盐酸胍在提取DNA中的作用是什么

蛋白质担负着复杂的生化反应，在行使生物功能时，必须具有特定的三维空间结构。在生物合成以后，蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程。在生化试验中，常需要对蛋白质进行变复性研究，盐酸胍和尿素是蛋白质变复性中最常使用的试剂，那么二者有什么区别？实验中该如何选择呢？

 由于外界因素作用，使天然蛋白质分子的构象发生异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化，这种现象称为蛋白质的变性。变性可以涉及次级键、二硫键的断裂，但不涉及一级结构上肽键的断裂。

 盐酸胍和尿素变性蛋白质包括两种机制：第一种机制是变性蛋白质与盐酸胍和尿素优先结合，形成复合物，当复合物被除去，反应平衡移动，随着变性剂浓度的增加，天然状态的蛋白质不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；第二种机制是盐酸胍和尿素对疏水氨基酸残基的增溶作用，因为盐酸胍和尿素具有形成氢键的能力，盐酸胍和尿素在高浓度(4～8mol/L)水溶液时能断裂氢键，结果盐酸胍和尿素就成为非极性残基的较好溶剂，使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加，从而使蛋白质发生不同程度的变性。

 二者在蛋白质变性中的差别：

 浓度 ：在室温下，3～4mol/L盐酸胍可使球状蛋白质从天然状态转变至变性状态的中点，通常增加变性剂浓度可提高变性程度，约6mol/L盐酸胍可以使蛋白质完全转变为变性状态。盐酸胍由于具有离子特性，因而比尿素的变性能力强。一些球状蛋白质，甚至在8mol/L尿素溶液中也不能完全变性，然而在8mol/L盐酸胍溶液中，它们一般以无规卷曲(完全变性)构象状态存在。

 溶解度 ：尿素溶解能力较盐酸胍慢而弱，溶解度为70%~90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但其具有不电离，中性，成本低等优点；盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰，但成本较尿素高、在酸性条件下易产生沉淀、可能对后续实验有干扰等缺点。

 总体而言，作为蛋白质变性过程中常用的试剂，盐酸胍和尿素的优缺点分别为：盐酸胍溶解能力和变性能力相对较强，不会造成重组蛋白质的共价修饰，但有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点；尿素溶解能力相对较弱，但具有不电离、呈中性、成本低、蛋白质复性后不会造成大量蛋白质沉淀等优点。在实际实验中，研究人员需要根据条件及目的进行选择，以获得最优的实验结果。

复杂现象背后隐藏着简单的模式，简单的模式背后隐藏着基本的道理。

一棵苹果，掉在牛顿头上，就产生了万有引力，和现代力学；

正是因为牛顿发现并精准定义了这种模式：重物向“下”落，而不向上飞；

才导致这种模式背后规律，万有引力的发现。

科学发展史上也有很多这种“苹果”，

孟德尔看到了红花，白花，粉花的开花的统计规律，开创了遗传统计学，并导致了后来DNA的发现；

门捷列夫把元素和化学性质排成表格，发现了元素周期律；

路易斯发现了稳定化合物中元素成键的8电子配对律，并发展出了价键理论；

此外，把一些复杂的现象总结成为简单的模式或者概念，可以大大帮助我们理解一些规律，

比如，化学基团的亲电性和亲核性，物质的亲水性和疏水性。

所以，发现一种模式，就像发现了科学的矿井一样，可能挖掘出重大的理论或概念。

不过，还有很多模式或者现象还尚未被理解或解释，

比如，最近科学网上讨论的热水比冷水先结冰的现象，还有，这里要谈的物理化学发展史上的霍夫梅斯特序列。

100多年前，葡萄牙科学家Hofmeister发现了一个与蛋白质变性剂有关的规律。

我们知道，煎鸡蛋时，蛋清会成为蛋白，就是因为煎锅热使蛋白质失去它的天然结构，转变成为了不透明的肽链聚合物。这种转变就称为蛋白质变性。此时蛋白质失去特有的结构和功能。不仅加热可以使蛋白质变性，加某些盐、糖、或者有机小分子比如尿素，也能使蛋白质变性，称为化学变性。你说通常往鸡蛋清里加食盐(NaCl)并没有看到蛋清变浑浊啊？是的，不同的盐有不同的变性效果。有的盐，加一点就可以使蛋白质变性，比如硫氰化钠(NaSCN)，盐酸胍(GdmCl)， 有的盐，则需要加很多才能起效，或者在达到最大溶解度时也不能使蛋白质变性，比如NaCl， Na2SO4。

我们也知道，盐溶解于水会成为离子，因此，加盐使蛋白变性的过程必然是离子起的作用，那么，把这些离子按照它们变性能力，或者说起变性作用时的浓度，按照大小排个序，这就是Hofmeister Series，霍夫梅斯特序列。

霍夫梅斯特发现的序列是这样的，SO42- >Cl- >NO3- >Br- >I- >ClO4- >SCN-

为什么只有阴离子呢？阳离子序列也是存在的，只不过，Hofmeister发现起变性作用的，主要是阴离子的功劳。

随后发现，Hofmeister发现的这个序列，对涉及离子的很多现象适用，比如，盐离子不仅影响蛋白质胶体的稳定性，而且影响其溶解度，即稀的盐溶液可以增加或减小蛋白质的溶解度。那么在同等浓度下，按照对蛋白质的溶解度大小的改变排列，可以发现相同的离子序列。

