转膜液中忘记加乙醇怎么办

分子量不同。

快速转液膜不需要无水乙醇，因此分子量较小。快速转膜液是新赛美生物研发的一种高达20倍浓度的高效转膜液，用于WesternBlot湿转法转膜，能高效快速地将蛋白转移到印迹膜（PVDF或硝纤膜）上，不使用甲醇。

转膜液又称转移缓冲液/蛋白印迹转移缓冲液或转膜缓冲液，用于Western时湿法电转膜，适用于WesternBlot实验中把蛋白质转移到PVDF膜或硝酸纤维素（NC）膜上，以便进行抗体的孵育和下游实验。

如果转膜液颜色变成浅棕色或黄褐色，应该丢弃。

建议使用分析纯级别的乙醇或更高纯度的乙醇。如果转膜时设定的电流或电压较大，会有比较明显的产热现象，即产生所谓的焦耳热效应(Jouleheating)，并导致转膜液的电阻变小，最终影响转膜效率、转膜液的缓冲能力、甚至过热时导致凝胶熔化或黏附在膜上。

因此建议转膜时，在转膜槽内用冰盒降温，并将转膜槽置于冰浴中。同时也可以考虑转膜液配制好后先在4℃或者冰浴预冷。

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

需要两个试剂盒 碧云天（GS008 GS009）:一个用于生物素标记 ，一个用于凝胶迁移实验

配备TBE缓冲液可以配置成 5× 或者 10×的储液。

10x TBE 储液配制方法：

将Tris（FW=121）108g，硼酸（FW=61.8）55g，40 ml 0.5 M EDTA 溶解在600 ml的去离子水中；而后调节pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。使用时稀释10倍 即为1×TBE Buffer。

（1）设计重组引物TF-F，R，进行PCR扩增，PCR产物纯化回收。

（2）使用NEB限制性内切酶将pet28a载体线性化，并进行纯化回收。

（3）利用重组试剂盒进行重组反应(Vazyme, C112-02）。

（4）将反应体系加入DH5α感受态中，进行转化，涂板，挑斑检测。挑选阳性菌液过夜培养，提质粒，-20℃保存备用。

参照康为世纪试剂盒：His-tag 标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）

（1）使用1xTEN buffer溶解单链探针，将互补的单链探针按1:1混匀。

（2）95℃加热10分钟，自然降温到15-25℃。

（3）取出退火探针，加入适量的1 x TEN buffer稀释浓度至3-4pmol/ µl.。

（4）将100ng退火探针置于无酶的PCR管中，加去ddH2O补至10 µl。

（5）按以下体系将各组分混合，37℃孵育30分钟

a. 参考上表设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100µl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。

b. 用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37ºC孵育30分钟。

c. 加入2.5µl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。

a. 探针标记反应终止后，加入52.5µl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。

b. 12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。

通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：

a. 对于100µl标记好的探针，加入1/4体积即25µl的5M醋酸铵，再加入2体积即200µl的无水乙醇，混匀。

b. -70ºC至-80ºC沉淀1小时，或-20ºC沉淀过夜。

c. 4ºC，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。

d. 4ºC，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 e. 加入50µl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20ºC保存。

a. 取5µl Biotin-Control Oligo (0.4µM)，加入196µl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。

b. 取3µl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27µl TE，混匀，稀释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。

c. 参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。对于经过梯度稀释的标准品和待测样品，分别取2µl滴加到膜上。在膜上滴加标准品或待测样品时，请注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一个湿的圆形小斑点。说明：如果条件许可，可以使用专门用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测，探针的用量参考下表，浓度可以再稀释50倍，而所用体积可以相应放大50倍至100µl。

a. 对于步骤2B标记好的单链DNA探针，把正义链和反义链等体积混合(不可根据标记效率调整摩尔比例)。对于最初使用变性的双链EMSA探针进行探针标记的情况，直接进入下一步。

