蛋白质提取问题

在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。

一、标本的采集种类和要求

1、推荐采集的呼吸道标本种类

疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）

2、拭子的选择

标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）

3、临床标本储存要求

保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。

4、标本的分装处理

标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。

5、标本的运输

疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。

二、核酸检测

基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。

1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：

4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。

2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：

目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。

三、病毒分离鉴定

可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。

四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全

（一）实验室级别及个人防护

1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。

2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。

（二）健康监测

1、所有人员均应自测发热及其他症状。

2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。

3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。

五、附表和附件

附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单

附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单

附件3： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（中文）

附件4： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（英文）

附件5： RT-PCR方法检测甲型流感病毒

附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法

附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法

附表1

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡。

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

采集人员： 采集单位（盖章）：

附表2

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量*

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。

填表人员： 送样时间： 单位（盖章）：

附件3

real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程

中文翻译版（请同时参考英文原版）

请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。

美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)

本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。

一、概 述

（一）前提

本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。

（二）实验原理

实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan&reg探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。

（三）使用条件

一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。

（四）生物安全要求

样本处理应在相应的生物安全实验室完成。

（五）样本要求

1、呼吸道样本

支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。

2、排除标准

1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本

2）以上未列的其它不当样本

（六）核酸提取

RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp&reg病毒RNA提取试剂盒，RNeasy&reg小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。

（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。

二、实验材料

（一）试剂

1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；

2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；

3、正反向引物 (40μM)；

4、双重标记探针(10μM)；

5、阳性对照。

（二）供给

1、实验室标记笔；

2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；

3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；

4、0.2ml PCR 反应管盘；

5、光学反应盖板；

6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；

7、一次性无粉手套。

（三）仪器设备

1. 微量离心机；

2. 漩涡振荡器；

3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。

三、操作程序

（一）准备工作

1. 避免样品污染

由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：

1）实验准备与核酸提取使用独立区域；

2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；

3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；

4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；

5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。

2、仪器准备

工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzap”或者“RNase AWAY&reg”来减小核酸交叉污染的风险。

3、试剂准备

注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。

1）引物和探针

（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；

（2）涡旋振荡引物和探针；

（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。

2）Real time RT-PCR的试剂

（1）将Master Mix和酶置于冰架上；

（2）融化2×的Reaction Mix；

（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；

（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。

4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测

1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。

2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。

3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。

5、建立反应

反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。

1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；

2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

3）Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：

* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。

5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；

6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；

7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：

实验建立举例：

实验样本举例：

注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。

8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。

9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。

10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。

11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；

12）将提取的核酸样本置于冰架上；

13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操作。

14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；

15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；

16）对剩下的样本，重复步骤13-15；

17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。

18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。

19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。

6、RT-PCR扩增条件

反应体系为25ul，反应条件如下：

注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。

* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

7、解释说明/检验

1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。

2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：

（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；

（2）没有足够的人类细胞以备检测；

（3）方法建立和实施不当；

（4）试剂和仪器原因。

3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：

（1）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。

（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。

（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。

（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。

（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。

8、限制规定

1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。

2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。

3）如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来重复试验。

9、备注

引物和探针参见英文版P7。

附件4

real-time RT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感操作规程

（英文版）

附件5

基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

一、目的

对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。

二、引物 NIC引物 引物名称 碱基组成 目的片段大小 备注 FluA FluA-M-F30 TTCTAACCGAGGTCGAAACG 235bp 甲型流感病毒M基因通用检测引物 FluA-M-R264 ACAAAGCGTCTACGCTGCAG H1HA H1 F1147 AAGAGCACACATAATGCCAT 527bp H1N1亚型检测通用引物 H1 R1673 CCATTRGARCACATCCAG HuH1HA H1HA F768 ACTACTGGACTCTGCTGGAAC 327bp 人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物 H1HA R1094 CAATGAAACCGGCAATGGCTCC SWH1HA-1 SW-H1 F786 AATAACATTAGAAGCAACTGG 153bp 此次甲型H1N1亚型流感病毒引物 SW-H1 R920 AGGCTGGTGTTTATRGCACC RnaseP RnaseP F AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 约80bp 与real-time PCR中RnaseP引物一致 RnaseP R GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 三、材料及仪器

1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）

2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）

3、70%乙醇

4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）

5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）

6、检测引物

7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C

8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C

9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头

10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器

11、可调转速14K离心机：

12、旋涡混合器：

13、生物安全柜：二级生物安全柜

14、PCR仪：

15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685

16、核酸染料：

17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718．电泳槽、电泳仪

四、实验步骤

（一）RNA提取

1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。

2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。

3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。

4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。

5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。

6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。

7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。

8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。

9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。

10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。

注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。

（二）反应体系配制

1、实验设计：

检测标本RNA

质控参数：

阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）

阳性对照：已知病毒RNA

2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）

1）按下表加入试剂：

PCR反应体系 组 分 体 积（μL） RNase Free Water

5×RT-PCR Buffer 11.9×n

5×n 10mM dNTP Mixture 1×n Enzyme Mix 1×n RNase Inhibitor 0.1×n 上游引物 0.5×n 下游引物 0.5×n Total 20×n 对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。

3）加RNA模板（在核酸提取区）

将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。

3、RT-PCR反应

将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR

扩增，反应程序如下： 温度 (C) 时间 循环数 60℃ 1min 1 42℃ 10min 50℃ 30min 95℃ 15min 94℃ 30s 35 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 7min 1 4℃ 保存 4、RT-PCR产物检测

1）2.0%琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。

2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。

3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。

4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。

5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。

5、结果判断

在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下： PCR引物 待检样品1 待检样品2 待检样品3 待检样品4 待检样品5 待检样品6 FluA _ + + + + +/- H1HA _ _ + + + +/- HuH1HA _ _ + _ _ +/- SWH1HA-1 _ _ _ + _ +/- RnaseP + + + + + _ 结果判断 非甲型流感病毒 甲型流感病毒

非H1N1亚型 人季节性H1N1亚型流感病毒 猪H1N1亚型流感病毒

送国家流感中心复核 送国家流感中心检测 标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题

在许多情况下，你需要将你感兴趣的蛋白标记出来：比如你想观察某一个蛋白在细胞中的定位，或者对它进行结晶纯化。虽然市面上有很多抗体，但有时有些抗体很难特异性的靶向你想要的蛋白。为了解决这个困难，科学家们就研究除了一个分子工具：纯化标签。

纯化标签是一个已知蛋白，或者一个肽段，它可以融合进你感兴趣的蛋白。因为这些标签是很好识别的，所以有很多抗体可以选择，也非常容易进行检测。添加标签的方法主要是进行重组DNA，即将携带有你感兴趣的蛋白的编码DNA与标签整合在一起，将质粒转入细胞。当质粒被表达的时候，融合标签就会连接到你的蛋白上。

