在石蜡切片技术中，为什么要连续两次用到二甲苯呢？
为什么石蜡切片染色后还要用二甲苯处理
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匿名用户
在光镜下可长期反复观察，在95%及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度，再将洁净盖玻片倾斜放下，因此病理医生最后还需要根据石蜡切片作出准确诊断，以免出现气泡。二甲苯透明后，需数日才能完成1个周期，封片后即制成永久性玻片标本；如染液为酒精配制，迅速擦去材料周围多余液体染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水。虽然冰冻切片大大快于石蜡切片，掌握适宜的染色时间、科研及病理诊断及复察。石蜡制片程序及环节繁多。病理常规制片过程中已简化了一些细的环节或缩短了部分处理时间以适应临床需要（可缩短至2天），但所显示的形态结构却不如前者，则应缩短在酒精中的时间，才能达到较好的染色效果。注意有些染料需特定厂家生产的产品，但切片可长期保存，以免脱色，滴加适量（1～2滴）中性树胶，并可利用蜡块作其他项目的回顾性研究，供教学
你在粘片后，直接将玻片放入
二甲苯
里面了么，如果是这样的话，你看看玻片上面是否还存在多余的水分，如果有，我建议你在粘片后，先将之烘干，等水分完全干去，再将玻片投入二甲苯里，你试试，希望对你有帮助。
石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.
石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.
取材
用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定.
取材的注意事项如下:
(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织取病理材料时,应设置对照材料.
(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm小段叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.
(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.
(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行)对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.
(二)固定
将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.
良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.
常用固定液:
简单固定液 以一种化学药品配制的固定液.
⑴ 乙醇 为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.
⑵ 甲醛 为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.
⑶ 醋酸 为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.
2. 混合固定液:
由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:① 优缺点互补② 膨胀与收缩相互平衡③ 强氧化剂与还原剂应分别配置.
常用混合固定液有下列几种:
⑴ FAA 固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇) 广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24 h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.
⑵ 纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存主要用于显示分裂相.
(三)抽气
植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.
一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.
(四)洗涤
固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24 h.
(五)脱水
材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.
脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料.
(六)透明
透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.
二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..
(七)浸蜡
是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.
浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.
每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.
(八)包埋
材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.
操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.
(九)切片
即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.
(十)贴片
是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.
常用的粘片剂有下列二种:
(1) 明胶黏片剂
(2) 蛋清黏片剂
(十一) 染色
即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.
染色方法可分为下列几类:
① 单染 只用一种染料染色.
② 双重染色 两种染料染色,如番红--固绿苏木精---曙红.
③ 多重染色 多种染料染色,如番红—固绿—桔红G酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.
(十二) 封藏
封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.
方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.
冷冻切片法：
冷冻切片的制作方法
（1）低温恒冷箱冷冻切片制作法
1．本室现有Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。
冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。
2．操作方法及步骤：
①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。
3．冰冻切片时的注意事项：
①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。
⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。
⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
4．冰冻切片的快速染色法
冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
方法：
① 切片固定30秒－1分钟。
② 水洗。
③ 染苏木素3－5分钟。
④分化。
⑤ 于碱水中返蓝20秒。
⑥ 伊红染色10－20秒。
⑦脱水，透明，中性树胶封固。
冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。
冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。
材料在脱尽水分后还需经过与石蜡,树胶相混合的溶剂来处理,这种溶剂能使材料清净透明,增加组织折光系数.常用的透明剂有以下两种:
1.二甲苯(Xylol) 是目前应用最广的透明剂,它作用迅速,能与酒精混合,溶解石蜡,又可与封藏用的树胶混合,但使用时必须脱净水分,否则发生乳状混浊.为了避免材料收缩,应采取逐步从纯酒精过渡到二甲苯中.即无水酒精→1/2无水酒精+1/2二甲苯→二甲苯.
2.氯仿(Chloroform).它比二甲苯挥发快,渗透力较弱,对材料收缩也较小,也能与酒精混合又能溶解石蜡,故常用在石蜡制片中浸蜡前透明.由于氯仿能破坏染色,因此染色后不宜用氯仿作透明剂.使用氯仿应逐渐增加浓度至纯氯仿,一般采用五级,即1/5氯仿(4/5纯酒) →2/5→3/5→4/5→纯氯仿(两次).
