RNA 变性PAGE的配制方法

多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）

双向电泳实验过程及相关溶液配置

A． 实验过程

一、 实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、 实验步骤：

1. 样品的溶解

取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。

2. Bradford法测蛋白含量

取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：

编号 蛋白量（ul） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595值

1 0 80 4 0

2 5 75 4 0.024

3 10 70 4 0.061

4 15 65 4 0.091

5 20 60 4 0.116

Bt4 2 78 4 0.079

Bt4 4 76 4

转Bt4 2 78 4 0.075

转Bt4 4 76 4

标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数据可知

相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得

OD值测量过程：

比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。

3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）

3.1 水化液的制备

称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。

在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul， 振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。

3.2 点样，上胶

分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开ImmobilineDryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。

3.3IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20oC）

S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)

S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)

S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)

S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)

S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共计44110vhs, 19.5小时

其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦

3.4 平衡

用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。

平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。

4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE

4.1 配胶(两根胶条所用剂量)

分离胶：（T=8%80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED

30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml

分离胶buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul

双蒸水 38.72ml

浓缩胶：（T=4.8% 10ml）

30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml

浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul

双蒸水 5.9ml

4.2 灌胶

将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。

4.3 转移

剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。

4.4 跑胶

浓缩胶13mA 分离胶20mA 共约5.5个小时

5. 银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水）

5.1固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超纯水定容至500ml

5.2敏化 30min 无水乙醇 150ml

Na2S2O3?5H2O1.5688g

无水乙酸钠 34g

先用水溶解Na2S2O3?5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml

5.3洗涤 5min×3次

5.4银染 20min AgNO3 1.25g 用超纯水定容至500ml

5.5洗涤 1min×2次

5.6显影 无水Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至500ml

甲醛(37%)0.1ml, 临时加

5.7终止 10min EDTA—Na2?2H2O7.3g用超纯水定容至500ml

5.8洗涤 5min×3次

注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。

B． 实验相关试剂配制

1． Bradford 工作液

95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷

85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶

考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效）

2． 裂解液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

DTT 60 mM

Tris—base 40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）

3. 水化液储液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

Tris—base 40 mM

4. 分离胶buffer (pH8.8) 250ml

SDS 0.4% 1g

Tris—HCl 1.5M 45.4275g

5. 浓缩胶buffer (pH6.8) 100ml

SDS 0.4% 0.4g

Tris—HCl 0.5M 6.07g

6. 凝胶储存液（30%的丙烯酰胺） 250ml

Acr 29.2% 73g

Bis 0.8% 2g

7. 电极缓冲液（跑一次要配制2500ml）

甘氨酸 43.2g 36g

Tris 9g 或 7.5g

SDS 3g 2.5g

超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml

8． 0.5M Tris —HCl pH 6.8储液

6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml，3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml

9． 平衡液储液

脲（即尿素） 36g

甘油 30% 30ml

SDS 1% 1g

0.5M Tris—HCl pH6.810ml 超纯水定容至100ml

10. 平衡液A（一根胶条）

DTT 20mg

平衡液储液 10ml

11．平衡液B（一根胶条）

碘乙酰氨 300mg

平衡液储液 10ml

0.05%溴酚兰 15ul (平衡液A、B均需临时配制)

12．0.5%琼脂糖10ml

琼脂糖 0.05g

电极缓冲液 10ml

溴酚兰 25ul

补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4OC备用。

C． 药品

CHAPS 兼性离子去垢剂 去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，

SDS 离子型去垢剂 提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出

尿素 离液剂 可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质

硫脲 离液剂 变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可

以大大增加蛋白质的溶解性

DTT 还原剂 断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度，由于它pKa在8左右，因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀

