AsA－POD活性。AsA氧化量按消光系数2�8(MMol／L)／CM计算，酶活性可用每克鲜重每小时氧化AsA的微摩尔数μMol／g·H表示。

【仪器】

离心机；紫外分光光度计；研钵；试管。

【试剂】

50MMol／L K2PO4—KH2PO4缓冲液(PH7�0，内含0�1MMol／L EDTA－NA2)�

0�3MMol／L AsA；

20μMol／L AsA；

0�06MMol／L H2O2。

【方法】

1�酶液制备取1�0g植物叶片剪碎，按1∶3(W／V)加入预冷的50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液进行研磨提取，用两层纱布过滤，滤液在4000r／Min下离心10Min，上清液作酶粗提液供测定。

2.酶活性测定3Ml反应混合液中含50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液(PH7�0)，0.1MMol／L EDTA－NA2，0.3MMol／L AsA，0�06MMol／L H2O2和0.1Ml酶液。加入H2O2后立即在20℃下测定10～30s内的A290变化，计算单位时间内AsA减少量及酶活性。

【思考题】

1.抗坏血酸在植物体内有何生理意义�

2.简述抗坏血酸过氧化物酶活性的测定原理。

做一个实验，文献准备很重要。你要提取什么酶，性质如何，选取什么材料，什么方法，事先都要想好。比如使用三氯乙酸沉淀，还是用乙醇、丙酮等沉淀，在什么浓度、pH下沉淀，加入多少沉淀剂，怎么离心，等等，这些在做实验前都应该已经考虑过了。

呵呵，别灰心。科研之路很辛苦的，如果做得好，也有乐趣。

2，调节PH，加强酸强碱试剂，破坏原有酶促反应的PH环境。如：Hcl,NaoH溶液

3，加入相应酶的抑制剂。