一石蜡包埋切片制作法
这是最常用的切片法。以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的固态结构。用切片机制取极薄的切片。为了让石蜡能浸入组织内部，需将组织经过脱水等处理。过程大致如下：
⑴固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。因此，需用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。凡供永久保存的标本都需经固定处理。
常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。还有由几种试剂配成的固定液，例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。
⑵脱水：是将组织细胞所含水分除去。通常用乙醇（Alcohol，酒精），浓度递升到 100%。此过程还使组织块进一步硬化。
⑶透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代，以便石蜡浸入。通常用二甲苯（xylene）为透明剂。
⑷浸蜡：在温箱内进行。已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织，作为支持介质。
⑸包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包埋。
⑹切片：用切片机。常用的切片机有轮转式、平推式的。用轮转式的易于切出连续切片。切片厚度随制片目的而调整。教学标本厚度多是5~6μm。
⑺贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。
二冷冻切片法
冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。冷冻切片法需有冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。恒冷切片机是高级冷冻切片设备。它有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。恒冷箱的作用类似冰箱，可在一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温度的干扰。切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。
冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。并且，由于不需经脱水、透明、浸蜡等过程中有机溶剂的处理，及湿箱浸蜡热的影响，甚至可不经固定。所以能很好地保存组织细胞的各种成分和酶的活性，因此在酶的组织化学研究中常用此切片法。
二、显示标本结构成分的染色法
一苏木素伊红染色法（HE染色法）
为最常用的染色法。该法应用于各种组织的染色，是组织学技术的基本方法，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，只是对不同包埋的切片法处理略有不同。下面简介石蜡包埋切片的HE染色法。
1、脱蜡：石蜡切片的组织内部充满石蜡，不能使水溶性染液着色，因此在染色前必须首先用二甲苯将石蜡脱掉，共两次。
2、下行入水：将已脱蜡的标本浸入无水酒精及各级酒精，使组织逐步接近水。3、蒸馏水略洗。
4、苏木素溶液染色约5—15分钟
5、自来水洗去多余染料。
6、入稀释的盐酸酒精溶液中分色，边分色边镜检，至核呈红紫色，细胞质无
色为合适。
7、分色后用自来水或加数滴氨水碱化，直至细胞核变成蓝色。这一步骤也可称为“蓝化”。
8、入蒸馏水洗去碱性水分。
9、入70%酒精→80%酒精各5分钟。
10、入伊红染液染色30秒至数分钟。
11、以95%酒精对伊红分色，至胞浆，结缔组织等呈桃红色。
12、上行脱水：染色后的切片，因组织内含水而不透明，不能清晰地观察其微细结构。因此，须将组织内的水分经各级酒精→无水酒精逐步置换，最后进入不含水份的透明剂内。
13、透明：入二甲苯透明剂，二次（各数分钟）。
14、取出切片：将组织周围多余的二甲苯擦去，滴树胶后加盖玻片封固。
结果：细胞核蓝紫色，胞浆、胶原纤维、肌纤维为桃红色，嗜酸性颗粒为鲜红色，弹性纤维呈明亮桃红色。
二组织化学和细胞化学染色法
组织化学和细胞化学，是将物理和化学的技术运用到组织标本，用显微镜和化学分析方法来研究组织和细胞内的化学成分，并观察该化学成分在组织、细胞内的定位、含量及其变化规律。这些化学成分借着化学反应所产生的不溶性着色物质来显示。对于某些化学成分，例如：Fe++糖原、核酸等，可以用直接或间接的化学反应产生着色沉淀而显示其部位和相对含量。对于酶类，显示它的活性，须有该种酶的底物（被该种酶作用的物质），由酶对底物的分解，直接或间接地生成着色物质而被显示。凡是在光学显微镜下观察细胞原位显示的化学物质，称组织化学，若用电镜观察细胞原位化学成分的着色部位，则称电镜细胞化学，下面从原理方面简要介绍几种常用的组织化学染色技术：