BSA Bradford中制作标准曲线用

无水乙醇 和磷酸一起，提供Bradford中的环境

磷酸 提供Bradford中的酸性环境

Tris 构成缓冲液的成分，可用于抗衡pH的变化

IPG buffer

覆盖液 即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。

丙烯酰胺（Acr） 以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂，

甲叉二丙烯酰胺 （Bis） 在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维网状结构

琼脂糖

溴酚兰 指示剂作用

碘乙酰氨（IAA） 平衡液B中使用，中和A液中的DTT

正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶

甘油 无机盐的良好溶剂，热稳定性好

Marker

考马斯亮兰G250（Bradford法用） 考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465~595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色 深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量

甘氨酸 与Tris构成缓冲系统

AgNO3

EDTA 金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程

第一节 细胞DNA、RNA的分离鉴定技术

一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定

人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA，可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的DNA还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。

(一)DNA提取方法：

(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。

(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。

(3)50℃水浴2小时，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3分钟。

12000r/min离心15分钟（室温）

(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质

12000 r/min离心15分钟（室温）

(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次

(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀

12000 r/min离心15分钟（室温）

(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时

12000 r/min离心15分钟（室温）

(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。

(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。

(10)加入蛋白酶K至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入Nace至终浓度10mmol/L。

(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。

(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。

(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1小时。

(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。

(二)DNA纯度检测及含量计算

DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.75.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。

取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8

OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。

DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)

DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。

二、培养细胞总RNA的提取及鉴定

细胞中含有三类RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的mRNA的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的mRNA的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。

提取细胞总RNA的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总RNA，也可从总RNA中提取mRNA，从而分析mRNA表达量，建立cDNA文库，以及对mRNA的调控和进行反义RNA研究。

变性液：7mol/L盐酸胍，25m mol/L棕檬酸钠pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巯基乙醇。

水平衡酚：在饱和酚中加入等体积DEPC处理的三蒸水(或新鲜无菌的三蒸水)混匀后去除水相，再重复处理二次即可。

所用玻璃、塑料制品、金属器材可用0.1% DEPC水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用180℃干烤6小时，以去除被污染的RNA酶。

(一)总RNA的提取方法：

1、消化收集细胞方法同前。

2、向离心管中的细胞沉淀物中加1.5mL变性液，立即充分混匀。

3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸钠PH4.0、以及0.05mL氯仿，剧烈振荡混匀30秒后，立即置冰上放置15分钟，4℃ 12000r/min离心15分钟。

4、取水相，加入等体积酚/氯仿(1:1)混匀，剧烈振荡10分钟，4℃12000rpm离心15分钟。

5、取水相，加入等体积氯仿，剧烈振荡10分钟，再同上离心，再如此反复抽提一次后取水相，加入等体积的预冷的异丙醇(或异戊醇)混匀，低温放置20分钟，再同上离心。

6、取沉淀用70%预冷乙醇洗两次，干燥10分钟，溶于DEPC处理的三蒸水中以溶解RNA，分装,-20℃冻存。

(二)总RNA的鉴定及含量计算

1、RNA纯度及含量测定

取少量提取的RNA，经紫外线扫描，吸收峰位于波长260nm处，RNA纯度为OD260/OD280=1.8～2。

OD260值为1的RNA溶液约含有40μg/mL，故RNA浓度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀释倍数。

2、RNA分子量大小鉴定

2.1 配液：

(1)10×MOPS电泳缓冲液配制

将41.2g[2-(N-玛琳代)丙磺碱，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶于800mL经DEPC处理的50mmol/L乙酸钠液中，用2mol/L NaoH调整pH至7.0，加入20mL经DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加经DEPC处理的水至总体积为1000mL过滤除菌，避光室温保存。

(2)甲醛加样缓冲液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青FF、

50%甘油

2.2 操作步骤：

(1)制平板胶：1.2%琼脂糖煮沸，冷却至60℃，加入10×MOPS缓冲液及甲醛溶液，使三者的比例为3.5:1.1:1，或三者的终浓度分别为1.2%、1及10%，于室温放置30分钟或更长时间，使胶凝固。

(2)在无菌离心管中混合下列液体。

RNA(最多30μg) 4.5uL

10×MOPS电泳缓冲液 1.0uL

甲醛 3.5uL

65℃温育15分钟，水浴冷却、离心

(3)加入2ul DEPC处理的加样缓冲液上样，进行电泳，5V/cm电压，3小时直到溴酚兰至胶的中部，可用已知RNA标本作分子量标准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。