除了蛋白质溶液，离子对其它大分子胶体溶液的稳定性和溶解度，也有类似的序列；

除了胶体溶液，盐离子对纯的盐溶液的性质，也有相同序列。比如，加盐可以改变水的粘度和表面张力，对离子的这种能力列表，可以发现类似的Hofmeister序列。

在过去的100年中发现的数十种序列中，虽然有小部分反例，但大多数序列中离子的位置是一致的。这说明在此序列背后，存在类似的规律决定了离子对液体水的性质的改变，和对蛋白质，多肽和DNA等对胶体溶液的性质的改变。当然，正如有的人反驳的那样，这些序列存在不能说明这些性质都是有相同的规律支配的。但是，至少可以肯定，在与离子有关的一些热力学和动力学规律中，离子某种性质起了主要或大部分作用。毕竟，静电作用（指离子-离子，离子-偶极）是离子溶液中所有分子间作用中最强的作用，其它作用包括溶剂水分子之间的偶极-偶极作用，所有种类之间的短程排斥，和色散、诱导作用。在水溶液中，后面这些作用相比静电作用要弱的多。

那么，有没有理论能解释这个某个现象的Hofmeister序列呢？还没有。比如，预测经典稀溶液活度系数的德拜-休克而离子强度理论，描述胶体稳定性的DLVO理论，均认为溶液性质只与离子的电荷和浓度有关，却并不包括“同种电荷离子具有不同Hofmeister效应”的参数项。把离子的大小考虑进来，能够显著改进现有理论，这就是所谓的“电荷密度解释”。但是，只考虑“电荷密度”也不能完全解释Hofmeister序列，毕竟，水在其中的作用不可忽视。

目前，理论界关注的焦点是离子的溶剂化效应，即关注离子-水之间的作用。当前的一些现有理论，不管是离子强度理论，还是电荷密度理论，都把溶剂水看成连续的，均匀的，不变的。但是，我们早就知道，离子溶于水以后，会和水分子结合形成溶剂壳层(Hydration shell)。这种壳层结合会减少自由活动的水分子，或者减少可供大分子表面结合的溶剂分子数量。此外，离子在水中运动，会带着自己的溶剂壳层一起运动。当然，溶剂壳层中的水分子，并不是固定不变的，它们以一定的频率与外界的自由水分子进行交换。溶剂化效应至少从密度和扩散两个方面影响着整个液体水的性质，即含离子的水不再是均匀的，连续的。要想构造一个理论，来考虑这种不均匀性，至少要搞明白离子对溶剂壳层的水分子有什么影响，对壳层之外的水分子有什么影响，这种影响能够持续多远。

目前，对于离子-蛋白质稳定性/溶解度序列的解释，主要有两种粗糙的观点，一种观点认为，离子对溶剂水的影响局限在壳层内，对壳层外的水分子没有任何影响，因此离子对蛋白质等胶体大分子稳定性的影响，通过与胶体分子直接接触起作用；这种观点称为“直接作用模型”；另外一种观点认为，离子不仅影响壳层内的水分子，而且影响壳层外的水分子，所以无需直接接触大分子，即可影响胶体大分子的溶解度或者稳定性。这种观点称为“间接作用模型”。支持直接作用模型的，主要是Bakker等发展的介电响应光谱发现壳层外的水分子的重取向运动（转动周期）与离子的存在没有任何关系。支持“间接作用模型”的实验主要是一些红外光谱，发现了水的氢键网络模型受到离子的影响，尽管这种影响的幅度有争议。

在这个领域，要想提出一个合理解释和一个理论模型，就要尽可能搜集所有实验事实，然后进一步设计实验验证。但是，在分子尺度上研究其结构和动力学很难，因为水分子太小了，氢原子的量子效应也比较强；此外，要想解释已有的实验现象也很难，因为很多实验现象本身也很有争议。比如，绝大多数实验都是在阴阳离子共存的溶液中做的，在分解贡献时都难免采用含混不清的近似理论。最近几年，UC Berkeley的Evan R. Williams课题组用质谱打出只包含一个离子的水分子簇并结合红外光谱(IRPD)进行研究，能够排除这个问题，但是红外光谱能够获取的信息还是很有限的。

按说，使用分子模拟方法应该很容易研究溶剂化效应，在实际中的确如此，比如用中子散射确定溶剂壳层中的水分子个数，一般要和模拟得到的结果做对比，因为实验本身的分辨率很低。不过，能够用来模拟水溶液的适用理论的准确度都不高：用经典力场吧，它们的参数都是拟合宏观实验值的，不保证微观结构的准确性；用密度泛函理论(DFT)吧，色散成很大问题，导致熔点、沸点跟实验值差100K以上，还不如经典力场。

毫无疑问，Hofmeister series背后，隐藏着离子-溶剂二元体系，和离子-水-胶体大分子三元体系热力学的一些秘密。这些秘密能够帮助我们建立一个可预测性质的理论。然而，鉴于其中的物理和数学的复杂性，这个领域仍然在期待着天才的降临。

根据以往客户对于多肽如何保存使用等等的常见问题，我们在这里进行了汇总整理，希望对各位有所帮助

01

我该如何处理和保存多肽？

冻干粉形式的多肽，经密封包装可在常温条件下稳定运输，溶解状态的多肽不宜长期保存。

昂拓莱司多肽保存指南：需要长期保存的多肽，应以冻干粉形式存放在含有干燥剂的密封容器内，置于-20°C保存，-80°C效果更好，可以最大限度地避免多肽降解。这种储存方式可以使多肽可保存数年，避免了被细菌降解和氧化，也可以避免二级结构的形成。

