苯酚与浓硫酸的反应方程式

有机化学反应在发生一个主反应的同时还会有多个副反应发生。苯酚与浓硫酸反应，最容易发生的反应是苯酚被浓硫酸磺化生成对羟基苯磺酸。因为苯酚的还原性较强，而浓硫酸的氧化性较强，所以它们会发生苯酚被浓硫酸氧化成对苯醌的副反应；此外还会发生对羟基苯磺酸的进一步磺化生成4-羟基-1,3-苯二磺酸。为防止苯酚磺化过程中被浓硫酸氧化，应该控制反应温度不超过90℃，用浓度不高于85%的浓硫酸也可用三氧化硫等其他磺化剂代替浓硫酸。

苯酚硫酸法测定多糖需要注意：①、试管要洗干净，苯酚硫酸法很灵敏，试管没有刷干净会有很大影响。②、操作手法一致，尤其是硫酸加入的方式和速度，要尽量一致。建议用移液管移取，直接松开按住上面的手指，让其自行流下。最后加入硫酸后，立即摇匀和隔段时间摇匀，室温和冰浴，这些都不是造成平行样不平行的原因，只要处理样品方法是一样的，切勿一个样一种方法。③加硫酸必须要快，建议用5mL的移液枪，另外样品的稀释浓度要合理。⑤药品要求：A、

浓硫酸：分析纯,95.5%

B、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。C、

6%苯酚：临用前以80%苯酚配制.（每次测定均需现配）D、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。E、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。F、

5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。G、

6mol/L

氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。H、6mol/L

盐酸。⑥酚要4℃冰箱保存，拿出来到室温后用，加浓硫酸后一定要摇匀，水浴温度和时间尽量一致，冷水冲凉的时间也尽量一致，试样温度不一样对吸光度也有影响，还有可以的话样品和标曲同时做，误差就小了。

多糖类化合物是许多中草药的有效成分之一，但多糖多无法直接测定，苯酚�硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下，水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚形成有色化合物，再用分光光度计进行检测。苯酚�硫酸法是测定多糖含量的常用方法之一，具有简便、快速、准确、灵敏的特点，在实验中发现，该法中苯酚和浓硫酸的比例十分关键，须控制为1�5，同时应保证溶液中硫酸的浓度，故文中多糖溶液移取体积为1.00 mL。另外，硫酸的加入方法不同对显色结果也有影响，故在操作过程中尽量由同一试验人员进行操作。