(4)电泳完毕，取出凝胶，浸泡在溴化乙锭溶液中(终浓度0.5g/L)染色30～45分钟，紫外透射仪观察分子量大小。

第二节 核酸蛋白转移电泳及杂交

一、DNA Southern Blot及杂交

本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。

(一)样品DNA内切酶水解

限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37℃ 1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。

1、配液：10×限制性酶消化缓冲液

10×buffer O—无盐：100mmol/L Tris HCL pH7.4

1mg/mL BSA

100mmoL/L MgCL2

10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)

10×bnffer L—低盐：缓冲液O

0.5mol/L Nacl

10×bnffer H—高盐：缓冲液O

1.0mol/L Nacl

2、操作步骤：

(1)将DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入适量H2O总体积为18μL，混匀。

(2)加入2mL 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。

(3)加1～2U限制性内切酶充分混合。

(4)37℃温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。

(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使达到终浓度为10mmol/L终止反应。

(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。

(二)Southern Blot及杂交。

将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。

1、配液：

(1)变性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH

(2)中和溶液：200mL 20×SSC

100mL 1mol/L HCL

100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。

(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaoH调pH至7.0加水至1000ml，高压消毒灭菌。

(4)预杂交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4

125mL 20×SSC

25mL100×Denhardt'S溶液

5mL 5mg/mL鱼精DNA

250mL 100%去离子甲酰胺

82.5mL H2O(总体积为500mL)

(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)

10g聚乙烯吡咯烷硐

10g牛血清白蛋白(组分V)

加H2O至500ml

2、操作步骤(如图20-1)：

图20-1 Southern Blot装置图

(1)内切酶消化的DNA，总体积为50uL，加入10uL加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。

(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。

(3)将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动：

500mL 0.2mol/L HCL 10分钟，水洗若干次

500mL变性液中浸泡15分钟×2

500mL中和溶液浸泡30分钟。

(4)剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶3mm。

(5)剪3～5层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长30～40cm，在一盘中加入数百毫升20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。

(6)逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移24～36小时

(7)取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入2×SSC中5分钟，用滤纸吸干,80℃烘烤2小时。

(8)将该转移膜放在塑料袋中，加入6～10mL预杂交液，排出气泡，封口，42℃ 3小时或过夜。

(9)将标记的DNA探针煮沸5分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为5×105 CPM/ML。

(10)倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42℃ 6h或过夜。

(11)取出转移膜，按以下条件洗膜

1×SSC，0.1%SDS室温2×15分钟

0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分钟，气中干燥。

(12)将杂交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自显影2～7天，-70℃。

(13)X片显影、定影，然后读片

结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。

二、RNA Northern Blot及杂交

此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行DNA-RNA杂交，此法是研究RNA(特别是mRNA)的主要方法之一，可测量RNA的含量和大小。

1、配液：Northern 预杂交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4

125mL 20×SSC

25mL100×Danhardt's液

5mL 5mg/mL 鱼精DNA

250mL 100%去离子甲酰胺

加H2O 至500mL-20℃贮存

Northern 杂交液：500mL预杂交液加入标记探针及10%磷酸葡聚糖。

2、操作步骤：

(1)RNA变性电泳方法同前

(2)待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于500mL 10×SSC中浸泡45分钟，轻轻摇动。

(3)测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为①横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至20×SSC溶液；②胶；③硝酸纤维素滤膜；④亲和层吸纸；⑤吸水纸；⑥重物、转移4～6小时。

(4)取出滤膜80℃烘烤2小时。

(5)用6～10mL Northern预杂交液，42℃预杂交过夜。

(6)将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入6～10mL Northern杂交液。

(7)去除预杂交液，加入含探针的杂交液，42℃，杂交过夜。

(8)按下列条件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟

0.25×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟

(9)曝光于X光片暗盒中放射自显影1天。显影，定影，根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序，也可测含量。