打开包装： 在打开包装和称重前，请先将多肽在干燥器中平衡至室温。因多肽往往具有吸湿性，未经平衡到室温的多肽在打开盖子后易凝结，从而降低了多肽产品的稳定性。

称重： 迅速称取您所需的多肽，并将剩余多肽继续储存在-20°C或更低温度。与其他多肽相比，含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和谷氨酸N -末端的多肽保存期更短。

02

如何溶解多肽？

昂拓莱司生产的多肽的溶解性很大程度上取决于多肽的极性。酸性的蛋白溶解于碱性溶液，而碱性蛋白可溶解于酸性溶液，含有大量不带电荷的极性氨基酸残基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有机溶剂中，如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或异丙醇，然后加水（蒸馏水）稀释。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因为DMSO可能造成侧链氧化。

多肽溶解测试：在多肽溶解之前先取小部分进行多肽溶解测试，您需要测试几种不同的溶剂，直到找到最适当的一种。超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。（注意: 超声处理会引起溶液发热和多肽降解。）

将每个酸性氨基酸赋值为－1，包括天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、以及羧基末端-COOH。每个碱性氨基酸赋值为＋1，包括精氨酸（R）、赖氨酸（K）、组氨酸（H）以及氨基末端-NH2。然后计算整个多肽的电荷数。

如果整段肽所带电荷是阳性的，说明该肽是碱性的。可先尝试用蒸馏水来溶解；如果不溶于水，接着尝试用少量10%-25%醋酸溶解，如果仍然失败的话，添加一些TFA（10-50微升）来增溶，然后用水稀释至理想浓度。

如果整段肽所带电荷是阴性的，说明该肽是酸性的。酸性的多肽可以尝试用PBS（PH 7.4）来溶解，如果不溶的话，添加少量的碱性溶剂，如0.1 M的碳酸氢铵，然后加水稀释至理想浓度。含有游离半胱氨酸的多肽应溶于脱气的酸性缓冲液中，因为当PH值大于7时，巯基会被迅速氧化成二硫化物。

如果整段肽电荷是零，说明肽是中性的。中性肽通常溶于有机溶剂。首先，昂拓莱司建议您尝试添加少量乙腈、甲醇或异丙醇。对于高度疏水的多肽，可使用少量的二甲基亚砜溶解，然后用水稀释至理想浓度。对于含有自由半胱氨酸的肽，需使用DMF而不是DMSO。对于有聚集倾向的肽，可添加6M盐酸胍或8M尿素，然后进行必要的稀释。

为了防止或尽量减少多肽降解，请将多肽以冻干粉形式保存在-20°C，-80°C更佳。如果需要保存溶液肽，最好分成小样存放，以避免反复冻融。一份样品融冻后未用完，应扔掉。细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦，所以请将肽溶于无菌水或肽溶液过滤除菌。

碱性氨基酸: K, R, H,N-terminus

酸性氨基酸: D, E,C-terminus

极性中性氨基酸: F, I,L, M, V, W, Y

非极性疏水氨基酸: G, A,S, T, C, N, Q, P, 乙酰基，酰胺基

举例说明：

RKDEFILGASRHD:(+5) + (-4) = +1 认为是碱性多肽

EKDEFILGASEHR:(+4) + (-5) = -1 认为是酸性多肽

AKDEFILGASEHR:(+4) + (-4) = 0 认为是中性多肽

03

一个肽段是否可溶能预测吗？

昂拓莱司无法通过研究多肽的结构来预测其在水中的溶解度。然而，赖氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍通常有助于预测溶解度，尤其是短肽。与此相反，含有天门冬氨酸和谷氨酸的酸性肽往往是不易溶于水的，但易溶于稀氨水或碱性缓冲液。

04

如何选择适合自己研究的多肽纯度？

昂拓莱司不推荐将粗品肽使用于生物实验。粗肽可能含有大量的非肽类杂质，如残留的有机溶剂、清除剂、TFA和其他不完整肽。TFA不能被完全消除，通常交付的肽以TFA盐的形式存在。如果残留的TFA影响您的实验，我们推荐其他盐形式，如醋酸盐和盐酸盐等。这些盐通常比常规TFA盐贵20-30%以上。这是由于在转化过程中出现更多的肽损失和需要更多的原材料。

昂拓莱司建议对各种项目采用以下级别的肽纯度：

>70% 肽纯度

肽微阵列

作为制备抗体的抗原

层析法

酶联免疫吸附试验检测抗血清滴度

>80% 肽纯度

免疫印迹法（非定量）

酶底物肽（非定量）

封闭肽（非定量）

亲和纯化

磷酸化检测

蛋白电泳的应用和免疫细胞化学

>95% 肽纯度

标准酶联免疫吸附试验和RIA（定量）

受体配体相互作用（定量）

体内、体外

生物学测定

酶的研究和阻断实验（定量）

NMR研究

质谱分析

其他定量检测

>98% 肽纯度

SAR研究

临床试验

APIs(药物活性成分)

工业品

X-ray晶体研究

其他敏感的实验：酶与底物、受体与配体相互作用、阻断和竞争实验

05

什么是多肽的纯度？

多肽的纯度是指HPLC方法在214nm处检测到的目标多肽的含量(214nm是肽链的吸收波长)，紫外分光光度计检测不到水和残留的盐不。可发现其他的杂质包括：缺失序列（缺失了一个或多个氨基酸残基的靶序列），截断序列（加帽过程中产生的序列）脱保护不完全序列（产生于整个合成过程或最后的裂解过程）。