1、显示琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的硝基-BT法：
（Succinate dehydrogenase）
⑴酶的定位及生物学意义：
琥珀酸脱氢酶是线粒体标志酶，其存在于所有有氧呼吸的细胞，和线粒体内膜紧密结合。该酶不需辅酶而自身有黄素蛋白（FP,Flavoprotein）为辅基。在组化反应中常用来反映三羧酸循环的情况。其催化过程如下：
弱-单甲（紫红色）
HOOC-CH2-CH2-COOHFPH2四唑（甲）↓
（有色）强-双甲（深紫蓝色）
（琥珀酸）（黄素蛋白）
HOOC-CH=CH=COOHFPH2四唑（无色）
（延胡索酸）
⑵原理：上述的反应最后一步的原理是，硝基-BT（Nitro-blue tetrozolyum，四唑氮蓝）系异环族化合物四唑盐，当它接受氢时，本身被还原为有色沉淀产物（甲
）（Formazan）。
⑶孵育液配制：
A液（贮备液）
0.2M磷酸缓冲液（PH7.6）10ml等量混合
0.2M琥珀酸钠（S01.succinate） 10ml备用
B液：
硝基四唑（Nitro-Br）2mg
2ml
0.2M磷酸缓冲液（PH7.6） 2ml
取：A液2ml
B液2ml孵育液
聚乙烯吡烷酮（PVP） 300mg
⑷方法：
①新鲜恒冷箱冷冻切片，厚6~8μm，平贴在盖玻片上。
②滴染法：将有冷冻切片的盖玻片（标本面朝上）平放于预热好的培养皿中（底部垫一湿滤纸），滴加孵育液至全部覆盖组织，于37℃温箱中孵育45~60分钟（肝，心肌组织15分钟即可）。
③于生理盐水中冲洗二次（轻晃，以防脱片）。
④10%福尔马林生理盐水固定10分钟。
⑤15%酒精浸洗5分钟（换二次）。
⑥甘油明胶封片。
⑸结果：酶活性强处呈蓝色颗粒（双甲沉淀），酶活性较低时形成紫红色单甲。在光镜下，该酶活性于肝小叶内分布呈明显分带现象，周边带强于中央带。在心肌细胞纵切面，酶活性颗粒沿心肌细胞长轴整齐排列，相邻心肌细胞的空白处为闰盘。
2、显示葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的铅法：
（Glucosel-phosphate phosphohydrolase）
①酶的定位及其生物学意义：
该酶主要位于内质网，是内质网的标志酶。G-6-Pase参与糖代谢，能水解葡萄糖-6-磷酸而释放出葡萄糖和磷酸。
⑵原理：G-6-Pase将底物（葡萄糖-6-磷酸钾盐）水解产生磷酸离子，后者被孵育液中的硝酸铅所捕获，最终反应物为颗粒状的硫化铅沉淀，其反应式如下：
酶Pb(NO3)2
葡萄糖-6-磷酸钾+H2O葡萄糖+磷酸
(NH4)2S
Pb2(PO4)2PbS↓
(无色)（棕色）
（试剂配制及方法详见组织学技术专著）
⑶结果：酶活性部位呈棕色硫化铅颗粒沉淀。在光镜下G-6-Pase活性颗粒较均匀地分布于胞质中。
3、显示碱性磷酸酶（APL）的钙钴法（Alkaline phosphohydrolase）
⑴酶的定位及其生物学意义：
ALP在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解，参与磷酸根的跨膜转运过程，并有磷酸转移的作用，故在细胞膜上运输较活跃，如毛细血管内皮细胞，肾近曲小管刷状缘，肠上皮纹状缘等处，该酶的活性较高。
⑵原理：ALP将磷酸盐底物（如β-甘油磷酸钠等）分解产生磷酸根离子，后者为孵育液中的氯化钙捕获生成磷酸钙沉淀，但该沉淀为非金属盐，需加入硝酸钴，使其生成磷酸钴沉淀，因无色，再需通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴沉淀而被显示。在PH9.2—9.4环境中表现最大活性。反应式如下：
ALPCa++
β-甘油磷酸钠磷酸离子Ca2(PO4)2
Co(NO3)2(NH4)2S
CO2（PO4）2CoS↓
（无色）（棕黑色）
⑶结果：酶活性部位为棕黑色CoS沉淀。
4、显示核酸的甲绿一派喏宁（Methyl green-pyronln）染色：
⑴原理：甲绿和派喏宁都是碱性染料，对两种核酸（DNA和RNA）能分别染色，其机制可能在于两种核酸分子都是多聚体，但聚合程度有所不同。甲绿具有两个带电荷的氨基，而派喏宁只有一个。因此在混合的染液中，二者竞争的结果是甲绿易与聚合程度较高的DNA结合呈现蓝绿色，而派喏宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色。
（试剂制备及方法详见组织学技术专著）
⑶结果：核内DNA呈蓝绿色，核仁及胞质内RNA呈桃红色。
5、显示糖原的过碘酸雪夫氏（PAS）反应：