三、蛋白Western Blot及分析

此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。

1、配液：

(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH8.0

150mmol/L 甘氨酸

加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL

甲醇，加水至6L

(2)丽春红S溶液：0.5%丽春红S

1%乙酸

2、操作步骤（如图20-2）：

图20-2 Western Blot装置图

(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。

(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。

(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。

(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。

(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4小时或过夜。

(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。

(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。

(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。

(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。

(10)将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。

结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小，而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量。

第三节 细胞的原位杂交技术

原位杂交(ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，此方法原理是由DNA或RNA的序列与互补的标记单链DNA/RNA探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。

一、探针的制备原则和选择

探针为RNA或双链、单链DNA，双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性，降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组DNA杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。

探针的获得常采用随机引物延伸法的PCR合成和扩增，可获大量的DNA探针，或利用带有噬菌体强启动子多克隆位点的质粒载体来合成RMA探针，也可利用质粒菌扩增质粒，经酶切后纯化的基因片断，均可以获得制备探针原料。这些探针可以用同位素标记，也可以用非同位素标记，即光敏生物标记或地高辛配基标记于脱氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通过随机引物或缺口平移法与探针的核酸分子相连，构成地高辛一配基标记的核酸探针。比探针可用抗地高辛抗体偶联酶或荧光素通过松体结合和底物显色或产生荧光来检测。

这些探针基本均有市售，无需自行制备，只要根据说明书使用即可。

二、载玻片和盖玻片预处理

为了防止探针的非特异贴附而保证细胞粘附而需处理：

1、用于检测RNA的载玻片的处理

(1)用0.1mol/L HCL洗载玻片20分钟，再用无水乙醇洗数次使其干燥。

(2)在下列溶液中，65℃处理2小时

3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。

(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分钟，180℃烘烤2小时。

2、用于检测DNA的载玻片的处理

以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂载玻片。

3、对于盖玻片：于0.1mol/L HCL中浸泡20分钟，用无水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小时。

三、组织细胞固定

理想的细胞固定过程应该保护细胞形态，同时确保目的基因DNA或RNA序列暴露。对于RNA-RNA原位杂交有效的固定剂是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸缓冲液PBS、赖氨酸、过碘酸盐及重酪酸盐）。

1、涂片细胞原位杂交固定

(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗涤细胞，于0.1%胰蛋白酶消化，收获细胞计数，涂载玻片上。

(2)若检测RNA，固定于4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分钟，PBS洗5分钟，系列乙醇脱水干燥，-20℃保存。

(3)若检测DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小时，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟，浸泡在下述溶液中2×5分钟：

0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟。

(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃处理10分钟，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。

(5)在20%(v/v)乙酸中40℃处理15分钟，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。

注意：对于DNA-DNA原位杂交多聚甲醛或福尔马林均可，但对于地高辛检测法必须用4%多聚甲醛，固定至少16小时，而且用蛋白酶K处理，这样可明显减少背景染色。

四、原位杂交

原位杂交与盐浓度、温度、甲酰胺浓度、pH等有关，DNA复性的温度是16～32℃，DNA-RNA原位杂交，25℃最佳，RNA-DNA杂交，可用较高温度，在pH5～9范围内复性率基本上与pH无关。最好选用温和的碱性条件。甲酰胺有机溶剂可降低双链核酸的稳定性，可避免杂交过程中处于过高的温度，防止高温破坏组织。

(一)同位素标记DNA探针的原位杂交

同位素标记的DNA探针，敏感性高，但要注意非特异结合，如35S标记探针在杂交前，用未经标记的dUTP预杂交，可减少非特异，可获较好的细胞内定位，此外还常用3H或125I标记探针，但3H放射线弱，自显影需100天曝光，不太理想，方法如下：