多肽纯化不涉及水和盐。HPLC纯化会产生少量的TFA，如：游离的氨基末端和其他侧链如Arg、Lys、His都可生成少量TFA杂质。昂拓莱司通常交付的多肽多含有微量TFA和残留水。即使处于冻干状态，水也会因共价结合的能力不同而不同程度地存在着。

纯化前的多肽中包含的杂质包括多肽和非多肽物质, 纯化后的多肽中包含的杂质除了TFA盐，大多数为序列被修改的多肽。

缺失了一个或多个氨基酸残基的靶序列

为避免缺失序列的产生而进行的加帽操作，截断序列即产生于加帽过程中

产生于整个合成过程或最后的裂解过程

保护基重新附着在多肽的其他位置

06

什么是肽净含量？

肽净含量不同于多肽纯度。肽净含量是指与非肽物质（主要为抗衡离子和水）相比的多肽量。可通过氨基酸分析来确定肽净含量。通常，亲水性多肽即使在严格的冻干状态下，也会吸收微量的水。因纯化和冻干工艺，会导致不同批次的肽净含量有所不同。

07

如何合成多肽？

不同于天然蛋白质的合成，人工合成的方向是从C到N端。昂拓莱司的多肽合成是基于PeptideSyn技术平台的Fmoc或t-Boc法的多肽合成。具体合成由下列几个循环组成：①去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用piperidine去除氨基的保护基团。②激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。③循环：这两步反应反复循环直到合成完成。接着合成的肽从树脂切割和去保护。最后被沉淀、洗脱、冷冻干燥。

08

我应该用什么盐形式？

肽通常以TFA盐的形式传递。如果残留的TFA对您的实验有问题，我们建议其他盐形式，如醋酸盐和盐酸盐。这些盐形式通常比普通的TFA盐贵20-30%，因为在盐转化过程中发生肽损失，并且需要更多的原材料。

09

如何对合成的多肽进行质检？

公司对客户提供的所有材料均严格保密。昂拓莱司是在发送产品时，同时免费提供HPLC和MS检测结果。公司所有多肽均采用反相色谱法纯化。以质谱法测定肽的分子量来确定产品是否正确，MS检测结果还可显示大部份的主要杂质。如果必要，还可提供肽净含量检测，如氨基酸分析或元素分析。这些方法可以证实多肽的氨基酸组成，他们均可作为多肽确认的补充方法。所有交付的肽均达到了客户要求的纯度。没有达到纯度要求的那些多肽均被丢弃。当然如果客户需要，也可以发送给他们。

10

公司对合成的多肽提供分装服务吗？

根据要求，昂拓莱司可以将您的部分或全部订单，免费分装成小份。由于少量分装可以避免多次反复冻融，减少容器的开盖和闭合的次数，减少处理不当或细菌污染的机会，让您的多肽更加稳定。

欢迎各位提问关注，还有什么不清楚的有疑问的，可以随时联系我们！

氧同位素一般通过气态CO2进行质谱分析，而最近发展起来的激光探针制备技术可以直接分析有机质高温裂解产生的CO和O2。有多种方法可使氧从各种含氧化合物中释放出来。

在温度为500～600℃的条件下，硅酸盐和氧化物中的氧通常在镍管中，经过与F2、BrF5或ClF3的氟化处理(fluorination)，或通过激光加热的方法进行释放(Taylor ＆ Epstein，1962Clayton ＆ Mayeda，1963Borthwick ＆ Harmon，1982)。在温度为1000～2000℃条件下，利用碳还原分解法释放氧仅适用于石英和铁的氧化物，并不适用于所有硅酸盐(Clayton ＆ Epstein，1958)。通过加热石墨或金刚石使氧转化为CO2，这一步必须非常谨慎，以保证氧的产生率，否则在折射率较高的矿物如橄榄石、石榴子石等存在的情况下，将影响氧的产生率。较低的氧产生率可导致异常18O/16O比，而较高的氧产生率则是由真空抽取管线内过多的水分导致的。

传统氟化处理一般用于样品量在10～20mg的全岩粉末或从大量矿物样品中分离出来的单矿物样品。由于氟化处理技术不能对范围很小的点进行原位检测，所以该技术不能用于确定氧同位素的天然不均匀性。Sharp(1990)首次提出的激光微探针(lasermicroprobe)技术彻底改变了矿物测试方式。激光微探针技术以其较高的分辨率和较高的精度，能够对单一矿物晶粒内部、交生矿物和增生矿物的同位素分带进行研究。

在25℃的温度下，碳酸盐与浓度为100%的磷酸发生反应，这一方法首先由McCrea(1950)提出。反应式如下:

稳定同位素地球化学( 第六版)

Me为二价阳离子，该反应式显示碳酸盐中的氧仅有2/3被释放出来，并发生了明显的同位素效应，其数量级为10‰，若不同的阳离子参与、不同的反应温度下的制备过程，其变化最多可达千分之几。必须事先得知精确的酸分馏系数才能获得碳酸盐的氧同位素比，通过BrF5氟化处理，来测得碳酸盐的δ18O值而获得分馏系数。这一方法是由Sharma ＆ Clayton(1965)提出的。

各实验室关于磷酸处理的制备技术可能存在很大的差异。两种常用的制备CO2方法为密封容器法(sealed vessel method)和酸浴法(acid bath method)。由酸浴法产生的CO2被连续带走，而由密封容器法产生的CO2则被不会被带走。Swart et al.(1991)证实，在25～90℃的温度范围内，这两种方法得出的18O系统差异为0.2‰～0.4‰。其中由酸浴法得出的结果可能更精确。后来，酸浴法进一步改进为单独酸浴法(individual acid bath method)，其可最大程度地降低由酸输送系统导致的污染。Wachter ＆ Hayes(1985)指出，在磷酸反应过程中需要特别小心，在他们的实验中，在75℃的条件下与浓度为105%磷酸反应可获得最佳效果。但是，在高温度条件不，很难通过碳酸盐反应速率(carbonate reaction rate)来辨别碳酸盐的种类。