⑴原理：糖原是一种动物多糖，无色，富含于肝细胞和肌细胞胞质中。PAS反应（Periodic acid schiff Reaction）能在糖原所在部位生成紫红色物质，从而将之显示。RAS反应分为两步：首先是强氧化剂过碘酸（Periodic acid,分子式为HIO4），将糖原中的葡萄糖分子的C-C键打开，将CHOH-CHOH氧化，生成二醛基，然后Schiff试剂中的无色亚硫酸品红分子与糖的醛基结合，生成新的紫红色复合物。
HIO4schiff试剂
多糖醛基紫红色反应产物
（氧化）
（试剂配制及方法详见组织学技术专著）
⑵结果：糖原呈紫红色颗粒状。
切片一系列工作完成后，就要进行染色和封片了。由于要染色的切片尚包在石蜡中，而所用的染色液都为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水。与固定的组织块脱水、透明的步骤相反，石蜡切片先在二甲苯中溶去石蜡，再经过各级酒精，下行至水。
染色后，如果组织片中有水分，则光不宜通透，在显微镜下观察不清组织的结构，所以必须经过脱水。
给你我们学校的实验讲义看看吧～希望对你有帮助～有不懂的地方问我～
实验一 石蜡包埋切片技术
实验目的：1、学习石蜡包埋切片技术的基本原理和基本步骤；
2、掌握石蜡包埋切片技术。
实验原理：
大家在生物学实验时，曾经观察过动物组织和植物组织的切片。通过光学显微镜，我们可以观察到细胞内部的结构（例如细胞核、细胞质、肌肉组织的横纹等）、细胞相互间的联系以及组织的构成等。那么，如何来制作这种切片呢？其过程是比较复杂的，我们利用3—4次实验来学习组织切片的制作。
大家知道，我们要在显微镜下研究生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察的，因为整个动、植物体大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，一定要经过特殊的处理，使要观察的材料先减少它的厚度和体积，使光线能透过才能用显微镜观察。通常应用的有两种方法：一种是非切片法，即用物理或化学的方法将生物体组织分离成为单个细胞或薄片，例如我们在生物学实验曾做过口腔上皮的观察、洋葱鳞茎表皮的观察。这种方法的不足之处在于细胞彼此间相互的联系不一定观察到。另外一种为切片法，即用刀将标本切成薄片。
非切片法比较简单，一学就会，我们这里不作介绍。
切片法也分徒手切片法和切片机切片法。最简单的切片法是将新鲜植物材料直接用刀切成薄片，称之为徒手切片法。切片机切片法是用特殊的切片机来切片，切片的厚度可薄到几个微米。因此，切片机的发明与应用也是细胞学诞生的重要因素。
切片机切组织用的也是刀（切片刀），所要切的组织要有一定的软硬度，如刀切肉（新鲜、冷冻）。但大部分生物材料比较柔软，所以为了能切出薄片，必须先使所切材料有一定的软硬度。一些包埋剂可以达到这个目的，如石蜡，它融化时可渗入到组织内部；凝固时，使整个组织有一定的软硬度，正好能切出很薄的切片，故称为石蜡包埋切片法。另外还有火棉胶包埋切片法（火棉胶做包埋剂）、冰冻切片法（使组织冷冻到一定的硬度）等。其中最常用的切片方法还是石蜡包埋切片法，我们这里重点学习石蜡包埋切片技术。
实验器材：
（一）小鼠、小广口瓶、标签、量筒、烧杯、95%酒精、无水酒精、蒸馏水、手术刀、剪刀、镊子、平皿、石蜡块、滤纸、甲醛液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。
（二）恒温箱、融蜡、纸盒、烫板、支架、酒精灯、火柴、小镊子、滤纸。（擦载玻片、磨刀、液体石蜡）。
（三）手术刀、木板、酒精灯、火柴、锯条、木块、塑料板、切片刀、切片机、毛笔、小镊子、载玻片、蛋白甘油、恒温水浴箱、温度计、大白盘。
实验步骤：
制作小鼠肝、脾、肾、小肠等切片。
1、取材：取材是指从动物或植物体上割取所要观察的组织材料，比如植物的茎、叶，动物的肝脏、小肠等。
取材时应注意以下几点：
（1）新鲜：在割取材料时应愈快愈好，否则动植物体的细胞成分、结构及分布等就会发生改变。
（2）防止人为损伤：如生拉硬拽、挤压等，以免出现人为损伤。
（3）大小：0.5 cm × 0.5 cm × 0.2cm。
2、固定：机体死亡或组织离体后，组织细胞由于血液供应停止，即可发生缺氧，导致生物氧化过程停止。相反，细胞内的无氧酵解酶类活跃，使组织内蛋白质、糖、脂肪降解，导致组织发生自溶。另外，组织也可因污染细菌而发生腐败。因此，为了使细胞和组织结构保持生活时的状态，必须进行适当的固定。固定的目的在于保存组织内细胞的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。
固定组织的物质——固定剂——具有凝固或沉淀组织蛋白的作用，因此能抑制酵解酶类的活动和细菌的繁殖，从而呈现对组织的固定作用。