融合标签的选择非常重要，另外linker序列的选择也很重要，linker序列将你的蛋白连接到标签上，确保蛋白能够正确折叠，并具有正常的功能。

为什么要使用融合标签？

优点：

（1）分离蛋白，即使没有针对这个蛋白的特异的抗体

（2）在纯化之后，有必要的话需要切除融合标签

（3）同一个蛋白上可以接多个标签以用于多种用途

（4）避免在免疫沉淀过程中抗体干扰

（5）荧光标签可以用来在活细胞中观察蛋白

缺点：

（1）有些标签会影响蛋白质的功能

（2）需要进行标签位置的优化

这篇文章仅仅对各种标签进行介绍，但并不能说哪一种标签必须放置哪个位置上，完全取决于你的实验需要。

如果你不确定你的标签放在蛋白的哪个位置更好，那就需要多试几种方案，改变或增加一个蛋白酶位点，修饰linker序列，或者添加多个标签以用于不同用途。

目前有三种主要的融合标签类型：

表位标签：一般是短肽段序列，可用于免疫技术应用，比如WB，Co-IP。

亲和标签：一般比较长，可以用于蛋白纯化，或增加蛋白的溶解性。

荧光标签：可用于活细胞/死细胞中，一般是用于成像实验，比如细胞中定位和共表达实验。

具体到把融合标签放在蛋白的哪一端，完全取决于你要研究的蛋白：该蛋白如何折叠？哪一端是功能必须的？比如，如果C端是被折叠到蛋白的内部的，你就不会检测到融合标签的信号；或者你的蛋白在翻译后某一端会被切割，那么你的tag就会被切掉。

如果你不知道你的蛋白是如何折叠的，那么第一次做的时候，最好C端和N端都试试。有报道称与N末端标记的融合蛋白相比，C末端融合蛋白更能定位于预期的细胞区域。但是也并不完全如此。

不是所有的标签都是一样的：每一个标签都有自己的用途和限制。比如你需要让你的蛋白更加可溶，并且需要利用标签进行纯化。就可以使用串联亲和纯化（tandem affinity purification, TAP）来完成。TAP最初是指将特定的一系列的结构域融合到蛋白质上：钙调蛋白结合肽（CBP）和金黄色葡萄球菌的蛋白质A（ProtA），通过烟草刻蚀病毒（TEV）切割位点分开。然而，这个技术现在可以用来融合2-3个融合标签到蛋白上，但是通常仍然要包含一个TAP原始成分。这些标签可以融合到蛋白的一端，也可以融合到两端里。如果需要在使用后将标签切除，通常建议将标签串联。

His标签在TAP中被广泛使用，因为它非常小，对于纯化实验效率很高。它们通常与麦芽糖结合蛋白（MBP）一起使用，可增加溶解性。另一种经常使用的结合是GFP和His。

虽然TAP标签有很多优点，但是这个标签非常大，有可能破坏蛋白功能。另外，如果你使用含有CBP的标签，还可能与钙信号相互干扰。所以，尽可能少的在你的蛋白上添加标签。

有的小标签对蛋白的功能影响不大，但是某些大标签，可能会产生意想不到的影响。在这种情况下，通常在你检测完标签后，需要切掉你的标签。这就需要利用特异位点蛋白酶或者内含肽类来完成。

位点特异蛋白酶理论上不会影响你的蛋白功能。但是通常要在切割之后移除蛋白酶。一个解决方法是将蛋白酶和一个标签融合，通过亲和层析移除。几种蛋白酶识别位点的选择取决于你的需要。一个需要注意的点是，融合标签是在N端还是C端？从N端切割标签，留下的残余残基少，从C端切割标签，会留下4-6个多于的残基在你的蛋白上。下面列出了几种常用的蛋白酶位点（英文版，有需要的同学请自行查看）：

亲和标签之所以叫这个名字，是由于它们经常被用于亲和纯化。亲和纯化是从细胞裂解液里纯化蛋白的一项技术。见下图：

GST是一个由211个氨基酸组成的蛋白，分子大小约26KD。天然的GST可保护细胞对抗有害成分和氧化应激。GST的主要特点是其对三肽、谷胱甘肽亲和，可用来进行亲和层析。当含有GST的溶液通过以谷胱甘肽固定化的柱子时，GST就结合到谷胱甘肽上，从溶液中被分离出来。结合后，可用10mM谷胱甘肽洗脱下来。

需要注意的事项：

（1）污染：热激蛋白有时也会被GST洗脱下来。你可以通过SDS-PAGE胶看到这种污染。为了除去热激蛋白的污染，可以在纯化前用5mM 的氯化钙和5mM的ATP处理细胞裂解液。

（2）失去蛋白功能：由于GST是一个大标签，通常在溶液中作为二聚体存在。有可能会降低你的蛋白活性和功能。可以利用蛋白酶（比如thrombin, factor Xa或者PreScission）切割。

PolyHis标签由于其小体积、结合稳定，被广泛应用于蛋白纯化。虽然His标签可以有2-10个组氨酸残基，但最常用的是6×His Tag，或者hexatag。组氨酸与固定的过渡金属离子形成配位键，该性质可用于蛋白质纯化。 钴和锌柱可用于固定金属亲和色谱（IMAC），但通常使用镍柱。 因为His标签是短肽序列，所以标签的最佳位置根据蛋白质特异性来定，它们很少影响融合蛋白的性质。

需要注意的点：

（1）内源性的His: His残基广泛存在于哺乳动物和昆虫里，所以会有很高的背景信号。 背景结合可以通过利用5-10mM咪唑清洗来避免，但这会过早的洗脱掉你的蛋白。另外，在用His抗体检测时也应该注意背景结合。

（2）不建议将带有金属中心的蛋白质融合到His-tag上，因为金属可能会被亲和树脂吸收。

（3）应避免使用还原剂，例如二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇，因为它们会降低亲和性树脂。

Biotin,也叫做维生素H，是一个分子量244Da的小分子。通常被接在二抗上作为可视化技术，用于ELISA和WB。Biotin可与strptavidin和avidin分子形成非常牢固的结合，这个特点可以用来进行亲和纯化。由于Biotin是小分子，所以也不会影响蛋白的功能。另一个有价值的标签是Strep标签。 由于它的长度为8个氨基酸（WRHPQFGG），也不太会影响蛋白质功能，并且与生物素可逆地结合在同一pocket中。 这意味着可以使用strptavidin树脂有效纯化与Strep-tag融合的蛋白质，并在温和的缓冲液条件下使用生物素洗脱。

需要注意的点：

（1）四聚体与单体亲和性树脂：可以使用avidin包被的柱纯化生物素标记的蛋白，该柱可以四聚体或单体形式使用。 四聚体abidin色谱柱需要强力的变性剂，例如尿素或盐酸胍，用于洗脱过程，而单体树脂可以使用10mM生物素缓冲液进行较温和的洗脱。

（2）哺乳动物系统至少包含四种生物素化的蛋白质，会被与感兴趣的蛋白质共洗脱。 但是，很少会在大肠杆菌系统中遇到非特异性结合。

表位是抗原的一部分，是被抗体识别的那一部分。所以表位标签通常被用来进行以抗体为基础的分析实验。表位标签一般来说比亲和标签短，因此很少会影响蛋白质的功能。虽然它们也可以用来进行亲和纯化，但是基于免疫抗体的柱子造价昂贵，并且效率也不如亲和标签。然而，表位标签在检测方面有着非常大的优势。它被广泛的用于细胞培养和免疫共沉淀。

人类c-myc在增殖细胞中有较低的表达水平，并在人类肿瘤发生中起重要作用。c-myc标签是从c-myc基因的C-端衍生而来的，可以有效的被抗体识别。因此被广泛的应用于蛋白检测，例如WB，免疫共沉淀，流式。