(1)取已形成单层的细胞的盖玻片，悬浮细胞可采用离心法，将细胞粘附到涂有明胶的载玻片上。组织印片，冰冻切片等标本。

(2)将标本浸入甲醇固定5分钟，再过3次4℃预冷的10%三氯醋酸。

(3)将细胞片标本浸入70%乙醇脱水，空气干燥，这时培养细胞盖玻片应该用中性树胶固定于载玻片上，注意细胞面向上。

(4)将细胞片放置在金属盘内，并将托盘放入43℃水浴箱中预热。

(5)直接向固定的细胞面滴加5mL含探针杂交液，然后用16mm盖玻片覆盖，其边缘用橡胶液封闭。

(6)43℃恒温水浴箱内培养18小时，此间保持箱内高湿度，防止因盖玻片封闭不严导致杂交缓冲液干涸。

(7)反应结束后，将玻片置于冰块上，用镊子小心剥下盖玻片周边的橡胶，将载玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使盖玻片脱落。

(8)将载玻片放入湿盒中，加2×SSC溶液浸没玻片，加盖玻片并用胶带封闭湿盒。然后，将湿盒移入水浴箱中53℃处理30分钟。

(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分钟。

(10)玻片浸入70%乙醇脱水，空气干燥。

(11)将干燥后的干燥标本浸入新配制的核4乳胶液（核4乳胶液蒸馏水=1:1），垂直取出玻片，用滤纸擦去背面多余胶，室温干燥5小时（在暗室中进行）。

(12)用黑纸包裹标本放在4℃冰箱曝光（3H标记的探针通常需2～4周，有时需长达100天，可造成高背景，而不理想）。

(13)按常规显影、定影、水洗。

(14)对标本进行Giemsa或HE染色、脱水、封片。

结果分析：镜下观察，如需定量，可在镜下计数银颗粒或拍摄显微照片，用图象分析仪进行灰度分析。

(二)同位素标记RNA探针的原位杂交

RNA探针容易制备，合成率较高，成本低，易纯化，可提高检测敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA杂交比DNA-DNA杂交稳定，能适应更多的条件。

(1)标本处理同前

(2)将RNA标记探针溶于杂交缓冲液中（5×107CPM/ml放射强度）。

50～70%去离子甲酰胺 2×SSC

0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0

200μg/mL变性鱼精DNA 85℃ 5分钟

(3)每张载玻片上滴加杂交液，使每张载玻片探针总量为2×105CPM，用一硅化的盖玻片盖住，封以不透性矿物油，在利于探针的温度下（常为42℃）杂交7～18小时。

(4)用氯仿洗数次，去除矿物油，室温下使盖玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC液，杂交温度下60分钟，室温2×SSC洗5分钟，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除单链RNA，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC,室温15分钟，室温下用0.1×SSC洗5分钟。

(5)将切片脱水，浸入由1%甘油稀释的放射自显影乳剂（1:1）中，放入暗盒中，在有硅胶干燥剂存在下-70℃，存放5天（或者曝光于X光胶片24～48小时），随后浸于液体乳剂。

(6)用HE染色。

(三)地高辛标记的DNA探针原位杂交

放射性同位素标记探针缺点是有放射损伤，易污染环境，需特殊防护和实验条件，有半衰期受限、标记不稳定及曝光时间长。若改用生物素、乙酰氨基、荧光或地高辛标记可避免，其中以地高辛标记探针最敏感，随机引物标记地高辛，其标记率很高，此探针用于原位杂交可获高敏感性，好的细胞定位以及低背景。非同位标记探针还可以通过双标记原位杂交法，同时测多条DNA序列。

(1)配液：①杂交缓冲液：2×SSC

5%（W/V）磷酸葡聚糖

50%去离子甲酰胺

②缓冲液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5

0.5mol/L Nacl

③缓冲液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5

0.1mol/L Nacl

5mmol/L MgCl2

(2)操作步骤：

①组织标本处理同前。

②将140ng/mL地高辛标记的探针加到杂交缓冲液中，每张滴加50μL杂交缓冲液，用盖玻片盖住，四周封以树胶。

③将目的DNA和DNA探针放入90℃，进行变性10分钟，双链打开，42℃，在潮湿环境中杂交16小时。

④去除盖玻片，按下列条件洗涤：

2×SSC室温10分钟→2×SSC室温10分钟→0.2×SSC室温10分钟→0.2×SSC 42℃ 20分钟。

⑤再按以下方法处理：

1) 在缓冲液I中洗30分钟。

2) 在含有20%羊血清的缓冲液I中洗30分钟。

3) 滴加1:5000标有碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的地高辛抗体，在装有缓冲液I的湿盒中温育20分钟。