固定剂的种类很多，最常见的有乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞和锇酸等8种。各种固定剂对蛋白质、脂肪、糖等作用不同，因此，单一的固定剂不能保存所有的成分，故多用混合固定剂。
各种书籍对固定剂的介绍特别多，如化学性质、固定的原理、固定组织的优缺点等，由于时间的所限，我们这里不作详细介绍，仅介绍几种常见的固定液及其配方和用途。
（1）10%福尔马林液：1份甲醛液 + 9份蒸馏水
市场上出售的甲醛液约含37-40%的甲醛，10%福尔马林液实际上仅含3.7-4.0%的甲醛。
适用范围：各种组织。但是经10%福尔马林液固定的组织，细胞核染色较好，而细胞质染色较差。
处理：组织块一般固定16-24h，长时间亦可，甚至可用来长期保存组织块。短时间固定的组织块不需水洗，可直接转入70%酒精脱水。
（2）Bouin氏液：苦味酸饱和水溶液（1.22%） 75ml （15）
甲醛液25ml （5）
冰醋酸5ml （1）
适用范围：各种动物组织及植物组织的根尖，是动物组织良好的固定液。
处理：固定24h，也可在此液长期保存。流水冲洗或不经水洗直接入70%酒精脱水。
（3）Zenker氏液： 甲液：氯化汞（升汞） 5g
重铬酸钾 2.5g
硫酸钠 1g
蒸馏水 100ml
乙液：冰醋酸 5ml
使用前将甲、乙两液混合。
适用范围:为一般动物组织的优良固定液，经其固定的组织，细胞核及细胞质染色颇为清晰。
处理：固定时间为16-24h，然后流水冲洗一夜以洗去氯化汞，再入70%酒精脱水。切片染色前要用碘液除去汞沉淀。
（4）Gendre氏液： 苦味酸饱和酒精液（8.96g/100ml95%酒精） 85ml
甲醛液 10ml
冰醋酸 5ml
适用范围：用于检查动物组织中的糖原（因为糖原溶于水）。
处理：固定3-6h，直接转入95%酒精脱水。
（5）Carnoy氏液： 无水乙醇60ml
三氯甲烷30ml
冰醋酸 10ml
适用范围：用于检查动物组织的核酸、糖原等。
处理：固定2-6h，直接转入95%酒精脱水。
还有多种多样的其它固定液。固定液的选择应根据所要固定的材料以及检查的目的而定。
3、冲洗：材料自固定液中取出后，需立即冲洗，使其中所有的固定液全部除去，以妨碍染色。
有些固定液，如10%福尔马林液、Bouin氏液固定的材料，若时间较短的话可不必冲洗。但时间过长亦需冲洗。
冲洗的方法：组织块放在瓶内，胶管插入瓶内接通自来水，瓶口用纱布包住。流水冲洗一夜，即能达到冲洗的目的。
4、脱水：脱水的目的在于使组织中的水分完全除去。因为组织块将来要在石蜡
中包埋，而水和石蜡是不相溶的。必须经过脱水后，才能进入包埋阶段。
常用的脱水剂有乙醇、丙酮、正丁醇等，最常用的还是乙醇。利用脱水剂吸水的特性，在各级浓度脱水剂中逐渐吸取组织中的水分。乙醇脱水的过程一般从70%乙醇开始，经80%、90%、95%、100%（二次）而完成脱水过程。每向后转移前，须先将组织块上的液体用吸水纸吸干，以免影响后续乙醇的浓度。
脱水时应注意：（1）在高浓度或无水乙醇中，每级停留的时间不宜太长，否则可使组织收缩变脆，影响切片；（2）如需过夜，应停留在70%乙醇中，也可长期保存，可防止因时间倒不开而影响后续步骤。
5、透明：脱水后是否可以进入包埋呢？但因脱水剂与石蜡也不相溶，因此在包
埋前，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于石蜡的物质——透明剂——来起中间置
换作用。
所以，透明的目的在于使组织中的乙醇或丙酮被透明剂所代替，以使石蜡能很顺利地进入组织中。另外，还能增强组织的折光系数，故称透明剂。
透明剂的种类很多，常用的有二甲苯、甲苯、苯等。二甲苯为最常用的透明剂，二甲苯能溶于醇及醚，亦为石蜡溶剂，但不溶于水，它的透明力很强。
透明过程：一般经过1/2二甲苯-1/2无水乙醇，两次二甲苯。
透明彻底的标准：胃、肠、结缔组织等比较透明；肝、肾、心、肌肉等组织呈暗红色浸油状态，则说明脱水、透明良好。如果组织进入二甲苯30min以后还不变色，或中心有白色，说明水分未脱净，应返回无水乙醇继续脱水。透明这一步至关重要，若透明时间不足，则石蜡进不去，不能切片；若透明时间过长，则使组织收缩变脆、变硬，切片易碎。这一步要靠经验。
6、浸蜡：浸蜡就是将石蜡透入整个组织的过程。
所谓石蜡包埋切片法，是用石蜡来浸透、包埋组织块，再进行切片和染色的
制片方法。
石蜡为最常用的包埋剂，有几种不同熔点的石蜡，通常所用的石蜡的熔点为54-58℃。
浸蜡过程：在60℃的温箱内已融化的石蜡中经两次各1h，使石蜡浸透组织。
浸蜡时注意温度不宜过高，浸蜡时间亦不宜过长，否则会引起组织变硬、变脆，影响切片。
7、包埋：包埋就是被石蜡浸透的组织连同溶化的石蜡，一起倒入一定形状的器皿（如纸盒、平皿）中，然后使其凝固成蜡块的过程。
包埋的过程：（1）折叠纸盒；
（2）用酒精灯加热温台及纸盒；
（3）往纸盒中倒入溶化的石蜡；
（4）放入组织块，切面向下，并拨正位置；