硫酸苯酚法测定云芝多糖含量的效果

摘要 云芝多糖成分复杂,测定比较困难。试验表明,硫酸苯酚法是测定云芝多糖含量的一种理想方法。其具有快速、稳定、灵敏度高和重现性好等优点。

关键词 云芝多糖 含量测定 硫酸苯酚法

云芝属担子菌亚门多孔菌科云芝菌属的真菌。从云芝菌子实体中提取的云芝多糖具有抗肿瘤、抗乙肝病毒、提高人体免疫功能等作用,同时对人体无毒副作用,长期食用无不良反应。因此,除可用作治疗乙肝和癌症病人在放疗、化疗过程中理想的辅助药物外,还可作为延缓老年性疾病发生的保健食品。目前,人们多从云芝菌子实体中提取云芝多糖,加工成各类制剂。衡量此类药品质量的标准主要是看其云芝多糖含量的多寡。鉴于云芝多糖成分较为复杂,目前国内尚无理想的测定其含量的方法,特此用硫酸苯酚法对云芝多糖含量进行了测定试验。1 试验材料1.1 仪器UV-756分光光度计(上海第三分析仪器厂产品)。1.2 试剂云芝多糖样品由上海莱福多糖制品有限公司提供,其它化学试剂均为国产分析纯。云芝多糖纯品的制备详见文献2。2 测定方法2.1 葡萄糖标准溶液的配制精确称取105℃干燥恒重的葡萄糖200mg,置于100ml容量瓶中,定容,摇匀。取1ml溶液于50ml容量瓶中定容,摇匀(含葡萄糖40mg/L),备用。分别吸取葡萄糖标准溶液0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8ml,用蒸馏水补充至2.0ml,加入6%的苯酚溶液1ml,静止10分钟,摇匀,室温下放置20分钟,于490nm处测定吸光度(以2.0ml蒸馏水作为空白对照),求得回归方程为:A=-0.06161+3.4190C1 (r=0.9990)其中,A表示吸光度,C1为葡萄糖浓度。2.2 换算因子的测定精确称取云芝多糖纯品150mg,配成适当浓度,依照标准曲线方法测定吸光度。根据回归方程计算换算因子f=W/(C2×D),其中f为换算因子,W为样品重量,C2为供试液相当于葡萄糖浓度(g/L),D为稀释倍数,测得f=1.38。2.3 待测云芝多糖溶液制备精确称取云芝多糖样品0.3000g,加80℃热溶解,定容100ml(可适当再稀释),摇匀,备用。2.4 云芝多糖含量测定吸待测样溶液2.0ml,加入6%苯酚1ml,静置10分钟,摇匀,室温下放置20分钟,在490nm处测吸光度。按下式计算多糖含量。云芝多糖含量(%)=C2×D×f/W×100%2.5 云芝多糖吸收曲线确定用葡萄糖标准溶液和云芝多糖纯品按测定方法分别显色,全波长扫描。扫描图谱见附图。附图 葡萄糖和云芝多糖的扫描图谱 由附图看出,云芝多糖经硫酸苯酚法显色后,几个秋萝卜品种(系)的农艺性状比较李先芳(郑州牧业工程高等专科学校,郑州450008)刘艳波(郑州市蔬菜研究所) 1996年我们在郑州市蔬菜研究所进行了新育秋萝卜品种(系)比较试验,旨在为河南省萝卜区域试验和示范推广提供优良品种。1 材料与方法供试秋萝卜品种(系)6个,详见表1试验采用随机区组排列,3次重复。株行距26cm×33cm,小区面积4.32m2,每小区27株,周围设保护行。田间管理方法同大田生产。1996年8月14日播种,播后观察记载各品种(系)生育期、植物学性状、病害等,收获时分区计产,折算亩产。2 结果与分析2.1 各品种(系)的生育时期6个品种(系)均8月18日出苗,9月16日定苗,11月10日收获,生育期86天。其中,90-12、90-13、丰光一代、大青皮破肚和定桩比德日2号、国光一号早1天(表1)。2.2 各品种(系)植株性状从表2看出,除90-13为板叶外,其余均为花叶,但大青皮、德日2号、国光一号杂板叶较多,一般于苗期分苗时将其拔除。丰光一代株形较大,其次为德日2号90-13和90-12株形较1999-03-20收稿。其最大吸收峰为490nm,与葡萄糖基本相同。2.6 显色时间以云芝多糖纯品为样品,在20℃下显色不同时间,分别测定吸光度,结果见表1。表1 云芝多糖显色不同时间吸光度显色时间(min)吸光度10.51550.515100.515150.516200.516250.516300.517350.517400.517显色时间(min)吸光度450.518500.519550.519600.519650.521700.522750.524800.524850.525显色时间(min)吸光度900.526950.5261000.5271050.5271100.5271150.5281200.5291250.5301300.530 从表1可以看出,显色时间在30分钟内吸光度非常稳定。2.7 样品回收率测定精确称量云芝多糖样品0.2000g,加入一定量的云芝多糖纯品,按测定步骤显色,测吸光值,计算其含量,并计算出样品回收率为101.8%,说明该测定方法相当准确。3 方法精确度测定分别取称0.3000g云芝多糖样品5份,用本法分别测定其云芝多糖含量,结果见表2。经计算其RSD=1.12%,说明本法测定精确度较高。表2 云芝多糖含量测定方法精确度测定结果项目样品号12345云芝多糖含量(%)51.2947.4448.8049.7248.724 小结研究结果表明,用硫酸苯酚法测定云芝多糖含量,快速、稳定、灵敏度高、重现性好。而其它测定方法对云芝多糖含量的测定效果还有待进一步研究

靛酚硫酸氢盐为绿色。根据查询相关公开信息显示，对亚硝基苯酚在浓硫酸中可与苯酚缩合，形成绿色的靛酚硫酸氢盐。硫酸是一种无机化合物，是硫的最重要的含氧酸，纯净的硫酸为无色油状液体，通常使用的是它的各种不同浓度的水溶液，用塔式法和接触法制取。

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。

1、制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1。8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml。

摇匀静置30分钟以后于490nm测吸光度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2、取多糖样品1.0ml，加1.0ml蒸馏水，然后加入6%苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml，在涡旋仪上震荡，充分混匀，静置30分钟，于490nm测定吸光度，并将测得的吸光度带入标准曲线中，可获得多糖浓度。

注意

（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。

（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。

（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。

（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1—0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。

一）苯酚法测定可溶性糖

【实验原理】

植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

【实验仪器及试剂】

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。

2．试剂：

（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。

（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。

（3）浓硫酸（比重1.84）。

（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。

（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。

【实验步骤】

1．标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。

式中：C一标准方程求得糖量（ug）

α一吸取样品液体积（mL）

V－提取液量（mL）

n一稀释倍数

W一组织重量（g）

可溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100