b. 加入退火缓冲液(10X)，使退火缓冲液的最终浓度为1X，混匀。例如待退火探针的体积为100微升，则加入11微升退火缓冲液(10X)。

c. 如下设置PCR仪进行退火反应：

注1：如果所用的PCR仪不具备下降0.1ºC的功能，也可以设置为每90秒下降1ºC。

d. 退火反应结束后，-20ºC保存标记好的EMSA探针。此时的EMSA探针已经可以直接用于后续的EMSA检测，也可以对探针进行适当纯化后再进行EMSA检测。

a. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置)，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。

b. 按照如下配方配制20ml 4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。

注意：此实验中需去除SDS变性剂

c. 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理

b. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25ºC)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25ºC)放置20分钟。

c. 加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可。

a. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。

b. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10µl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。

c. 按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30ºC，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。

a. 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。

b. 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。

c. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。

d. 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。

e. 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。 碧云天/Beyotime 400-1683301/800-8283301 GS009 化学发光法EMSA试剂盒 3 / 5

f. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4ºC冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。

g. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。

a. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒(根据经验，建议交联30min)。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。

b. 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。

c. 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。

a. 37-50ºC水浴溶解封闭液和洗涤液。 注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50ºC之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。

b. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

c. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。

d. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

e. 取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。

f. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。

g. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。

h. 重复步骤G 三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。

i. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。

j. 取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混匀，配制成BeyoECL Moon工作液。注意：BeyoECL Moon工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。

k. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。

l. 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。

m. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。

n. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。

SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。(主要分为浓缩胶和分离胶，配方可自己上网查下)

(2) 样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩[V1] 的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白[V2] 。

(3) 上样与电泳

冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。

电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B)。

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3. 转膜(Transfer)[V3]

我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33)。硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。

通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

4. 封闭(Blocking)

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景[V4] 。

用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液(P0023B)，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体[V5] ，可以4℃封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(P0023A)稀释一抗。

用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或根据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。

回收一抗[V6] 。加入Western洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体(AT819)或Actin抗体(AA128)，进行内参检测。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有多种二抗提供。

用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

回收二抗。[V7] 加入Western洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7. 蛋白检测(Detection of proteins)

参考相关说明书，使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL类试剂来检测蛋白。压片可以采用专用的压片暗盒(FFC58/FFC83)进行。

洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片(FF057/FF081)。

8. 膜的重复利用(Membrane recovery)

如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

2. 样品如何处理？

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，

TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；

十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

7. 为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

8. 为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

9. 什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

11. 为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

15. 电泳时间比正常要长？

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统

一般电泳液，转膜液的存储温度在20度左右，在气温较高或连续生产时漆液温度会明显上升，为保证漆膜的质量，须对漆液进行冷却，可采用循环地下水冷却，冷却塔冷却或冷冻机强制冷却。

电泳液是核酸、蛋白质凝胶电泳系统的一个重要组成，是电泳场中的导体，也是维持电泳系统恒定pH值的必要条件。其成分及其离子强度影响物质的电泳迁移率，应避免与被分离的样品发生化学反应而改变样品的理化性质或使其丧失生物活性。

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲夜 配制量：1升

所用试剂：Tris碱，甘氨酸和 SDS

配方：15.1 Tris碱

94g甘氨酸

50ml 10％ SDS

或5g SDS

用900ml水充分溶解后，pH值约为8.4，用少量浓盐酸（约2.5ml）调至pH8.3，定容至1升，室温贮存备用。

使用时，直接用双蒸水稀释五倍（100ml缓冲液+400ml双蒸水,混匀，常温保存）。一般此电泳液可反复使用三到五次，如果发现有明显沉淀或者漂浮时，请丢弃换新的。

10×电转液 (1L)

所需试剂 ： Tris，甘氨酸和SDS

配方：30.3g Tris

144g 甘氨酸

3.7 g SDS (如有必要可加)。

用800ml蒸馏水溶解后定容至1L。分装室温储存。