需要注意的点：

（1）融合进分泌信号中：虽然c-myc标签可以被放在蛋白的N端或C端，但是不推荐把它融合进分泌信号通路里，它会影响分泌通路的定位。

（2）亲和纯化：虽然它也可用于蛋白纯化，但是很少用它。是因为洗脱要求在非常低的pH值条件下进行，会影响蛋白质功能。

人类流感病毒血凝素（HA）标签是从HA糖蛋白衍生而来的，HA糖蛋白存在于流感病毒表面，负责病毒的感染力。由于HA是一个小肽段标签，基本不会影响蛋白功能，可用于蛋白检测，比如ELISA，WB，免疫共沉淀。抗HA抗体也可以用于蛋白纯化。

要注意的点：

亲和纯化：不推荐使用HA标签标记凋亡细胞中的蛋白。HA标签会被caspase 3和caspase 7切割，会导致免疫反应性的降低。

DDDK或者FLAG，是唯一具有专利的标签（sigma），比其他的表位标签更亲水。必要的情况下，DDDK标签包含的肠激酶切割序列可以从融合的蛋白上切割掉标签。

需要注意的点：

亲和纯化：虽然抗DDDK抗体也可以有效的进行蛋白纯化，但是通常比其他的柱子要更加昂贵。

V5标签是由paramyxovirus simian病毒中P蛋白和V蛋白衍生而来的，V5标签有两种大小，9-14氨基酸。但是较长的是常用的。有时会将V5标签与His-tag结合使用。

需要注意的：

交叉反应：如果你使用的是哺乳动物表达系统，可能会出现交叉反应。

自从1992年，GFP基因被克隆出来，目前有许多的荧光标签可供使用。荧光标签的一个最大的优势就是non-toxic，因此可以被用于live cells。尽管荧光标签很大，对绝大部分的蛋白质功能影响很小。

虽然GFP的大小是26.9KD，是经常被使用的一个荧光标签，但是还有很多其它标签可供使用。

如果你准备使用多种荧光标签，一个非常重要的点是要选择不同的激发光和发射光的峰，如果发射峰重叠，就非常难以区分两种荧光。

通常，你希望使用可用光谱中最亮的荧光标签进行蛋白标记，从而能够获得清晰的信号并克服任何潜在的背景荧光。 亮度值（brightness value）是蛋白质的消光系数和量子产率的乘积。 但是，所得数字可能难以解释。 因此，一种常见的措施是将荧光标签的亮度与一个标准的标签做比较，例如和EGFP进行比较。

Maturation定义了荧光标记正确折叠、形成发色团和开始发射荧光的时间。在活细胞的time-sensitive事件中，一个短的maturation的时间至关重要。sfGFP为例，可以在10分钟内折叠，而mOrange通常要4个小时。

Bleaching是光稳定性的度量。即发色团在被激发后多长时间内失去发射光的能力。如果你打算进行一个长时间的延时实验，那么要考虑一个具有很高的光稳定性的标签。T-sapphire的bleaching半衰期是25秒，而EGFP则稳定的多，一般为174秒。

与大多数蛋白质一样，荧光标签受ph值、温度和氧气水平的影响。根据你所使用的条件，可能需要挑选合适的标签。

pH值可以影响激发和发射峰，并且大多数荧光标签对酸敏感。有些甚至可以在pH值变化时改变荧光强度（例如pHTomato）。pKa值是pH敏感性的一个很好的指标。

此外，温度和氧气水平都会影响Maturation时间。低氧条件往往会延迟maturation时间。然而，新的荧光标签，UnaG，即使在氧气水平很低的条件下也能发出荧光。

由于大多数荧光标签来自水母或者珊瑚蛋白，而不是哺乳动物的细胞或组织，可能使用的氨基酸密码子存在物种间差异，这可能导致表达水平低，信号弱。

幸运的是，许多较新版本的荧光标签都已经进行了密码子的优化，以便于在哺乳动物里得到很高的表达。因此在使用前，需要确认一下你的序列是否可以在目标系统里得到表达。

另一个非常重要的点是，要确定你的标签是单体还是二聚体（单体通常用“m”表示，如mCherry）。这会影响你的实验。很多早期的荧光标签容易形成寡聚体，可能会影响你的融合蛋白的功能。例如EGFP，是一种单体标签，但是在浓度很高的情况下，可以形成二聚体，它可以破坏亚细胞的细胞器或者破坏FRET这样的实验。

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。

然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry、BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

在Western Blotting实验过程中使用内参的方法通常有一下三种。第一种是超级简便的标记内参使用法，只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可；第二种是普通内参，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测，然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。第三种，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开，然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！

actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量>20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了），但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。三种同时发生变化的情况很少，需要具体分析。一旦出现上述三种内参同时发生变化，如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。

不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C－端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)，ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。

actin几种异构体存在组织分布特异性，不同型actin之间具有较高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌细胞中的一种骨架蛋白，选择作β-actin内参时首先得保证是组织广泛表达的（尤其是做蛋白的组织表达谱时）。那么制备β-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列。公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原，可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测非肌细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除非肌细胞外,还可以检测cardiac，skeletal，smooth muscle细胞的actin。

在这项工作中，我们更详细研究的定位

个别核筹措的诱导

半乳糖苷酶，公益少年团的推动者NPTII在压制和

引起国家和估计实际核

转移。与此同时，对这一核定位

序列进行了研究后抑制蛋白

乙酰（ HDACs ）与曲古菌素A （ TSA ）的。

我们发现，两个核转移到

揭露TATA盒诱导。核

滑动和定位被证明是导

组hyperacetylation 。

实验

酵母和细菌菌株，转化和

生长条件。我们利用大肠杆菌菌株

JM109 （盒）和酿酒cereivisae

应变2805 （毡+ ， pep4 ： ： His3 ， prbL - δ ，可以- 1 ， Gal2 ， his3 ，市建局3-52 ） ，这是善意提供的对照普