4) 在缓冲液I中洗2×20分钟。

5) 在缓冲液II中洗60分钟。

6) 加入下述溶液：缓冲液II

0.33mg/mL 四唑氮兰

0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate

7) 将切片浸于20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA终止反应。

⑥ 用底物显色、复染、脱水、封片，按免疫组化常规法进行。

说明：

(1)用不同浓度和不同温度的盐溶液洗涤是为了去除探针与不完全同源序列杂交，减少非特异性显色，其原则盐浓度由高到低，温度由低到高洗涤，洗涤过程中切勿使切片干燥。

(2)应该有阳性和阴性对照，阳性对照：用该探针与已知含互补序列的组织细胞标本进行杂交。阴性对照：①应用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未标记探针；③不加核酸探针进行杂交（空白对照）；④用不含探针DNA的无关质粒DNA替代探针进行杂交；⑤同义RNA（Sense probe）进行杂交。

一、SDS-PAGE的工作原理

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是实验室常用的基于蛋白质分子量对蛋白质进行分离的方法。

SDS-PAGE根据蛋白质的分子量来分离蛋白质，基于施加电场的作用下通过筛分基质（凝胶）产生的迁移率。

1.  使蛋白质的迁移率与分子量成正比

任何带电物种在电场中的运动都是由其净电荷、分子半径和外加电场的大小决定的。但自体折叠的蛋白质所带来的问题是，它们的净电荷和分子半径都不依赖于分子量。相反，它们的净电荷由氨基酸组成决定，即蛋白质中的氨基酸正、负电荷之和以及蛋白质三级结构的分子半径决定。  

因此，在它们的原生状态下，具有相同分子量的不同蛋白质在电场中以不同的速度迁移，这取决于它们的电荷和三维形状。  

为了根据分子量在电场中分离蛋白质，我们需要将蛋白质还原为线性分子，破坏三级结构，并以某种方式掩盖蛋白质的固有净电荷。这就是SDS的应用来源。

2.  SDS的作用

SDS是一种存在于SDS-PAGE缓冲液中的洗涤剂，在这种缓冲液中，伴随着一点煮沸和还原剂（通常是DTT或β-ME来分解蛋白质-蛋白质二硫键），它会破坏蛋白质的三级结构。这将折叠的蛋白质转变为线性分子。

SDS利用均匀的负电荷覆盖蛋白质，从而掩盖R-基团的固有电荷。SDS与线性蛋白（约1.4g SDS/1g蛋白）的结合相当均匀，这意味着蛋白质的电荷现在与它的分子量近似成正比。  

SDS也存在于凝胶中，以确保一旦蛋白质被线性化，电荷被掩盖，但蛋白质在整个电泳分离过程中仍保持这种方式（与分子量成正比的迁移）。  

SDS包被的蛋白在凝胶中的迁移率的主要决定性因素是它的分子半径。  

SDS包被的蛋白已被证明是线性分子，18Å宽，长度与分子量成正比，因此分子半径（它们在凝胶中的迁移率）由蛋白质的分子量决定。由于SDS包被的蛋白质具有相同的电荷质量比，因此不存在基于电荷的差异迁移。

3. 凝胶基质

在外加电场中，SDS处理后的蛋白质现在将以不同分子量产生的不同速率向阴极移动。这些不同的迁移率将被凝胶基质的高摩擦环境扩大。

SDS-PAGE的凝胶基质是聚丙烯酰胺，它具有化学惰性，并且至关重要的是可以很容易地在各种浓度下制备不同的孔径，可以产生不同的分离特性。

4. 不连续缓冲体系与浓缩凝胶

为了通过凝胶将电流从阳极传递到阴极，需要缓冲液。我们通常使用不连续Laemmli缓冲系统。 “不连续”仅仅意味着凝胶和电泳槽的缓冲液是不同的。  

通常，该系统采用pH6.8的Tris-HCl缓冲液配置的浓缩胶，pH8.8的Tris-HCl缓冲液配置的分离胶以及pH8.3的电极缓冲液，浓缩胶具有低浓度的丙烯酰胺，分离胶具有更高的浓度，能够延缓蛋白质的运动。

