苯酚硫酸法是什么?
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物,再以比色法测定。
1、制作标准曲线:准确称取标准葡聚糖(或葡萄糖)20mg于500ml容量瓶中,加水至刻度,分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1。8ml,各以蒸馏水补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml。
摇匀静置30分钟以后于490nm测吸光度,以2.0ml水按同样显色操作为空白,横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度值,得标准曲线。
2、取多糖样品1.0ml,加1.0ml蒸馏水,然后加入6%苯酚1.0ml,迅速加入浓硫酸5.0ml,在涡旋仪上震荡,充分混匀,静置30分钟,于490nm测定吸光度,并将测得的吸光度带入标准曲线中,可获得多糖浓度。
注意
(1)此法简单、快速、灵敏、重复性好,对每种糖仅制作一条标准曲线,颜色持久。
(2)制作标准线宜用相应的标准多糖,如用葡萄糖,应以校正系数0.9校正μg数。
(3)对杂多糖,分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
(4)测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1—0.3之间。比如:小于0.1之下可以考虑取样品时取2克,仍取0.2ml样品液,如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
1. 浓硫酸:分析纯,95.5%
2. 80%苯酚:80克苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。
3. 6%苯酚:临用前以80%苯酚配制。(每次测定均需现配)
4. 标准葡聚糖(Dextran,瑞典Pharmacia),或分析纯葡萄糖。
5. 15%三氯乙酸(15%TCA):15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。
6. 5%三氯乙酸(5%TCA):25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。
7. 6mol/L 氢氧化钠:120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8. 6mol/L 盐酸
制备苯酚制剂的目的,就是因为苯酚的纯度对实验影响很大,不得已而为之。
如果限于实验室条件不能进行高温蒸馏,那么建议你采用蒽酮硫酸法测定多糖,很可能比NDS测定方法重现性还好,但需注意一点:蒽酮剧毒!所以一般用的都是NDS方法,虽然麻烦一些。
苯酚硫酸法师利用糖在浓硫酸作用下,水解生成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚缩合成橙黄色化合物。在波长490 nm处和一定的浓度范围内,其吸光度与多糖含量呈线性关系正比,从而可以利用分光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。
此时,对于杂聚多糖,只用葡萄糖溶液做标准曲线,是不准的。有时用多种单糖标准品作标准曲线,但不同单糖标准品在相同浓度下其吸收值相差较大(葡萄糖显色最大),分别制作标准曲线对杂多糖测定的结果也就不同。因此,苯酚硫酸法对于成分复杂的多糖来说,只能是一个参考。
对杂多糖往往不用单一的苯酚硫酸法。比如,采用气相色谱法对杂多糖的组成进行分析,再配合苯酚硫酸法可以得到更可靠的结果,比单用苯酚 硫酸法更可靠、准确。
苯酚硫酸法测多糖。
是将多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解,产生单糖。
单糖中再加入苯酚反应(在强酸条件下)生成橙色衍生物。
在波长490nm左右处和一定浓度范围内,该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系,从而可用比色法测定其含量。
若要一起加入,先配成溶液的话。要先将苯酚溶于(温)水,然后将浓硫酸绶绶倒入。切不可将溶液注入水中。
1、制作标准线宜用相应的标准多糖,如用葡萄糖,应以校正系数0.9校正μg数。
2、对杂多糖,分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
3、测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如:小于0.1之下可以考虑取样品时取2克,仍取0.2ml样品液,如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
扩展资料:
苯酚法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物,在10~100ug范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且在485nm波长下有最大吸收峰,故可用比色法在此波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单,灵敏度高,基本不受蛋白质存在的影响,并且产生的颜色稳定160min以上。
参考资料来源:百度百科-苯酚法测可溶性糖
参考资料来源:百度百科-苯酚-硫酸法
一般单糖,蛋白质,色素等都会有影响,所以测定之前要把这些干扰都除去。
在不同文献里发现不同的苯酚溶液配置方法,有的直接配制,有的要添加Al片、NaHCO3或氢氧化钠后蒸馏。你是用来测多糖总量的吧,再加上如果用分光光度法仪器的误差,那我想你的苯酚是分析纯的话应该可以直接配制,且注意温度控制(苯酚室温下为固态)。如果精度要求高还是用色谱方面的相关技术,而且苯酚要重蒸馏。怎么配取决于你对实验结果的要求(如精度要求,多糖成分是常量还是微量甚至痕量)。
这是我参照文献和结合自己实验工作做出的回答,本人才疏学浅,能力只能至此。