（相箕Rhii ，成员，韩国） 。转化

大肠杆菌大肠杆菌JM109细胞哈巴狗Fneo1 ？ ，哈巴狗Fneo

？ （ 1 ？ -2 ） ，和YepMMS做钙氯

骑[ 10 ] 。质粒的构建被称为previ -

ously [ 11 ， 12 ] 。

酵母细胞转化与同一纤溶酶

中频的氯化锂的方法[ 13 ] 。转化细胞

选定的SD最小合成培养基（ 0.67 ％

氨基酸免费酵母氮基（培养基） ， 2 ％谷氨酸

葡萄糖， 0.5 ％硫酸铵， 1.5 ％琼脂（培养基） ） 。

选定的克隆接种在100-200毫升的

液体培养基YPD （ 1 ％ ，酵母膏，蛋白胨2 ％ ，

2 ％葡萄糖）或YPGal （一个完整的中型2 ％

半乳糖）和成长为16-18 h ，直至OD600 = 0.8 -

1.2 。此外，转化生长的

固体YPD培养基（ 1.5 ％琼脂）补充

300微克/毫升geneticin （ G418 ） 。

代spheroplasts和染色质

水解微球菌核酸。酵母细胞

9

（ 1 × 10 ） ，收集离心，洗涤

与无菌水和缓冲液（ 10毫米的Tris -盐酸，

pH值7.4 ， 1海里山梨醇， 0.5毫米β -巯基乙醇） ，

和悬浮在1毫升相同的缓冲区。要获得

spheroplasts ，一个细胞悬液进行了补充

20毫克/毫升Lyticase （酵母溶解酶， 800

单位/毫克，六西格玛）和孵育30 ° E与轻微

搅拌15-20分钟。进一步采取的步骤一间酒吧，

687议定书[ 15 ] 。在Spheroplasts被停职

1毫升的一个缓冲的染色质水解微

球菌核酸酶（ 1海里山梨醇，氯化钠50毫米， 10毫米

三盐酸， pH值为7.4 ， 5毫米氯化镁， 1毫米的氯化钙， 1毫米

β -巯基乙醇， 0.5毫米精， 0.1 ％

NP一40 ） 。暂停的原生质（ 200 UL ）的是

转入微量管，补充

与150-350单位/毫升微球菌核酸酶（铁

mentas ） ，并培养在37 ° E的5分钟。反应

被终止，增加0.5米的最后四乙酸

浓度25毫米和10 ％的SDS最后协商

centration的0.5 ％ 。

分子生物学实验基础知识2006-11-17 16:31分子生物学实验基础知识

分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（transformation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。

外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。

一、基因工程的常用工具

（一）载体

载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。

质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。

常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。

（二）工具酶

工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。

限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA内切酶之分，Ⅱ型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口分开端和粘端，产生3′－OH和5′－P末端。内切酶品种多，使用时应注意温度、缓冲液用量（一般1μg DNA/2-5单位酶）等反应条件。

酶 识别序列 切口

Alu Ⅰ …AGCT… …AG CT… 四核苷酸

…TCGA… …TC GA… 平端切口

Eco R1 …GAATTC… …G AATTC… 六核苷酸

…CTTAAG… …CTTAA G… 粘端切口

连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端，也连接粘端。反应需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。

聚合酶有DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶）；逆转录酶（以RNA为模板合成DNA，除RNA病毒中发现外，发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性）。

大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，无3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻译（Nick translation）法标记核酸，也可用于DNA序列测定，修补DNA链等。

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环。

末端转移酶在Mg2+存在下，选择3′－OH端单链DNA为引物加成核苷酸，在Co2+存在下，选择3′－OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾（连接器）。

碱性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基团自身空间障碍，影响DNA分子之间的连接，一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团，在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接，再通过复制修复另一条链，使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率（图18-1）。

图18-1 经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接

二、目 的 基 因

常把需研究的基因称为目的基因，需分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法得到。简短的目的基因可在了解一级结构或通过了解多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列基础上人工合成。但多数的目的基因由mRNA合成cDNA（complementary DNA，反转录DNA）得到。CDNA通过各种方式与载体连接，克隆可得到全长cDNA或片段，用于探针制备、序列分析、基因表达等研究。因此以cDNA为研究材料反映了mRNA的转录及对以后翻译的影响情况，即反映某一基因（DNA）外显子的情况。（图18-2）

图18-2 目的基因cDNA的合成

三、基因库的建立

建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。基因库是利用工具酶，通过基因重组技术和转化、筛选而建立，也是基因克隆的过程。实际上是利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快，繁殖力强的特点，而作为一种核酸扩增筛选的载体，把人类等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重组于其中，经筛选，克隆得到目的基因与载体重组的重组基因，成为便于保存，取用方便的基因库。基因库交流是研究室之间交流目的基因的常用方式。

（一）基因重组

基因重组方案很多，简单的可用同一种限制性内切酶分别在载体和目的基因切出相对应的切口，便于连接。也可用末端连接酶合成连接器（图18-3）。近年，Okayama方案为实验室普遍采用，该方法可得到全长的cDNA。

（二）转化

转化目的是把有复制能力，但在细胞外无复制活性的目的基因-载体重组体装入细胞（大肠埃希菌），使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。实验步骤介绍如下：

图18-3 基因重组方案之一

⒈大肠埃希菌的处理（增加细胞膜通透性，便于基因进入细胞）大肠埃希菌（E.Coli cells）接种于Lb agar培养基，37℃培养一晚。挑选3~5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37℃，振摇培养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为细菌对数生长期），野生型（rec＋，5x107cells/ml）为0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x107cells/ml）为0.5-0.6。离心弃去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl2悬浮菌体。冰浴20分钟，低温离心。弃上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl2悬浮。4℃可保存48小时，用于转化，称competent cells。

⒉质粒（如经基因重组建立的重组质粒，基因库等）的转化 将competent cells（以美国BRL公司DH10B菌株为例）置冰水浴。同时将Falcon2059（传热系数稳定）塑料试管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059试管中，加10倍稀释的巯基乙醇1μl，冰浴轻摇2分钟，放置10分钟。取0.1-50ng质粒加入试管，轻轻摇匀，冰浴30分钟。此间备好42℃水浴。并将SOC培养基置42℃备用。将试管置于42℃，轻摇45秒钟，马上置冰浴2分钟。使competent cells热胀冷缩，把质粒导入菌体。加42℃SOC培养基0.9ml于试管，37℃培养1小时。1000rpm离心10分钟，弃上清液，用200μlSOC培养基悬浮菌体。接种于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培养皿，37℃培养一晚。已转化的菌体可形成菌落（因质粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其产物的基础上对菌落进行鉴定。并在LB培养液中扩大培养。基因库的建立、转化、筛选、扩增、纯化的过程就是基因克隆的过程。

LB培养基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g NaCl，高压灭菌，pH7.5。

SOB培养基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5g NaCl，高压灭菌。另外准备2mol/L镁溶液（1mol/L氯化镁与1mol/L硫酸镁等量混匀，过滤灭菌），临用前加1ml于100ml培养基。

SOC培养基（100ml）：临用前加入1ml过滤灭菌的2mol/L葡萄糖。

四、核酸的分离与纯化

核酸存在于多种细胞，如病毒、细菌、寄生虫、动植物细胞；多种标本中，如血液、组织、唾液、尿液等其它来源的标本。因此分离方法复杂而多样。又因各种DNA、RNA的丰度差异，各种分析方法对核酸的纯度与量的要求有差异，因此在实验前应对采用的方法有所了解和选择。总的说来核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。溶解细胞的方法因标本不同而不同，有用SDS加NaOH，有用蛋白酶，有的用超声波破碎等方法，苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的。实验上生物标本中含量最多的就是蛋白质。为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心回收核酸，然后用70％-80％乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。为了得到纯的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用RNA酶除去RNA，得到纯的DNA，用DNA酶除去DNA而获得RNA。目前开发了许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA。其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有的利用需分离核酸的特点与其特异性结合达到分离、回收的目的。

