如何用乙醇沉淀法浓缩质粒DNA
用乙醇沉淀法浓缩质粒DNA:
提取液中加入等体积预冷的5mol/L
Licl
充分混匀,1000rpm
4℃离心15min,取上清。
加等体积异丙醇,混匀,室温放置10min,10000rpm
4℃离心15min。
弃上清,纯点加入70%乙醇洗涤一次,沉淀风干10~15min。
500ul,含RNA酶的TE(pH8.0)溶解沉淀,室温放置30min。(将质粒RNaesA混合物用酚:氯仿抽提一次,然后用氯仿抽提一次)
用2.5倍体积无水乙醇沉淀质粒,风干10min。
加1ml灭菌水溶解沉淀,加500ul
PEG-MgCl2溶液,充分混合,室温10min,12000rpm
4℃离心15min。
用70%乙醇重悬沉淀,12000rpm
4℃离心15min。
弃上清,沉淀用70%乙醇处理一次,最后将质粒,溶于500ulTE(pH8.0)中,取1ul质粒DNA,100倍稀释后测OD260,计算DNA的浓度,其余封装,-20℃保存备用。
DNA在高盐低pH条件下溶解洗脱,在低盐高pH条件下沉淀。
1.加入1/10体积的3 M CH3COONa(pH 5.2),混匀。
2. 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃放置30~60分钟。
3. 12,000 rpm,4℃离心10 min,回收沉淀。
4. 用1 ml 70%的预冷乙醇清洗沉淀,12,000 rpm,4℃离心10 min
用70%乙醇洗涤DNA,在70%乙醇中用枪头吧沉淀的dna轻轻挑起,离心管轻轻颠倒几次,离心。
因为在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子却可溶。 沉淀DNA时总会加入高浓度的盐,加盐的目的是破坏能使蛋白质保持稳定的两个因素。
dna漂洗注意事项
1、琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。
2、凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,以免影响电泳结果。
3、电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和pH,应常更新电泳缓冲液。
DNA 溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混 合,其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代懈水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。但是加95%的乙醇使总体积增 大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA.一般在室温下放置15-30分钟即可。
乙醇:乙醇是一种有机物,俗称酒精,化学式为CH3CH2OH(C2H6O或C2H5OH)或EtOH,是带有一个羟基的饱和一元醇,在常温、常压下是一种易燃、易挥发的无色透明液体,它的水溶液具有酒香的气味,并略带刺激。有酒的气味和刺激的辛辣滋味,微甘。
乙醇液体密度是0.789g/cm(20C°) ,乙醇气体密度为1.59kg/m,沸点是78.3℃,熔点是-114.1℃,易燃,其蒸气能与空气形成爆炸性混合物,能与水以任意比互溶。能与氯仿、乙醚、甲醇、丙酮和其他多数有机溶剂混溶,相对密度(d15.56)0.816。
乙醇的用途很广,可用乙醇制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。医疗上也常用体积分数为70%-75%的乙醇作消毒剂等,在国防工业、医疗卫生、有机合成、食品工业、工农业生产中都有广泛的用途。
DNA:脱氧核糖核酸(英语:Deoxyribonucleic acid,缩写为DNA)又称去氧核糖核酸,是一种分子,双链结构,由脱氧核糖核苷酸(成分为:脱氧核糖及四种含氮碱基)组成。可组成遗传指令,引导生物发育与生命机能运作。
主要功能是长期性的资讯储存,可比喻为"蓝图"或"食谱"。其中包含的指令,是建构细胞内其他的化合物,如蛋白质与RNA所需。
带有遗传讯息的DNA片段称为基因,其他的DNA序列,有些直接以自身构造发挥作用,有些则参与调控遗传讯息的表现。
组成简单生命最少要265到350个基因 。