苯酚提取核酸，上清液少是为什么

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。

缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。

将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。

溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；

除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止；

沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95％冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀；

溶解：将沉淀物用0.1mol/L NaOH约10毫升溶解,得DNA溶液。

溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？ 加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳

苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用

抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？

酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

苯酚：氯仿：异戊醇为什么要25:24:1？

抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

使用苯酚抽提细胞 DNA 时,苯酚的作用是使蛋白质变性,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而 DNA 溶于水相.

氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组 DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡 产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.

细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。

本实验采用的0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。

核酸检测有四种方式：

1、口咽拭子检测：通过口腔进入的方法采集口咽部标本，用灭菌棉拭子擦拭咽侧壁及咽后壁数次。做咽拭子之前，不要使用抗菌药物，采样前30分钟内请勿吸烟，喝酒，不吃口香糖等刺激性食物。

2、鼻咽拭子检测：通过鼻孔进入的方式采集鼻咽部标本，将拭子以垂直标方向插入鼻孔，拭子顶端到达鼻咽腔后壁时停留约15秒，轻旋3次。取样者可在侧方采样，暴露的风险较低。

3、深咳痰液检测：患者深咳后，将咳出的痰液收集在标本容器内。目前深咳痰液的检出率高于口咽拭子和鼻咽拭子。

4、肛拭子检测：用拭子插入肛门里面2-3cm，然后旋转四到五圈之后，拔出即可。整个过程大概10秒钟左右，不会有太大的不适感。反而相较于鼻咽拭子舒适度更高。

核酸检测的方法，有定磷法、定糖法、紫外线吸收法和荧光检测法。具体如下：

一、定磷法简单快捷，且灵敏度高，缺点是易受蛋白质和核苷酸影响；

二、定糖法灵敏度也高，但特异性差，且戊糖容易与其他物质产生反应，干扰结果；

三、紫外线吸收法适用于浓度大的核酸溶液，通常人体感染新型冠状病毒后，咽部所含的病毒量极少，所以一般不用此种方法检测；

四、荧光法是目前广泛被使用的检测法，对标本逆转录扩增，使病毒片段达到一定检测数量后进行检测，缺点是由于受采样标本、运输等多种因素影响，可能出现假阴性

组织抽提前应保存于液氮中，以免DNA受到破坏；纯化时应时刻注意抑制核酸酶的污染，使用EDTA等防止DNA降解。

剧烈振荡可使DNA断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢地颠倒混匀。

要获得高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。

DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有吸收峰。当纯度比值小于1.6时，应考虑进行再次纯化。

整个实验须接触多种有毒、有腐蚀性试剂，故应注意操作规范安全。

可以60℃下水浴加热成液体，先配置80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

配置方法:将装有苯酚的试剂瓶放在40~50度的水浴中，待苯酚融化有液体生成，然后乘热用滴管吸出滴在放置在天平上并去皮的烧杯中，称取一定质量的苯酚，然后加入一定体积的水，混匀即可。

扩展资料

苯酚的危害：

1、苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。急性中毒：吸入高浓度蒸气可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。

2、环境危害：对环境有严重危害，对水体和大气可造成污染。

3、燃爆危险：该品可燃，高毒，具强腐蚀性，可致人体灼伤

参考资料来源：百度百科—苯酚

0.01-0.1mol/l。苯酚标准溶液的摩尔浓度是0.01-0.1mol/l。苯酚有弱酸性,与碱作用生成盐,遇三氯化铁溶液显蓝色。煤焦油曾是苯酚的主要来源,可用氢氧化钠溶液从中提取。随着工业发展,天然产品已供不应求,到20世纪30年代,合成苯酚的产量已超过天然产品。

？？不是只用TRIZOL,氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNase-free water就行了吗？还要用苯酚吗？djrhewc(站内联系TA)我们好像也没用到...linxi8579(站内联系TA)我们提RNA是用的试剂盒，好像里面也没有苯酚。就是有裂解液，洗脱液，漂洗液等等，问起来好像没有。我记得的具体的就是用乙醇来沉淀，还有用RNAse-free水溶解。gastrodia(站内联系TA)NaAc饱和酚，pH4.5，酸性环境是抽提RNA必须的，过酸又会导致RNA酸水解，使用酸酚抽提，在加入氯仿涡旋后离心，RNA处于微酸性的水相，DNA和蛋白质被压在两相之间（如果两相你都不知道，那基础太差，找本分子克隆来see吧），如果上层水相呈碱性，DNA会混在RNA之间erictan2046(站内联系TA)谢谢各位虫友，原来！我之前用的苯酚是pH7.8~8.0提取DNA的，原本以为这样没有差别，但是这点就出错了！我老是做来做去做不出东西来！还真的不知道呀！