（一）质粒的分离与纯化

含质粒的E. Coli cells经LB培养液250ml扩大培养，倒入50ml离心管，4℃，3000rpm，离心15分钟。弃去上清液。（弃去液丢弃前应作消毒处理，以免污染环境）。加lysis buffer(50mmol/L Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris-HCl，pH8.0)1-2ml使之悬浮。放置室温5分钟，加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液（1mol/l NaOH 8ml，20％SDs 2ml，蒸馏水30ml）上下摇匀，置冰水浴5分钟。禁用混匀器，以免DNA分子断裂），加2.5mol/L醋酸钾缓冲液（pH4.8）2.6-5.2ml，上下摇匀，冰浴5分钟。4℃，3000rpm，离心15分钟。沉淀蛋白质。取上清液，加无水乙醇12-24ml（上清液的二倍）放室温15分钟后，10000rpm离心，弃上清液。加约为沉淀物体积的0.4倍TE（10mmol/l Tris-Hcl pH8.0，10mmol/l EDTA）溶解沉淀后，加0.2倍的7.5mol/L醋酸铵。可用混匀器混匀，置冰浴10分钟。4℃，10000rpm离心5min，弃上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5，10mmol/l EDTA缓冲液，1/10体积的5mg/ml RNase，37℃，30分钟保温。加等量的phenol（酚）/CIAA(480ml氯仿，20ml异戊醇)，混匀。4℃，10000rpm，离心5分钟。取上层液加酚/CIAA重复一次。取上层液加1/10体积5mol/l NaCl和2倍无水乙醇，―20℃过夜或―70℃2小时以上。4℃，10000rpm，离心10分钟，弃上清液。加80％乙醇不摇动，直接10000rpm离心，弃上清液，真空干燥。加适量（约200μl）TE溶解。测定含量后备用。

（二）重组质粒中目的基因的分离与纯化

先取少量纯化的重组质粒，用限制性内切酶切出目的基因，经电泳分离，确认。以200μl含2mg DNA（重组质粒）为例：取10μl含100μg DNA，加90μl TE。按1μg DNA加2-5U限制性内切酶，1/10体积缓冲液，1-2小时保温。缓冲液种类和酶反应温度因内切酶种类而异。1/10体积3mol/l NaAc，2倍无水乙醇，－70℃，2小时（－20℃过夜），10000rpm，10分钟离心，弃上清液（乙醇沉淀）。适量TE溶解沉淀（切断的DNA质粒与目的基因混合物），电泳分离（用相应分子量DNA标准同时电泳），在紫外光下观察结果，与标准DNA分子量比较，确认目的基因和内切酶的切割效果。

⒈电泳条件：

凝胶制备： 1％琼脂糖凝胶 agarose(mg) X50TAE(ml) EB(溴化乙锭μl)

(agarose) 1000 2.0 4.0

总体积（ml）

100

胶浓度（％）： 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

DNA长度（kb）： 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1

电泳缓冲液： X50TAE(ml) EB(μl) 总体积(ml)

20 30 1000

X50TAE：Trisma base 54g；乙酸57.1ml；0.5m EDTA pH8.0 20ml；蒸馏水至1000ml。

EB：10mg/ml ethidium bromide。(EB有致癌性，操作应小心)。

经电泳确认后，取适量DNA（重组质粒）同上条件切开，用1.5％低熔点（＜65℃熔解）琼脂糖凝胶，电泳分离。在紫外光下，切出含目的基因区带（凝胶），放入离心管中，提取纯化。

⒉从低熔点凝胶提取，纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。

（三）标本DNA的分离与纯化

用5-10ml 1xNTE(NaCl 100mmol/L ,Tris-HCl 10mmol/l pH7.4，EDTa 1mmol/L pH8.0)调整细胞为2×107个（组织应切碎置液氮冰冻，高速搅切成粉末后，加入缓冲液）。加1/10-1/20体积（V）10mg/ml蛋白酶（Sigma Ⅷ型），1/20v 10％SDS，37℃2小时。加等量酚/3xNTE(3xNTE上封)混匀（至少7分钟）。4℃，3000rpm，10分钟。取上清液，加2ml TE(Tris-HCl 10mmol/L pH7.5，EDTa 1mmol/L pH8.0)，充分混匀。乙醇沉淀。2mlTE溶解沉淀。加1/30xNTE，蛋白酶K(10mg/ml)代替蛋白酶重复2-4步骤。测定含量。

（四）样品RNA的分离，纯化

含106个细胞液加等量纯化溶液[4mol/L胍基硫氰酸盐，25mmol/L柠檬酸pH7.0，0.5％肌氨酸（sarcosyl），0.1mol/l 2-巯基乙醇]。总体积为细胞沉淀4-5倍，混匀。加0.1体积2ml/L乙酸钠（pH4.1），1体积酚（重蒸水上封），0.2体积CIAA，混匀器剧烈混合10秒钟。冰水浴15分钟。10000xg4℃，20分钟。离心（不用刹车）。小心取出上清液。加等量丙酮（或2倍乙醇），－20℃，60分钟以上。10000xg，4℃，20分钟离心。弃上清液。用1.5ml离心管约加0.3ml纯化溶液，重复3)步骤，离心10分钟，弃上清液。加75％乙醇，10000xg，4℃，10分钟离心。弃上清液。真空干燥15分钟，备用。

五、探针制备

探针制备就是目的基因的标记，核酸标记方法常用的有缺口平移法、随机引物法、末端标记法等。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记，特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高，可达1.70MeV，用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期为14天，应随标随用，一般标记后，在一周内使用，它虽带来不便，但给使用后废弃物处理减轻了压力。使用32P标记物应注意防护，操作时应有1-1.5cm厚聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃隔离保护，避免直接照射。操作人员胸前应佩带个人计量器，定期检测。结束实验后，应用专用探测器（盖革-米勒检测器），检查工作区域、手、衣服等，以免污染发生。其它同位素标记物，同样应注意放射线防护。

非放射性标记有酶标和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，阅读文献时应加以注意。现有许多商品是生物素（biotin）、地高辛标记的，如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。血凝素（avidin）与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶（血凝素-酶），经杂交反应最终形成：探针-生物素-血凝素-酶复合物（ABC法）。酶催化底物显色，观察结果。与一般的酶反应底物不同，ABC法底物显色后为不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差、成本高，但便于运输保存，灵敏度与放射物标记相当。化学物标记有的也是利用相应酶标抗体形成特异复合物，与上述方法相当，有的则可自发光。化学标记法简单、成本低，但灵敏度相对较低。

分子生物学实验基础知识

免疫荧光显微镜。研究了采用用前面的Watabe等(王汝成等,1997,2000)。细胞是盐水清洗磷酸盐(PBS)和固定有3.7%甲醛为20分钟。细胞permeabilized含0.2% X-灯下鹤100 5分钟,然后洗了三次,PBS。 原发性抗体孵育进行outfor1hat室温。多余的抗体被淘汰

三次,PBS。其次是孵化和一个合适的fluorophore-labeled二次抗体for1hat室温区域免受光。 洗好的衣服晾出去多余的抗体后三次,PBS,安装了一个延长使用Antifade工具包(Invitrogen,巴斯、钙)。为thioflavin年代所描述的染色机吴昱。(2004)、固定细胞有0.05%的thioflavin孵化5分钟,洗了三次,80%的乙醇的抗体incubations之前。 荧光显微镜图像进行Axio成像(M1,Oberkochen,德国Zeiss)。 量化的DNA碎片的产生。用前面的Watabe等(2004),《科学通报》,测定DNA碎片使用细胞死亡检测ELISAPLUS工具包(罗氏分子生化药品,在德国的曼海姆)根据制造商的指示。这篇文章是非常有用的坏死和凋亡的鉴别检测基因组DNA internucleosomal退化,这是一个标志,通过定量测量histoneassociated凋亡DNA碎片。测量多巴胺。多巴胺(Watabe像先前测量和Nakaki,2007)。 总之,测量