由于某些碳酸盐(如菱镁矿或菱铁矿)在25℃时的反应速度很慢，因此，须在较高的温度下反应才能将CO2从这些矿物中提取出来。反应温度各不相同，最高可达90℃，甚至150℃(Rosenbaum ＆ Sheppard，1986Bttcher，1996)，不同的研究者确定的分馏系数存在较大差异。例如，关于文石和方解石之间的同位素分馏仍然存在争议，同位素分馏从负值到正值均有报道。Grossman ＆ Ku(1986)曾报道的分馏高达1.2‰，但是普遍的观点是文石的分馏约比方解石的要高0.6‰(Tarutani et al.，1969Kim ＆ O'Neil，1997)。白云石－方解石之间的分馏将因矿物成分的不同而改变(Land，1980)。表2.4给出了各种碳酸盐的酸分馏系数。

表2.4 25℃温度下碳酸盐的酸分馏系数

(据Kimetal.，2007，有修改)

磷酸盐首先被溶解，然后产生磷酸银(Ag3PO4)沉淀(Crowson et al.，1991)。采用Ag3PO4，主要因为它不吸水，可以不经过多个化学净化步骤而迅速沉淀(O'Neiletal.，1994)。然后对Ag3PO4进行氟化(Crowson et al.，1991):在熔炉中用石墨(O'Neil et al.，1994)，或用激光(Wenzel et al.，2000)，或采用热裂解(Vennemann et al.，2002)进行还原。在室温条件下，由于PO3－4不与水交换氧，因此，Ag3PO4的同位素组成即为天然磷酸盐中PO3－4的同位素组成。根据Vennemann et al.(2002)的总结，传统氟化处理仍然是最精确的Ag3PO4分析技术。此外，很多学者还尝试采用激光技术检测矿物碎屑(Cerling ＆ Sharp，1996Kohn et al.，1996Wenzel et al.，2000)，但是磷酸盐矿物容易被成岩矿物污染，因此通常需对特定组分(CO2－3或PO3－4)进行化学处理。

硫酸盐以BaSO4的形式沉淀，然后在温度为1000℃下用碳进行还原，产生CO2和CO。CO可用来直接测量或在铂电极之间用放电方法将其转换为CO2(Longinelli ＆ Craig，1967)。通过连续流方法分析硫酸盐中的氧，比离线技术更精确、更省时。Bao ＆ Thiemens(2000)曾采用CO2激光氟化系统来释放BaSO4中的氧。

水的18O/16O比值通常是在恒定温度下，由少量CO2和过量水达到平衡后测定的。特定温度下，确定CO2－H2O达到平衡时的分馏系数非常重要，多位学者已通过实验法确定在25℃时，该分馏系数是不同的。1985年国际原子能机构(IAEA)顾问团会议中提议1.0412为最佳估算值。

此外，还可通过与盐酸胍(guanidine hydrochloride)反应的方法将水中所有的氧定量转化为CO2(Dugan et al.，1985)，其优点是可以不必假设H2O－CO2同位素分馏系数即可获得18O/16O比。另外，用TC－EA法通过在线热解(on-line pyrolysis)也可以对水的氧同位素进行检测(de Groot，2004)。

蛋白质溶解度的大小受到一些条件如pH值、离子强度、温度、溶剂类型等的影响。蛋白质的溶解度在等电点时通常是最低的，pH值在高于或低于等电点时，蛋白质所带的净电荷为负电荷或正电荷，其溶解度均增大。蛋白质的溶解度在pI时虽然是最低的

但是...

锌试剂（2-carboxy-2-hydroxy-5-sulfoformazylbenzene）长期以来一直被称为一个优秀的比色检测试剂的锌和铜离子在水溶液中。延长螯合剂的versa-tility来量化金属离子在金属蛋白，锌试剂及其光谱特性配合物的铜锌2 +，2+，2+，研究了在盐酸胍存在和尿素，常用的变性剂用于活化金属离子在蛋白质。这些研究显示检测金属一般更敏感的尿素。此外，值分布记录这些金属表明最佳值的复杂的形成和稳定在9。因此，一个优化的方法，可以简便测定铜锌2 +，2+，2+和检测限高na nomolar范围是。此外，一个简单的两步骤程序量化两个锌和铜2+2+在同一样品的描述。使用原型铜2 + /2+–蛋白锌超氧化物歧化酶作为一个例子，这种方法的有效性双金属量化蛋白表现。因此，分光光度法测定金属离子与锌试剂可以利用作为一种快速，廉价的手段，评估的金属含量的锌，铜，钴，锌/ cop-per-containing蛋白质。金属是不可或缺的要素，大约有三分之一的蛋白[ 1]。因此，金属都参与了几乎所有的生物过程，包括代谢，能源结构，基因表达，细胞信号，形成内和exo-skeletons，和电子与信息传递。该技术适用于量化的金属离子在金属蛋白，电感耦合等离子体质谱法和原子吸收和发射光谱，可能是最广泛使用[ 3]。然而，虽然这些技术是可靠的和敏感的，他们受到限制，而不是昂贵（考虑仪器acquisi-tion维修），费时（方面的样品制备），和并不总是容易获得[ 4 , 5]。因此，简单的分光光度法（或荧光）技术，这往往是不太昂贵和劳动力密集的，是可行的替代这些方法需要更先进的仪器。