（5）蜡块凝固。
从取材到包埋是一个连续的过程，往往连续几天，如果没有计划、没有完善的安排，就有可能和其他上课时间发生冲突，或造成半夜出勤。有时单凭记忆，把前后顺序颠倒或超过了规定时间，会造成实验失败。因此需预先编制一个日程表。
【建议时间】
乙醇脱水：70%：16：30
80%：第二天7：20
90%：9：20
95%：11：00
100%(Ⅰ):12:00
100%(Ⅱ):13:00
透明：1/2二甲苯-1/2无水乙醇：14：00
二甲苯（Ⅰ）：14：20
二甲苯（Ⅱ）：14：40
浸蜡：石蜡（Ⅰ）：15：00
石蜡（Ⅱ）：16：00
包埋：17：00
注意事项：（1）动作要迅速；（2）融蜡别滴到桌面、地上。
8、切片：在包埋后，就可以进行切片。在切片之前，还需对包埋好的组织块进行修整，并贴附于木块上，才能进行切片。
修块：以每一组织块为单位，用小刀将组织块大体修成长方形或梯形，组织的周围须留1-2mm宽的蜡边。
固着：用酒精灯烧热金属片，将组织块切面的对立面稍烫熔一下，并立即贴于木块上。
切片机的构造：
切片机是用来做各种组织切片的一种仪器，其样式很多，性能也不一样，一般可分为两大类型，即滑行式切片机与旋转式切片机。我们使用的是旋转式切片机。其主要结构分为3部分：（1）控制切片厚度的微动装置；（2）供装置切片刀的夹刀部分；（3）供装置组织块的夹物部分。旋转轮每旋转一次，微动装置就按所调节好的切片厚度以水平方向将组织块向前推进一片的厚度。
切片操作：
（1）固定切片刀：刀刃向上，保持水平。调好角度，一般在4-6度。
（2）固定组织块。
（3）调整所需要的切片厚度：一般在6-10微米。
（4）移动持刀器，或拔开齿轮上的牵引钩，前后转动齿轮以移动组织块固定器，调节组织块表面和刀刃的距离，以刚要接近时为止。
（5）调整组织块与刀刃之间的角度和位置：组织块的切面及上下边须与刀刃平行。
（6）粗切：右手摇轮，左手转动齿轮，慢慢将组织块切到组织本身。
（7）切片：右手转动摇轮，转一圈可切下一片，切第二片与第一片连在一起，即成连续切片。左手用镊子或毛笔提起切片的下端，轻轻向自身方向拽，使切片成连续的带状。
（8）展片：停止切片，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带跳起，靠刀刃的一面向下，慢慢接触40-45℃的水面，借助水的表面张力使其在水面展开。如有小的皱褶，用小镊子轻轻分开。应注意：水温过高，易使切片全部融化；水温过低，切片不宜伸展。
（9）贴片：即将切片贴在载玻片上。先将连续切片分成一片或小段。将载玻片1/2处均匀涂一层薄薄的蛋白甘油（等量的鸡蛋清和甘油混合而成，防止脱片。切勿涂得过多！），将载玻片垂直插入水中，以涂有蛋白甘油的面贴近组织片，提起载玻片使组织片贴附在载玻片上。用小镊子将切片摆在载玻片1/3和2/3的交界处，并摆正位置。然后在52-60℃恒温箱烤干。
整个石蜡包埋切片技术至此全部结束。
实验二 苏木精-伊红染色
实验目的：1、了解染色的基本原理和基本方法；
2、掌握苏木精-伊红染色方法。
实验原理：
一、染料的一般知识
1、染料的染色原理：（1）化学作用：染料的性质有酸、碱、中性之别，那么组织中的碱性部分（如细胞质）易和酸性染料亲和而发生作用，组织中的酸性部分（如染色质）易和碱性染料亲和而发生作用。（2）物理作用：指吸附或溶解作用。组织蛋白和某些染料有相互吸附的作用。
2、媒染剂、促染剂和分化剂
媒染剂：某些天然染料（如苏木精），本身无着色性，要与其他物质结合后才具有着色性，这些被结合的物质称为媒染剂，如许多铁盐、铬盐及钾盐等。
促染剂：是促进染料着色性的物质，如冰醋酸是伊红的促染剂。
分化剂：能使切片上需要显示的结构清晰，而使不需要显示的结构脱去颜色的物质。如1%盐酸酒精。
一、苏木精-伊红染色（H.E染色）
所做出的石蜡包埋切片可应用的染色方法很多，应根据不同的检查目的而选用不同的染色方法。而最为常用的染色法为H.E染色。
1、苏木精(苏木素、苏木紫)（hematoxylin）：为从苏木中提取。苏木精本身不是染料，不能直接染色，必须经氧化才能染色。可以在空气中自然氧化，但需时很长，所以一般都是加氧化剂（如碘酸钠）氧化。同时，被染材料又须经媒染剂作用后才有着色能力，所以在配制苏木精染液时，都加有媒染剂。苏木精液主要着染细胞核。
有数种不同配方的苏木精液。
Mayer(梅耶)氏苏木精液：
苏木素 1g
硫酸铝钾50g （媒染剂)
碘酸钠 0.2g
水合氯醛50g
柠檬酸 1g
蒸馏水 1000ml
2、伊红（曙红）(eosin)：又分几种，如伊红Y、伊红B等。
伊红对细胞质、肌纤维、胶原纤维具有着色性。
一般用0.5%伊红/70%乙醇液或1%伊红水溶液。
由于苏木精着染细胞核，伊红着染细胞质，所以这种方法称为双重对比染色法。
实验材料：石蜡切片、盖玻片、小镊子、大镊子、树胶、滤纸、纱布、染色缸、二甲苯、乙醇系列、Mayer氏苏木精液、0.5%伊红酒精液（或1%伊红水溶液）、1%盐酸酒精、蒸馏水、显微镜。