多巴胺的金额和泡细胞细胞质分数,患者存在重复0.5米GBR12935防止从内释放细胞外部通过多巴胺转运蛋白(巴克)。小泡和细胞质分数为准备使用突触泡隔离工具包(西格玛奥德里奇)根据制造商的指示。小泡分数并在0.01米,trichloroacetic盐酸酸添加到细胞质分数(最终浓度、5%,w / v)。离心后(15000克在4°C 10分钟),立即被eluted浮在一个流量0.5毫升/每分钟750千瓦和潜在的使用一个EIKOMPAK SC-5ODS栏(Eicom公司、日本京都)作为高效液相色谱系统。移动阶段包括0.1米柠檬酸/ 0.1米,pH值为3.5,醋酸钠5毫克/毫升EDTA和190毫克/升1-octanesulfonic酸。 每个标本中的多巴胺水平进行量化比较的峰面积与多巴胺标准溶液。Immunoblot分析。 Immunoblotting进行(Watabe等用前面王汝成等,1998)。 总之,细胞在一个缓冲区中并mercaptoethanol含SDS和单元lysate当时煮好了。 在蛋白质变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和转移到一个偏difluoride膜

分子生物学实验的基础分子生物学实验的基础知识2006-11-17 16:31

分子生物学的发展，核酸和蛋白质的结构，功能和生命的本质，核酸，蛋白质分子水平上的发病率，诊断，治疗和预后机制的研究学科的生化基础。基因工程（基因技术，基因重组）是一种分子生物学研究的热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物的痕迹对象实现层次分析法是研究基因表达调控，分子水平的疾病的机理，基因诊断和基因治疗方法。转换（转换），转，转，转，通常用自然的方式重组存在，而且人工重组的方式。的重组基因的克隆的目的之一（基因的克隆），克隆理解为与模板完全的基因相同的分子结构的分子基因为模板扩增。需要分析的痕迹的研究，并将该混合靶基因易于纯化，可以是增量的，便于分析。

？外源基因，导致细胞生物性状的变化过程称为转化（转化），噬菌体外源基因导入细菌称为转（转）。载体（噬菌体或病毒）的遗传物质传递从一台主机到另一台主机的过程称为转导（转导）。从转移到另一个过程的基因组的基因中的一个或一组被称为可转位的转位，这些游动的基因，称为转座子。

？，基因工程的常用工具

？（A）载体

？向量（向量）的外源DNA（目标基因）导入宿主细胞的传代，扩增，表达工具。的载体质粒（质粒），噬菌体，噬菌体和粘性末端的单链质粒（粘土），病毒，和类似物。载体具有自我复制另外，为了方便遗传标记的筛选和鉴定外源DNA插入位点本身体积小等特点。

？质粒存在于多种细菌，是独立的染色体（核）组成的双链环状DNA几乎完全裸露，很少的蛋白质结合，比其他的遗传因素。质粒紧与松。严紧型由DNA聚合酶Ⅲ复制，一个细胞可以被复制到1-5质粒。弛张型DNA聚合酶Ⅰ副本，一个细胞可以复制30-50个质粒，氯霉素阻止蛋白质的合成，有效地利用原材料，拷贝质粒载体。将所述质粒转化常用的pBR322，pUC系列各种各样的。这些质粒含有多个基本基因，如复制起始区域（原点的复制ORI），便于复制扩增抗生素抗性标记（氨苄青霉素抗性四月四环素抗性TCR，等）或大肠杆菌的乳糖操纵子（大肠杆菌LacZ基因）等，以促进基因重组体的筛选基因启动子（乳糖操纵子的Lac，色氨酸操纵子的色氨酸，等）和转录终止序列，以方便插入的外源基因的转录，翻译，表达。的质粒的限制性核酸内切酶的切点，即基因的插入位点，也称为基因重组位点，基因的克隆位点。

？常见的噬菌体载体的单链噬菌体M13系统双链噬菌体系统。噬菌体和相应的宿主细胞配合使用。最重要的载体都有自己的特点，灵活应用的方便选择。

（B）工具酶

？工具酶的重组DNA技术是不可缺少的工具。限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶，逆转录酶和核酸内切酶。

？限制性内切酶Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA切割酶分，Ⅱ严格识别核酸序列和切割DNA双链区域的特定核苷酸的认可。它通常被称为是Ⅱ型限制核酸内切酶。四核苷酸和六核苷酸识别序列旋转对称图形。的切口分开始和粘性的端部产生的5'-P和3'-OH端。应用核酸内切酶的品种，要注意的温度，缓冲液的量（平均0.1微克DNA/2-5单位的酶）和其它反应条件。

内切酶识别序列的切口

铝Ⅰ... AGCT ...... AG CT ...四核苷酸

？... TCGA ...... TC GA ...平端的切口

生态R1 ... GAATTC ...... ?AATTC ...六核苷酸

？... CTTAAG ...... CTTAA G ...粘性末端的切口

？连接酶是噬菌体T4 DNA连接酶，T4噬菌体RNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶。 DNA连接酶可连接到的平面侧，并且还连接到的粘性末端。反应中存在的Mg2 +和ATP，pH7.5的-7.6。最佳温度为37℃，30°C或更少的活性显着降低，但考虑到稳定性，以被连接的DNA，和退火温度的粘性末端，用20-25℃，大致平坦的一端连接粘端连接用12℃左右。

？聚合酶DNA聚合酶（DNA为模板合成DNA的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）RNA聚合酶（DNA作为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶），逆转录酶（RNA为模板合成DNA，除了RNA病毒中发现发现，大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶的逆转录酶活性）。

？大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'，3'→5'外切核酸酶活性。 Klenow片段的DNA聚合酶I的酶枯草溶菌素生成的大片段的5'→3'聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性，没有3'→5'外切核酸酶活性。可用于在缺口翻译（尼克翻译）标记的核酸也可以使用用于DNA序列测定，DNA链的贴剂。

？核酸酶的DNA酶，核糖核酸酶，核酸酶S1和等，可水解的相应的DNA和RNA，核酸酶S1降解单链DNA和RNA，增加的可生物降解的双链核酸的量。它可以用于发夹环剖开的ds-cDNA的合成中产生。

末端转移酶选择的单链DNA的3'-OH端的Mg2 +的存在，核苷酸引物的添加，Co2 +离子存在，选择的3'-OH末端添加核苷酸的双链DNA？作为引物，以形成聚核苷酸最新。常用的一个互补的核酸末端标记和核酸连接聚尾巴（连接器）。

？碱性磷酸酶以除去5'-P防止使两个DNA片段的5'末端的P组空间障碍影响DNA分子之间的连接，典型的载体DNA用碱性磷酸酶处理以除去5'末端的P基的P的第一载体3'末端OH基，连接酶目的基因5'端的连接，然后通过复制另一个链固定，从而使两条链完全连接。这种方法大大提高了工作效率结扎（图18-1）。

？

图18-1碱性磷酸酶处理后的载体DNA靶基因的DNA连接

？其次，头

？经常需要研究的基因为目标基因，需要分析的基因为靶基因，被称为插入基因的克隆过程，有时两个，有时三个类似的意思。简单的原核细胞的靶基因可从细胞核中直接分离，但人类基因的分布在23对染色体中，更难以得到直接的方法。简短的目的基因的结构的理解中，或核苷酸序列编码的结构氨基酸的多肽链通过理解合成的基础上。但是，大多数的靶基因的mRNA合成的cDNA（互补的DNA，反转录的DNA）。 CDNA通过各种手段连接到载体，克隆的全长cDNA或其片段，可以得到用于制备探针，序列分析，基因表达等。反映基因的mRNA转录和后续的翻译为研究材料，即反映了外显子基因（DNA）的情况下。 （图18-2）。