组合化学是一门将化学合成、组合理论、计算机辅助设计及机械手结合一体，并在短时间内将不同构建模块用巧妙构思，根据组合原理，系统反复连接，从而产生大批的分子多样性群体，形成化合物库（compound library），然后，运用组合原理，以巧妙的手段对库成分进行筛选优化，得到可能的有目标性能的化合物结构的科学。

组合化学与传统合成有显著的不同。传统合成方法每次只合成一个化合物；组合合成用一个构建模块的n个单元与另一个构建模块的n个单元同时进行一步反应，得到n×n个化合物；若进行m步反应，则得到（n×n）m个化合物。有人作过统计，一个化学家用组合化学方法在2～6周的工作量，十个化学家用传统合成方法要花费一年的时间才能完成。所以，组合化学大幅度提高了新化合物的合成和筛选效率，减少了时间和资金的消耗，成为20世纪末化学研究的一个热点。

组合化学的合成技术及对传统药物合成化学的冲击　组合化学合成技术

组合化学合成包括化合物库的制备、库成分的检测及目标化合物的筛选三个步骤。化合物库的制备包括固相合成和液相合成两种技术，一般模块的制备以液相合成为主，而库的建立以固相合成为主。

固相技术 液相技术

优点 纯化简单，过滤即达纯化目的，反应完全；合成方法可实现多设计；操作过程易实现自动化 反应条件成熟，不需调整；无多余步骤；适用范围宽。

缺点 发展不完善；反应中，连接和切链是多余步骤；载体与链接的范围有限 ；反应可能不完全；纯化困难；不易实现自动化。

1多针同步合成

多针同步合成是固相合成的基该方法。将96只带有载体针的小棒固定在同一块板上，其位置与96孔滴度板相对应，然后在96个孔中分别加入不同的反应物及试剂，即可同步合成96个样品。

Dewitt等对此法进行改进，使用下图装置（装置图 动画），在玻璃管的上端加一个硅橡胶垫片，可用注射器加样，管的外面有一个列管式夹层，可对反应物加热或冷却。

他们以此装置合成40个乙酰脲衍生物和具有生理活性的1，4-苯并二氮卓衍生物。（反应式6-43 动画）

2混合-分离随机合成法

1991年Lam等报道了以树脂为载体，进行随机合成，可以同步合成上百万个分子，并提出一珠一肽的概念。首先将19种保护的天然氨基酸分别连在树脂上，混合脱除保护，再分成19份分别与19种保护氨基的氨基酸进行偶联反应，可以得到19×19种连在树脂上的二肽，如此进行五次，可合成出195=

2,476,099种连在树脂上的侧链保护的五肽，脱除侧链保护但不从树脂上切下，可得到由近2.5万连在树

脂上的不同肽段的五肽组成的肽库。此法保证同一树脂上的肽段序列是相同的，即“一珠一肽”。

用该肽库与受体分子反应，可形成显色络合物的肽段树脂就会由无色变为有色，在显微镜下把显色的树脂拣出，用8摩尔/升的盐酸胍洗掉络合物后，用微量多肽测序仪即可测出该肽序列。

Lam等用该法合成的五肽库对抗β-内啡肽的单克隆抗体进行了亲和性研究，找到天然抗原位点肽的六个有效类似物，还用该肽库进行了结合抗生蛋白链菌素的研究，找到一些有结合作用的肽段。

（混分法示意图）

一珠一肽法的优点是可以同步合成大量的化合物，并可对多种受体进行筛选，但只适合于合成能微量测定的样品，如多肽和寡核苷酸，应用范围不广。

3编码确定结构的同步合成

编码确定结构的同步合成法在同步合成时，引入另一个容易合成且在合成后可以通过微量分析测定结构的分子，以该分子作为密码来确定与其同时合成的目标分子的结构。

Mikolaiev 等在1993年报道了Selectide编码合成方法，即在一个树脂上合成一个非肽类化合物或其它不可测序的化合物时，在其上合成一个作为编码用的多肽。

该法常用含多功能团的化合物如Lys等作为目标分子与编码分子的连接点，每一个氨基酸代表目标分子中的一个组成部分，在混合-分离合成法中，每安装一个构建模块，就向目标分子的编码臂上偶联一个代表该构建模块的氨基酸，合成并测定活性后，活性分子结构可以通过测定同一树脂珠上多肽的序列而给出。

药物的开发是一个耗时耗费的过程，据报道，一种新药从开始研制到上市，需8～10年的时间，研究费用高达2～5亿美元。药物的研制历程之所以这样长，很重要的原因是先导化合物的发现与优化速度缓慢。组合化学能够大大加快化合物库的合成及筛选速度，从而大大加快了新药的研制速度。

应用

1新材料的开发

十年来，已报道许多以组合化学方法开发的新材料，如抗磁材料、磷光材料、介电材料、铁电材料、半导体、催化剂、沸石和聚合物及复合材料等。

2催化剂筛选

催化剂传统的筛选法是试凑法，工作量大，效率不高。

科学家们用各种方法设计和建立了催化剂库，对催化剂进行快速筛选，已取得不少成果。

美国Purdue大学开发一种自动制备并检测沸石分子筛的系统，每个式样板有8～19个反应室（150-300微升），每次可同时试验六块板，产品用离心方法回收，最后形成的组合库用X-射线散射技术检测或用电子显微镜筛选，仅消耗很少试剂就取得很多数据。

