乙醇沉淀法沉淀DNA加入氯化钠和醋酸钠的区别

沉淀DNA时，用到的醋酸铵溶液pH在8左右，略微碱性。

DNA的沉淀：

采用无水乙醇沉淀DNA是实验室的常用方法。

在DNA溶液中，DNA分子与水分子呈水合状态，当加入乙醇后，乙醇可以夺去DNA分子周围的水，从而使得DNA分子失水而易于聚合。 乙醇的优点是可以任意比和水融合，而且不会和DNA发生化学反应，DNA分子在乙醇中能够稳定保存，因此可以作为沉淀DNA的良好试剂。

一般用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA,使乙醇最终含量为67%左右（关键）。当沉淀RNA时一般用2.5倍的体积。因此也可以用95%的乙醇等代替，但是此时终体积将会较大，且DNA在溶液中会有一定的损耗。因此当多次沉淀时，做好采取折中的方法，即初次用95%的乙醇沉淀后，之后采用无水乙醇代替。

另外也可以用0.6倍体积的异丙醇（IPA）沉淀。与乙醇相比，异丙醇比较疏水，极性较弱，因此盐离子会与DNA分子共沉淀，不利于去盐，但却因此可以去除蛋白质、糖等杂质（高浓度的盐可以使糖存在于溶液中从而去除）。而乙醇可以有效去除盐离子。另外，乙醇易挥发，所以通常会先用异丙醇沉淀，再用乙醇多次洗去盐。

沉淀时间一般是15-30分钟即可。

沉淀过程中一般会加入醋酸钠或氯化钠，因为在pH为8时，DNA分子带负电荷，盐释放的正电荷可以与其反应，从而促进其聚合沉淀。当然盐离子浓度也不可太高，否会影响后续反应，如酶切等，故得多次脱盐。

乙醇精制的步骤,仅供参考 1.加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇,然后在加入10分之一体积的醋酸钠(PH5.2,3M)或者醋酸氨 2.混合均匀,零下80度15分钟或者零下20度30分钟 3.14000RPM,低温(一般指4度),离心15分钟 4.弃上清,加入500-600微升的70%的乙醇 5.14000RPM,低温(一般指4度),离心5分钟 6,弃上清,充分晾干,将残留的乙醇充分除净 7.根据起始的DNA的量,加入灭菌水或者TE 8.电泳定量备用我一般是将无水乙醇和70%的乙醇均放到零下20度保存,但我也做过实验,使用室温的乙醇也可以

如果DNA的量很大,醋酸钠和氯化钠是不必要的.它们的作用就是增强沉淀,纯化极少量的DNA时,它们就起很大的作用了. 要使用什么样的盐沉淀,要看下一步做什么了.

其实沉淀用的乙醇都可以使用室温的, 分子克隆上就写到了, 我用的效果也的确如此. 很多抽提DNA,RNA的KIT的PROTOCOL上也是这么用的 但大家好象都习惯用预冷的了, 也没什么坏处. 阳离子的存在是为了中和DNA上磷酸基团的负电荷, 以便于其沉淀.

通常的方法是1/10的醋酸钠＋2.5倍的无水乙醇。

所以，最后是70％的乙醇，不是无水的。。。

钠离子会在磷酸骨架周围形成离子层，而这种稳定的DNA在70％的乙醇中溶解度很小，形成DNA沉淀。

然后再用70％乙醇洗一下就好了。

纯化DNA的常用方法是用酚抽提-乙醇沉淀法，适用于普通实验室操作。它通过交替使用苯酚、氯仿两种不同的蛋白质变性剂，可以增加去除蛋白质杂质的效果；氯仿可以去除核酸溶液中的微量酚，还可以加快有机相与液相混合，去除色素和蔗糖；在氯仿中加入少量的异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

【实验材料】

待纯化的DNA溶液。

【实验仪器】

高压灭菌锅，涡旋混匀器，台式高速冷冻离心机

【试剂配制】

1、Tris饱和酚（pH8.0）：氯仿：异戊醇混合液

酚：氯仿：异戊醇按体积比25：24：1配制，现配现用。

2、氯仿：异戊醇混合液

氯仿：异戊醇按体积比24：1配制，现配现用。

3、醋酸钠溶液

配制3 mol／L的醋酸钠溶液，调节pH值至5.2。

4、TE缓冲液

10 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），1 mmol／LEDTA（pH 8.0），配制完成后高压灭菌，4 ℃保存。

【实验步骤】

1、在待纯化的DNA溶液中加等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液，然后在涡旋混匀器上充分混匀。

2、将混合物12000 r／min离心10 min后，移取上层含DNA的水相到另一离心管中。如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则需要重新抽提水相，直到两相交界处无明显沉淀物。

3、向上层水相中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）混合液，在涡旋混匀器上充分混匀后12000 r／min离心10 min。

4、移取上层含DNA的水相到另一离心管中，加1／10体积的醋酸钠溶液，充分混匀，再向管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀，于-20 ℃保存30 min。

5、12000 r/min离心5 min，弃上清液；75%的乙醇12000 r/min离心洗涤5 min，弃上清液；用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥10-15 min（不要等DNA沉淀完全干燥，否则DNA不易溶解）。

~ 1 / 2 ~

6、在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液，溶解后在-20 ℃以下长期保存。

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl

或

NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

1

快速微量提取法

a.取1.5ml菌体培养物于一灭菌ep管中，12000rpm离心1min,

丢去上清夜，收集菌体。

b.加入400ul裂解液（40mmtris-醋酸，20mm醋酸钠,1mmedta,1%sds,ph7.8）混匀,置于37oc水浴1hr。

c.然后加入200ul5mol/l的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。

d.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

e.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3m

,ph8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulte溶液中，置4oc保存备用。

2

蛋白酶/sds法制备

先用10ml含适当抗生素的gbm过夜培养delftia

sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用washing

te（50mmol/ltris-hcl

ph8.0,10mmol/ledta

ph8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml

1×te缓冲液中，先后加入0.5ml

5mg/l的蛋白酶、0.5ml

10%

sds，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀dna，用自动移液器吸管头将絮状dna沉淀块吸附到ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×te或ddh2o中。

3

1)

细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。

2)

细菌收集：取1ml培养物于1.5ml

ep管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml

te（ph8.0）中（用ddh2o也行)。

3)

菌体裂解：加入6μl

50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/lnacl50μl，10%sds

110μl，20mg/ml的蛋白酶k

3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）

4)

抽提：菌液均分到两个1.5ml

ep管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）

5)

沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1

2000rpm离心10min。

6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。

7)

抽（凉）干后，溶于50μl

ddh2o中，取2-5μl电泳。作pcr模板用。

乙醇沉淀DNA的原理是当乙醇比例大于60%时，乙醇和DNA竞争性的争夺水分子，破坏了核酸表面的水膜，使核酸沉淀下来。所以你加了1ml的乙酸钠－EDTA后，总的水体积变了，然后你再按原体积加2倍体积的原乙醇，乙醇的比例不够自然不会有沉淀。