？

图18-2靶基因的cDNA合成

？建立的基因库

？基因文库的建立的目的是为了便于保存所需的基因，扩增和纯化。基因库是使用通过基因重组技术建立的工具酶和转化，筛选，克隆过程。实际上，使用较低的生物体，如细菌，病毒，噬菌体和其它特征与一个快速增长，生殖能力，并作为中的核酸扩增的载体，过滤器，以及更高的生物，如人类的基因或它们的片段插入工具酶，重组其中，后筛选，克隆的基因重组靶基因的载流子复合，容易保存，存取方便的基因库。基因库的靶基因之间的沟通，交换实验室常用的方法。

？（A）重组

？许多简单的可以用限制性核酸内切酶，分别在载体和目的籍Yinqie中相应的切口，容易连接的重组方案。也可用于结束连接酶合成的连接器（图18-3）。在最近几年，冈山实验室常用的方案中，该方法可以得到全长的cDNA。

（B）转换

？转换目的是复制的能力，但在细胞外无复制活性的靶基因 - 装入的细胞（E.coli）的载体的重组细胞内的复制，放大，从而使目的基因与载体。实验过程描述如下：

？

图18-3重组的选项之一

？⒈大肠杆菌处理（增加了膜的渗透性，易于进入细胞的基因）大肠杆菌（大肠杆菌细胞）接种于LB琼脂培养基上，37℃培养过夜。选择3至5的菌落接种到50毫升LB培养基中，37℃，振荡培养过夜后，A550测定，需要一定量的细菌（通常是细菌对数生长期），野生型（建议+，5x107cells /毫升）的0.2-0.3，和缺陷的类型（记录，5x107cells/ml）为0.5-0.6。的离心的上清液被丢弃，20毫升的氯化钙，50mmol / L时，悬浮液的细菌。冰上20分钟，并离心。弃去上清液，用2.5毫升冰50毫摩尔/升氯化钙悬浮。 4℃条件下48小时的转换，感受态细胞。

？⒉质粒转化的重组质粒（如基因重组，基因库等创建的）的感受态细胞（BRL公司DH10B菌株，例如）被设置为在冰水浴。虽然Falcon2059（传热系数稳定）塑料管置冰水浴。拍摄100μl的细菌悬浮液（DH10B），再加上10倍，在2059管巯基乙醇加入1μl稀释，在冰浴中被摇动2分钟，静置10分钟。 0.1加入50ng质粒转入试管中，轻轻摇动冰浴30分钟。此地时已经准备就绪，42℃水浴中。和SOC培养基，42℃备用。管被放置在42℃，45秒后，立即成立摆动冰浴中2分钟。因此，主管细胞热胀冷缩，质粒导入细菌细胞。再加上42℃的SOC培养基0.9毫升在试管中，37℃下进行1小时。 1000转离心10分钟，上清液悬浮的细菌200μlSOC介质。 LB-氨苄青霉素（100U/ml）接种在培养皿中，37℃培养过夜。将转化的细胞可以形成菌落（该质粒上的氨苄青霉素抗性基因）。的菌落被确定的基础上，约与靶基因或它们的产品。在LB肉汤培养物和扩大。基因库，转换，滤波，放大和纯化过程是基因的克隆过程。

？LB培养基（1L）：10克蛋白胨，5克酵母提取物，10克氯化钠，pH值7.5，高压灭菌。

？SOB培养基（1L）：20克蛋白胨，5克酵母提取物，0.5克氯化钠，并高压灭菌。单独制备的2mol / L的镁溶液（1mol / L的氯化镁和1mol / L硫酸镁等量混合和过滤灭菌），在使用前加入1ml至百毫升介质。

？SOC培养基（100毫升）：添加1毫升使用前，2mol / L的葡??萄糖通过过滤灭菌。

？第四，分离和纯化的核酸

？的核酸是存在于各种细胞，如病毒，细菌，寄生虫，动物和植物细胞各种标本，如血液，组织，唾液，尿等的其他来源的标本。分离方法是复杂多样的。由于各种的DNA，RNA的丰度的差异，各种分析方法，核酸纯度和量的要求是不同的，因此响应理解和选择之前，在实验中所使用的方法。在一般情况下，裂解细胞的基础上，分离和纯化的核酸分离和纯化，通过使用苯酚和有机溶剂萃取法（核酸溶解在缓冲溶液中，即，水相）的有机溶剂如乙醇，丙酮沉淀收获。由于不同的试样有用SDS加氢氧化钠有用蛋白酶溶解的细胞，一些使用方法，如超声破碎，苯酚提取，使蛋白质变性沉淀物在有机相中，而核酸被保留在水相中，以达到目的的分离核酸。对生物标本最丰富的蛋白质实验。为了除去残留的有机溶剂，在分离过程中，常用的方法是添加冷乙醇和盐以沉淀核酸，核酸中回收通过离心分离，然后用70％-80％的乙醇洗涤沉淀物以除去过量的盐，所以不影响溶解和抑制随后的酶促反应的步骤的核酸。除去蛋白质可与核糖核酸除去核糖核酸，得到纯的DNA，用DNA酶以除去得到的RNA的DNA，以获得纯化的核酸蛋白酶。开发了许多商业核酸分离柱，可以简单且迅速分离，从而获得高纯度的DNA或RNA。分离原理的一些使用中的核酸的分子量的差异，和一些使用的功能需要的分离的核酸，其特异性结合，实现分离和回收的目的。

？（A）的分离和纯化该质粒

？含质粒的大肠杆菌细胞由的LB培养基250毫升的扩大培养，倒入50毫升的离心管中，4℃下，至3000rpm，离心15分钟。弃去上清液。应进行消毒处理（丢弃，丢弃液体，以免对环境造成污染）。加裂解缓冲液（50毫摩尔/ L，葡萄糖10毫摩尔/升的EDTA，25毫摩尔/升的Tris-HCl，pH8.0）中，1 - 2毫升所以悬浮。在室温下放置5分钟，加入3.5毫升新鲜的制备SDS /氢氧化钠溶液（1摩尔/升的NaOH8毫升，20％SDS2毫升蒸馏水30ml）中上下摇晃，冰水浴中5分钟。振荡器被禁用，以防止DNA分子断裂），加入2.5mol / L的醋酸钾缓冲液（pH 4.8）中2.65.2毫升，垂直晃动，冰浴5分钟。 4℃，3000转，离心15分钟。沉淀蛋白质。上清液中加入无水乙醇，12-24毫升（上清液两次），以让室温后，万转离心15分钟，弃去上清液。加上约的沉淀物体积的0.4倍TE（10 mmol / l的pH为8.0的Tris-HCl，10毫摩尔/升EDTA）溶解沉淀物，添加0.2倍7.5mol / L乙酸铵。提供旋涡混合器和混合，在冰上10分钟。 4℃，10000RPM离心5min，取上清液丢弃。加上沉淀是0.4倍的10mmol / L的Tris-盐酸，pH为7.5，10毫摩尔/升EDTA缓冲液中，1/10体积为5mg/ml核糖核酸酶，37℃下，30分钟保温。加入等量的酚（苯酚）/ CIAA（480毫升氯仿，异戊醇20毫升），和混合。 4℃，10000RPM，离心5分钟。上层清液，加酚/ CIAA重复。的上清液溶液中加入1/10均为5mol / l的NaCl和2倍体积的无水乙醇中，-20℃过夜或-70℃2小时或更多。 4℃，万转离心10分钟，并弃去上清液。加入80％乙醇，不晃动，直接万转离心，将上清液丢弃，并真空干燥。加入TE溶解适量（约200μL）。内容确定后备用。