由于催化反应是放热反应，有活性的催化剂可红外成相。Steven J.Taylor和James P.Morken利用红外热谱仪对载有3000多个潜在催化剂库的聚合物珠进行筛选，找出两个活性有机化合物作为亲核酰化的有效催化剂。

Wilhelm F.Maier 和助手组装了由37种氧化物组成的催化剂库，测定其在100℃对己烯-1氢化的催化活性，红外成相表明有四个点比衬底热，即表明这四个点有活性。活性与非活性点温差非常小，不到0.7℃，但像0.1℃的温差也能可靠地检测。

加州大学Selim M.Senkan教授发展了一基于激光的方法，以快速筛选环己烯脱氢成苯的固相催化剂库，筛选出由80%铂、10%钯和10%铟组成的三元混合物，比库中其他成员生成的苯多。66个成员库使用全自动装置制备，制备和筛选只需两天半时间。

3新药物的合成与筛选

迄今为止，组合化学最多的应用是新药物的设计、合成和筛选方面。R.F.Service在Science撰文，认为组合化学方法创制的新药将冲击21世纪的药物市场。美国及欧洲已涌现一批组合化学公司，杜邦制药公司的研究者将组合化学（随机设计，合理筛选）与合理药物设计（合理设计，随机筛选）两种不同的方法联用设计合成了新奇的胶原酶抑制剂，能够抑制引起癌转移和关节炎的胶原酶（Coll-agenases），这些工作有利于获得更加有效的抑制癌细胞转移和治疗关节炎的新药。

Beatrice Ruhland 以组合化学法，把同手性氨基酸衍生的胺键合到Tenta GelS树脂上，并与非手性烯酮和芳香醛或α，β-不饱和醛发生环加成反应合成了一些3-氨基-2-氮杂环丁酮--制备α-酰胺基-β-内酰胺，包括许多重要的抗生素的前体。发现该反应有很高的cis选择性，二种非对映体cis β-内酰胺比率为1:1到3:1。

1994年，Ellman小组应用多针同步合成系统二次共合成192种结构不同的1，4-苯并二氮杂卓衍生物，并测定了这些化合物对缩胆囊肽（CCK）A受体的结合作用。

Haskell-Luevano,C.等1999年报道以组合化学法固态合成951个化合物，这些化合物用显色生物试验在10μM测试，显示对MC1R分型的活性。选择其中二种重新合成、纯化和鉴定，一种鉴定结构为2的，对鼠的MC1R分型EC50为42.5μM，为进一步研究非肽杂环兴奋剂提供新的起点。

4新农药的合成和筛选

1962年，美国女作家蕾切尔·卡逊撰写《寂静的春天》一书，提出农药杀害野生动物、危害儿童健康、污染表土的问题，引起各国的关注。随后，一批高毒、高残留农药被禁用，并促使农药的研究和生产向提高原药固有的活性及其使用效率和效果，降低农药用量，提高农药对人、畜和作物的安全性，改善与环境的相容性，减少对非靶标生物和生态环境的负面影响的方向发展。

十年来，组合化学法结合高通量的筛选，大大加快农药研究开发的速度，如艾格福公司每年可合成5万个新化合物；诺华公司的筛选能力是每年10万个新化合物；捷利康公司1995～1997年，化合物的筛选能力从每年1万个提高到10万个，1998年为12万个，2000年为20万个。

John J.Parlow 利用分子反应活性的互补性/分子识别技术（CMR/R）平行合成具有除草活性的取代杂环酰胺化合物，生物试验结果表明化合物3有一定的除草活性。（反应式6-46 动画）

他们把3（结构式3）分成两部分。先对A部分的杂环进行改造，改变环上的原子和取代基，得到56个化合物，但生物试验表明它们的活性不如3大；接着对B部分进行改造，以不同的取代基取代苯环C或D的不同部位，得到68个化合物，生物试验表明化合物4（结构式4）的生物活性是3的4倍。

展望

21世纪是绿色化学的世纪。绿色化学要求将原子重新巧妙组合，实现零排放的原子经济反应，生产环境友好产品。所以，组合化学是实现绿色化学的必经之路。

正如中国军事医学研究所胡文祥所长在《广义组合化学》一文所指出的：任何成功的事情或事物都是巧妙的合理的组合。1234567七个音符可以组合成最美妙的音乐旋律，赤、橙、黄、绿、青、蓝、紫七色光可以组合成美丽的画卷和五彩缤纷的世界；喜、怒、哀、乐、悲、恐、惊七种感情可以组合成斑斓的人生。我们相信元素周期表上109种元素的巧妙组合，将为绿色化学、为美化地球环境谱写不朽的篇章。组合化学从一诞生起，便显示出强大的生命力，十余年来，在有机（包括药物）领域得到了蓬勃发展。21世纪的化学将更多地向生命、材料领域渗透，对于这个领域内的合成化学家来说，组合化学提供了一条新的化学合成思路。虽然还面临着诸如缺乏系统有效的平行检测手段等困难，但随着电脑技术和自动化水平的提高及新型检测仪器的研制，这些困难将逐步被解决。

作者：吉民 定价：&yen35.00 元

出版社：化学工业出版社 出版日期：2004年06月

ISBN：7-5025-5500-5 开本：16 开

类别：有机化学化工 页数：304 页

简介

本书从组合化学的角度出发，详细分析了合成策略，以此为基础着重介绍了固相组合和液相组合的合成方法、组合化学的筛选及低聚物的合成等内容。同时强调了组合化学在高通量筛选和新药发现中的作用，并且对组合化学的进展做了展望。

