硫酸苯酚法测多糖有什么要特别注意吗
苯酚硫酸法测定多糖需要注意：①、试管要洗干净，苯酚硫酸法很灵敏，试管没有刷干净会有很大影响。②、操作手法一致，尤其是硫酸加入的方式和速度，要尽量一致。建议用移液管移取，直接松开按住上面的手指，让其自行流下。最后加入硫酸后，立即摇匀和隔段时间摇匀，室温和冰浴，这些都不是造成平行样不平行的原因，只要处理样品方法是一样的，切勿一个样一种方法。③加硫酸必须要快，建议用5mL的移液枪，另外样品的稀释浓度要合理。⑤药品要求：A、
浓硫酸：分析纯,95.5%
B、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。C、
6%苯酚：临用前以80%苯酚配制.（每次测定均需现配）D、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。E、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。F、
5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。G、
6mol/L
氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。H、6mol/L
盐酸。⑥酚要4℃冰箱保存，拿出来到室温后用，加浓硫酸后一定要摇匀，水浴温度和时间尽量一致，冷水冲凉的时间也尽量一致，试样温度不一样对吸光度也有影响，还有可以的话样品和标曲同时做，误差就小了。
1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2．样品含量测定：
①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5%TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5%TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。
②离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。）
③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
④定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。
（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
原理
多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物.再以比色法测定.
试剂
1． 浓硫酸：分析纯,95.5%
2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存.
3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制.（每次测定均需现配）
4． 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖.
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存.
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存.
7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水.
8． 6mol/L 盐酸
苯酚硫酸法测多糖含量步骤如下：
1、目的要求：测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量。
2、方法原理：糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。
3、主要实验仪器及材料：浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
注意：
（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
你可以用一个棕色的试剂瓶把自己配好的苯酚在4℃冰箱冷藏保管，紫外分光光度法测定糖含量的时候从仪器打开的那一刻到你所有多糖样品测定完，到关闭仪器，这一个过程你只需要做一个标曲。当下一次重新开机测定的时候你就要继续重新做一个标曲了，因为系统也是有误差的。
这个方法测定糖含量的时候 你也会发现 第一天和第二天同一台仪器同样的人同样的方法做出的标曲吸光值是不太一样的。所以每一批都要做标曲的。
而苯酚对你的实验影响不大，避光冷藏不会变质这样你的试剂误差其实更小，这个方法关键是系统误差比较严重。还有R2做出三个9相当牛了的 一般做因素分析实验时候 没有必要一味的追求3个9 有时候2个9 也能说明问题了的。
多糖的多变性很严重，你最好每个样品多测几次，当三个值都差不多时取均值来算。还有记得一定摇匀了，测定在转移到比色皿的时候也要注意岩壁慢慢倒入，小心气泡引入前后测定值差异大。最好祝你实验顺利。希望对你有帮助
制备苯酚制剂的目的，就是因为苯酚的纯度对实验影响很大，不得已而为之。
如果限于实验室条件不能进行高温蒸馏，那么建议你采用蒽酮硫酸法测定多糖，很可能比NDS测定方法重现性还好，但需注意一点：蒽酮剧毒！所以一般用的都是NDS方法，虽然麻烦一些。