？靶基因的（b）的重组质粒的分离和纯化

？先取少量纯化的重组质粒，限制性内切酶消化，电泳分离的靶基因，确认。的200μl含2mg DNA（重组质粒），例如：加入10μl含100μg的DNA，加90μlTE。 ,1-2小时，1/10体积的缓冲液孵育1微克DNA加2-5U的限制性核酸内切酶。的类型的缓冲液和酶反应温度的核酸内切酶的类型的不同而不同。 1/10体积为3mol /升乙酸钠，2倍的乙醇，-70℃下，2小时（-20℃过夜），10,000 rpm下，10分钟离心，弃去上清液（乙醇沉淀）。适当量的沉淀物溶解在TE（切割质粒DNA与靶基因的混合物）电泳分离（同时与相应的分子量DNA标准电泳）和可视化在UV光下的结果的比较，与一个标准的DNA分子量，以确认靶基因和核酸内切酶切割效果。

？⒈电泳条件：

凝胶制剂：1％琼脂糖凝胶琼脂糖（毫克）X50TAE（毫升）EB（溴化乙锭微升）

？？（琼脂糖）1000 2.0 4.0

？总体积（ml）

？100

胶的浓度（％）：0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

长度的DNA（KB）：60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1

电泳缓冲液：X50TAE（毫升）EB（μl）的总体积（ml）

？20301000

？X50TAE：Trisma基地54克，钛57.1毫升0.5M EDTA pH值8.020毫升蒸馏水至1000ml。

？EB：10mg/ml的溴化乙锭。 （EB致癌性，操作应小心）。

电泳后，以适当的DNA（重组质粒）同上条件下切断，用1.5％的熔点低（<65℃熔点）的琼脂糖凝胶电泳分离。？含有该基因的区域的紫外线光下，切出与（凝胶），并放置在离心管中，提取和纯化。

？⒉从低熔点凝胶中提取和纯化的DNA片段加上相同的凝胶体积的TE（10 mmol / l的pH为8.0的Tris-HCl，0.1 mmol / L的乙二胺四乙酸），设定为65℃的水浴中温育5分钟，将凝胶完全溶解。放至室温，并加入等量的苯酚（TE饱和，TE闭合，在上部酚以较低者为准），轻轻混匀（不搅拌），12000rpm进，3分钟离心。重复1-2次。的上清液溶液中加入0.1体积的3mol / L的乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的乙醇??，并进行乙醇沉淀。将纯化的DNA溶解于TE加适量确定的内容，备用（可用于基因结构分析的目的，制备探针，等）。除了的低熔点凝胶回收方法，如一般的一个简短的电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心法，回收DNA片段的凝胶可用透析。

？（C）的样品DNA的分离和纯化

吗？5-10毫升的1xNTE（，EDTA的Tris-HCl pH7.4的10毫摩尔/升的NaCl 100毫摩尔/ L，1mmol / L的pH值8.0），以调节细胞是2×107（组织应切碎设置在液氮中冷冻，高速度搅拌切粉，和缓冲液）中的溶液。 λ/10~~λ/20体积（V）的10mg/ml的蛋白酶（Sigma公司Ⅷ型），1/20v 10％SDS，37℃下进行2小时。加入等量的苯酚/ 3xNTE的（3xNTE的信件）和混合（至少7分钟）。 4℃，3000rpm时10分钟。的上清液，加入2ml TE（的Tris-HCl，10毫摩尔/ L，pH值7.5，EDTA 1毫摩尔/ L，pH值8.0），调匀。乙醇沉淀。 2mlTE溶解的沉淀物。加1/30xNTE，蛋白酶K（10mg/ml的）被用来代替蛋白酶重复2-4步骤。含量的测定。

？（四）的样品，纯化的RNA被隔离

？纯化含有106细胞溶液等量的溶液[4 mol / L时，胍基硫氰酸酯，25毫摩尔/ L的柠檬酸pH值7.0，0.5％肌氨酸盐（十二烷基肌氨酸钠）和0.1mol / L的2 - 巯基乙醇]。总体积的细胞沉淀的4-5倍，并混合。加0.1体积为2ml / L，醋酸钠（pH为4.1），1倍体积的苯酚（重蒸水密封），振动筛，0.2体积CIAA剧烈混合10秒钟。冰水浴中15分钟。 10000xg4℃，20分钟。离心（不带刹车）。小心去除上清。添加等量的丙酮（或乙醇（2次）），-20℃，60分钟或更长。 10000×g下，4℃下进行20分钟离心。弃去上清液，。加上约0.3毫升纯化溶液与1.5ml离心管，3）的步骤被重复，离心10分钟，弃去上清液。 75％的乙醇，4℃10分钟离心，10000×g离心。弃去上清液，。在真空下干燥15分钟，和待机时间。

？五探针制备

？探针制备是标记的靶基因，核酸标记的缺口翻译方法，随机引物法，末端标记法和等常用的方法。该标记物质的放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素，地高辛，等）。 32P是最常见的核苷酸标记的同位素标记的dNTP的磷酸基团，容易标记，其特征在于，高活性，最多9000Ci/mmol发射高能量的β-射线，最多1.70MeV的标记的自显影时间探测与其所短，灵敏度高。 32P的半衰期为14天，超过标准的，一般标记，使用一个星期内，即使它的不方便，但利用废物处理，以减轻压力。 32P标记应注意保护，1-1.5cm厚的聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃隔离保护动作，应避免直接接触。胸部的经营者应穿戴个人仪表，定期检测。的实验中，应用程序特定的探测器（盖革 - 米勒探测器），检查的工作区，手，衣服等，以避免污染发生。其他同位素标记的，还应当指出的辐射防护。

？的非放射性标记的ELISA和化学符号。的ELISA法和免疫测定ELISA方法是类似的，除了被标记，而不是该核酸的标记抗体，其实，也称为标记抗体作为探针，应当指出的文献读取。许多商品是生物素（生物素），分别与地高辛，生物素-dUTP标记，生物素的DATP地高辛-dUTP的，等等。血凝素（抗生物素蛋白）是已知的一个非常高的亲和性和生物过氧化物酶或碱性磷酸酶（血凝素 - 酶），血凝素标记时，最终形成的杂交反应：探针 - 生物素数 - 血凝素 - 酶复合物（A，B，C）。酶催化底物显色，观察结果。不同于一般的酶反应底物，ABC法底物显色不溶物，观察结果。酶的复数形式，重现性差，成本高，但易于运输保存，灵敏度和辐射标记的相当可观的。某些化学??标记是使用相应的酶标记的抗体，以形成特定的复合物，上述方法比较，和一些可以是自发光的。化学标记方法简单，成本低，但灵敏度相对较低。