目录

第1章组合合成策略7

混合?裂分法7

树脂珠技术9

茶叶袋法10

平行合成法10

使用树脂珠的反应器械14

多中心合成法15

空间定位平行合成法15

混合试剂合成法16

参考文献16

第2章组合合成方法——固相组合合成18

载体19

树脂珠19

多针22

圆片24

薄片25

结合分子28

酸不稳定结合分子31

碱不稳定结合分子34

安全制动结合分子37

氨基甲酸酯结合分子38

硅结合分子/无痕迹结合分子40

光不稳定结合分子41

烯丙基官能团化结合分子42

多处可裂（多官能团）结合分子42

多中心结构库模板43

方酸44

经Baylis?Hillmann反应得到的模板45

2?溴乙酰基）吡咯作为模板51

用烯酮作为模板54

反应类型59

亲电和亲核取代反应60

取代反应63

杂环合成63

环加成反应66

缩合反应67

酰胺形成及相关反应69

及相关反应69

麦克尔加成69

烯烃形成69

氧化反应69

还原反应69

参考文献70

第3章组合合成方法——液相组合合成76

与固相组合合成相比较77

混合物的合成78

已用于液相组合化学的反应80

酰化反应80

胺的磺化80

脲、硫脲和氨基甲酸酯的制备81

烷化和加成反应81

还原胺化81

胺的芳基化81

经缩合反应形成碳?碳键81

钯催化的碳?碳键的形成81

氢化和还原81

多组分反应81

环化反应82

其他反应82

反应顺序83

纯化85

固相束缚试剂85

固相萃取86

液相萃取88

氟的合成89

在可溶性聚合物载体上的合成91

6树枝状载体93

高聚物试剂的使用94

参考文献95

第4章组合化学库的筛选97

混合物库97

在珠筛选法97

解缠绕法98

编码105

多处可裂的结合分子115

含单独化合物的库115

参考文献116

第5章组合化合物库的鉴定118

红外光谱法（IR)118

傅里叶?红外显微镜学118

衰减全反射光谱127

其他的红外光谱方法129

核磁共振法130

在珠分析法130

高分辨质子魔角旋转核磁共振133

3质谱138

组合化合物分析138

样品分析与纯化的高通量系统154

参考文献160

第6章组合合成的低聚物165

6?1类肽165

亚单体法165

单体合成法167

3拟肽物167

彻底烷基化多肽168

类肽169

低聚氨基甲酸酯169

磺酰肽和插烯磺酰氨肽170

聚?N?酰胺172

寡脲174

线性寡脲174

低聚环脲和环硫脲174

硫脲175

脲类肽175

含杂环低聚物175

聚甲基吡咯和咪唑175

含噻唑环和?唑环的多肽176

寡聚四氢呋喃176

聚异?唑啉177

寡聚噻吩177

含吡咯啉酮的低聚物177

其他合成低聚物178

反假肽178

插烯多肽179

氮杂化物和氮杂多肽179

多肽180

四取代氨基酸的多肽180

聚羟基化合物181

多肽核酸181

肽键在一个位置上的修饰182

硫代酰胺假肽182

酰胺键被还原的多肽182

羟基酰胺键的多肽183

羟乙胺肽键电子等排体184

参考文献184

第7章自动组合合成188

单个化合物的平行合成189

实验室制备效率189

实验室自动化设备190

分散型自动化系统191

中心控制和功能型多组分系统192

中心自动的样品导向多组分系统192

高通量纯化和分析193

自动纯化193

微反应系统简介194

参考文献195

第8章组合生物合成196

克隆生物合成功能基因簇196

遗传工程及新药研究197

1靶向基因失活197

单基因表达198

基因簇的表达202

合成起始单位变异203

酶亚基的重组装203

组合生物合成的应用212

寡糖类抗生素生物合成基因的运用212

其他来源基因的运用——地球上的新化合物212

对酶变换其底物特异性212

参考文献213

第9章用作化学传感器的分子接受器215

超分子识别部位215

大环肽类217

组合接受器库218

环肽作为化学传感器的超分子识别部位219

参考文献222

第10章高通量筛选与新药发现224

高通量药物筛选224

对高通量筛选的要求225

高通量药物筛选的组成226

化合物资源226

微反应系统227

筛选模型227

高灵敏度检测系统229

自动化操作系统230

数据采集传输处理系统231

高通量筛选的特点231

高通量药物筛选的过程232

高通量筛选系统简介233

虚拟筛选234

参考文献236

第11章催化反应的高通量实验238

1HTE技术用于催化反应238

库设计和试验策略240

合成方法242

测试方法243

多路径反应器244

参考文献246

第12章计算机辅助化合物库设计247

化合物库设计理论248

相似性原则249

分子描述250

二维指纹250

三点药效团251

其他描述251

分子相似性方法252

亲和力指纹252

特征树253

碎片的自动化结构重合254

描述有效性研究254

和3D描述的对比254

随机设计和合理化设计的比较255

三点药效团和2D指纹比较256

局部相似——相似性半径256

化合物选择技巧257

设计组合化合物库258

参考文献262

第13章组合化学进展264

丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶抑制剂265

真菌I型蛋白香叶基转移酶（GGTase?1）抑制剂267

KDR受体酪氨酸激酶抑制剂268

自动形成靶向化合物库设计270

优先GPCR配体272

拮抗剂274

胺的合成277

多样性导向合成280

Katritsky苯并三唑固相合成法283

多组分缩合285