实验步骤：
1、切片脱蜡、复水：
由于要染色的切片尚包在石蜡之中，而所用的染色液都为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水。与固定的组织块脱水、透明的步骤相反，石蜡切片先在二甲苯中溶去石蜡，再经过各级酒精，下行至水。
把玻片放入盛有二甲苯的染色缸中以溶去石蜡（20min），再经第二缸二甲苯（10min）。经100%、95%、90%、80%、70%各级酒精、蒸馏水入水，每级3-5min。
2、入苏木精液染5-7min。
3、流水洗去附着染液，（在1%盐酸酒精中蘸3-4下），然后流水冲洗20min使切片由淡红色变为灰兰色。
4、入伊红染液5-7min。
5、脱水、透明：
如果组织片中有水分，则光不宜通透，在显微镜下观察不清组织的结构，所以必须经过脱水。透明剂能增强组织的折光系数。这样，才能在显微镜下观察。
在70%、80%、90%的酒精中每级各蘸3—4下，再经95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精，每级各5min。在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中分别透明10min。
6、封片：
从二甲苯中取出载玻片，未等二甲苯挥发，在组织切片上滴加适量树胶，上面再加盖玻片（倾斜放下）封固。
封片目的：（1）便于保存；（2）应用合适折光率的封藏剂使组织结构能在镜下很清晰地显示出来。
结果：细胞核呈蓝色至深蓝色，细胞质呈淡红色或红色。
作业：1、为什么生物体的组织要经过如此繁琐的步骤才能观察其组织结构？
2、查阅文献，有哪些文章采用石蜡包埋切片和H.E.染色？
3、通过查阅文献，谈一下石蜡包埋切片和H.E.染色的用途。
颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。
切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。
注意事项：
（1）取材动作要迅速，不宜拖太久，以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2．固定
将切好的肝组织用生理盐水洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定30－50min。
注意事项：
（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外贴上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，用黑色铅笔写。
3.洗涤
材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。
4.脱水
材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。
注意事项：
（1）脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分。
（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
（3）在低浓度酒精中，每级停留时间不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。
（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象
5．透明
纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明为止）。
由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
透明注意事项
（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。
（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。
（3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。
6．透蜡
放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。
透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55-60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。
透蜡注意事项
（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；
（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；
（3）操作要迅速，尽量在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。
7.包埋
包埋时，用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。
8.切片
①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。
②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。
③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。
④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。
⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。
⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min为宜。
⑦切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。
⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。
⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。
9.展片、贴片
打开水浴锅，使水温维持在40-45℃，另准备30%乙醇溶液。
① 切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。
② 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开。
③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。
④ 另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端（磨边，粗糙的一端）磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。
10.脱蜡复水
将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时，将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子（可密封），30min至蜡熔化。
之后，石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min。
11.染色
切片放入苏木精中染色约10-30min。
染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。
12.水洗
用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可），但要注意流水不能过大，以防切片脱落。
13.分化
将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。见切片变红，颜色较浅即可。
14.漂洗
切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。
15.脱水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。
16.复染
用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。
伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。
17.脱水Ⅱ
将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。
18.透明
切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。
二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。
19.封藏 ：中性树胶封存
因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。
封藏的方法：
封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
染色结果 ：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。
