质粒DNA的小量制备 注意哪些操作 为什么
质粒DNA的小量制备注意事项：
如有必要，在酶切反应液中加人1 μl 10 mg/ml RNA酶溶液（不含DNA酶）以去除污染的RNA。
在使用前,在溶液Ⅳ（洗涤液）加入40ml无水乙醇,然后在瓶盖上作好记号。
溶液Ⅱ（lysis buffer）在温度较低时，可能会产生沉淀,需先用水浴加热溶解，混匀后再使用.溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化，用完后应立即盖紧瓶盖。
最后加水溶解质粒时，可先将水加热,提高溶解度。
质粒DNA的小量制备的步骤：
细菌的收获：将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液。上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。必要时可以离心2次。
将细菌沉淀重悬于150μl用冰预冷的溶液I中，加入1/50体积RNAseA贮存液，剧烈振荡，使之完全分散。
溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)
不含dna酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分装贮存
注：（1）溶液I高压蒸气灭菌后，贮存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于储存；但提取大于15kb的质粒，应将细菌悬于等渗蔗糖溶液中，并用溶菌酶处理；（3）务必使细菌沉淀完全分散，以利于碱液作用充分；（4）震荡时可以在离心管中加入牙签或枪头，提高效率；（5）配制RNaseA贮存液时，煮沸时间不宜过长或过短；（6）溶液I每2个月重新配制1次。
加200μl溶液Ⅱ，颠倒混匀。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS
注：（1）若菌体裂解得充分，则溶液会变得很粘稠；（2）不要剧烈震荡，否则会混入基因组DNA；（3）每2个月重新配制1次。
加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻微震荡混匀
溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml
注：（1）所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）尽量不要有大的块状沉淀，以利于下步离心；（3）每1个月重新配制1次，并分装贮存于小口瓶中。
12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈震荡混匀。
12000g离心5分种，将上层液体转移到另一离心管中。
注：为了保证不吸出下层液体，可以先离心30秒，然后将上层与少量下层液体吸至另一离心管，离心5分种，再转移上层液体。切勿混入下层液体。
加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。12000g离心5~10分钟，小心吸去上清液。
注：（1）沉淀即为质粒DNA；（2）为确保质粒完全沉淀，异丙醇的体积可以适当加大至62~65%。
0.8ml70%乙醇洗涤DNA沉淀后，小心地吸去上清。在空气中静置3~10分钟，待沉淀干燥后，溶解于50μl高压灭菌的水中。
注：为洗涤充分，可以洗2次。
取1~2μl样品测定紫外吸光度，对所得质粒进行定量并了解其纯度，或取1~2μl样品进行琼脂糖电泳，估计其纯度和得率。
碱裂解法是提取质粒的最常用也最有效的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异达到分离目的。
原理:高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。
方法:依次加入下面三种溶液:
溶液1:
葡萄糖
50
mmol/L，EDTA
100
mmol/L，Tris-Cl
25
mmol/L,溶菌酶5mg/ml,pH
8.0
溶液2:
NaOH
0.2
mol/L，SDS
1%
溶液3:
5
mol/L
KAc
60
ml，冰乙酸
11.5
ml，重蒸水
28.5
ml
其中溶液1作用主要是悬浮菌体，溶液2作用是裂解菌体，释放胞内物质，溶液3是沉淀染色体DNA
一、实验目的
1、了解动物细胞染色体制片的原理。
2、学习蛙骨髓细胞染色体制片的方法。
3、观察蛙染色体的数目和形态。
二、实验原理
小型动物染色体制片最好、最有效的材料就是骨髓组织。在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，可直接得到中期细胞。为提高有丝分裂指数，实验前，于动物腹腔内注射一定量的秋水仙素溶液，取骨髓后，经低渗处理、固定、滴片、空气干燥后即可获得良好的中期分裂相。
三、实验材料、
蛙类
四、器具及药品
注射器，离心管、解剖器、离心机，冰箱、电子天平，显微镜，搪瓷缸，载玻片，烧杯，滴管，秋水仙素，KCl，甲醇、冰乙酸，乙醇。
五、实验步骤
一离心法（适合于个体大的蛙）
1、前处理
目的：改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤体的形成，使染色体缩短和分散，获得较多中期分裂相。
实验前8-20小时，将蛙称重，按每克体重10-40ug的剂量（无尾类10-20ug，有尾类30-40ug）经腹腔注射秋水仙素溶液，秋水仙素溶液浓度100-1000ug/ml，按蛙大小来配。
2、取骨髓细胞
将蛙麻醉，用手术剪剥开腹腔，取下四肢骨，剔净肌肉，放到盛有0.046mol/l的KCl的小烧杯中洗一下，用镊子夹出来，剪掉两端关节，将装有0.046mol/l的KCl的注射器从骨一头插入，冲骨髓细胞于干净的离心管内，反复冲洗几次，直到骨变白为止。注意这一过程不要让组织块掉入离心管。
3、低渗处理
目的：使细胞吸水膨胀，细胞膜易破裂，有助于染色体的分散。
当骨髓细胞全部冲入离心管后，开始计时，即低渗开始。室温下低渗处理30-40分钟，在此过程中，要用吸管反复吹打。
另外取预先洗净的载玻片放入盛有蒸馏水的搪瓷缸中，置冰箱中冰冻。
4、固定
目的：尽快杀死细胞，使细胞尽可能保持原有的状况，并且还可以去掉细胞质。
将离心管两两平衡后，对称放入离心机内，以1000转/分离心10分钟，轻轻取出，弃上清液，沿管壁缓慢加入现配卡诺氏固定液6ml左右，并用吸管吹散细胞团，固定30分钟，平衡后再离心，弃上清液，加卡诺氏固定液进行第二次固定。
注意，固定液要现配，每次离心前都要平衡，离心的时间、速度均同第一次。由于每离心一次，细胞要损失30％左右，因此对个体小的蛙第二次固定也可省去，但固定次数少，细胞质不易去掉，影响效果，固定次数多，离心后细胞损失多。这一茅盾的解决有待多次实验的摸索，原则上大型蛙可固定2-3次，小型蛙1次。