那些不同的pH是怎么回事儿？甘氨酸可以以三种不同的电荷状态存在，正电荷、中性电荷或负电荷，这取决于pH值。用不同的缓冲液控制甘氨酸的电荷状态是整个浓缩胶的关键。

同时，这也是浓缩胶的工作原理，当电源接通时，在pH 8.3电极缓冲液中带负电荷的甘氨酸离子被迫进入浓缩胶（pH为6.8），在这种环境中，甘氨酸主要转变为两性离子（中性电荷）状态。电荷的这种损失使它们在电场中移动得非常缓慢。  

另一方面，氯离子（来源于Tris-HCl）在电场中移动得很快，它们形成一个离子锋，在甘氨酸之前迁移。从Tris平衡离子（正朝阴极移动）中分离出的Cl-形成一个具有陡峭电压梯度的狭窄区，该电压梯度将甘氨酸往后拉，导致迁移离子产生两个狭长迁移前沿，高流动性的Cl-前沿，然后是较慢的中性甘氨酸前沿。  

所有凝胶中的蛋白质样本的电泳迁移率处在甘氨酸和Cl-迁移率的极值之间。因此当两个前沿进入样品孔时，蛋白质浓缩到Cl-和甘氨酸之间的狭窄区。

5. 当蛋白质离开浓缩胶

浓缩胶迁移过程结束后，进入分离胶，pH转变为8.8，在该pH下，甘氨酸分子大多带负电，迁移速度比蛋白质快得多。因此，甘氨酸加速通过蛋白质，而蛋白质留在分离胶中。  

结果是，蛋白质在浓缩和分离胶的界面处被浓缩到非常窄的带中，并且由于分离胶中丙烯酰胺浓度的增加，这减缓了蛋白质根据其分子量大小的运动，分离开始。

6. 浓缩胶起到了什么作用

浓缩胶胶孔约1cm深，通常需要填充足够的蛋白在凝胶上。因此，缺少浓缩胶的情况下，样本则置于分离胶上，而样本条带将达到1cm深。  

与浓缩成一条带同时进入分离胶相比，没有浓缩胶意味着蛋白质在不同时间分别进入浓缩胶而形成弥散条带。

因此，浓缩胶确保蛋白质同时达到分离胶，分子量相同的蛋白质则形成紧密条带进行迁移。

7. 蛋白质分离

一旦蛋白质进入分离胶，则因高分子量蛋白质通过多孔丙烯酰胺凝胶的速度比低分子量蛋白慢而被分离。凝胶孔的大小可以根据丙烯酰胺浓度和蛋白质分子量大小而改变。  

对于更宽的分离范围，或对于难以分离的蛋白质，可以使用具有丙烯酰胺浓度增加的梯度凝胶。

二、蛋白酶和蛋白酶抑制剂工作原理

1. 蛋白酶：好的，坏的，水解的

所有生物体都有蛋白水解酶和磷酸化酶，包括：你、我、甚至棉铃虫。虽然蛋白酶涉及到从宿主防御到伤口愈合乃至病毒复制的各个方面，但根据蛋白酶活性位点的构成和与目标肽键的相互作用，可以大致分为两大类。

1）通过丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸在其活性部位的亲核活化水解键；

2）天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶，利用水本身进行水解。

2. 抑制剂：你不能只靠一种

化学分解、碰撞摩擦、超声波和冻融，把整个系统都弄得乱七八糟。没有肽键是安全的！  

外肽酶攻击氨基酸链的末端，而内肽酶水解它们的内部连接。激酶磷酸化和去磷酸化随意。  

没有一种抑制剂能清除所有蛋白酶，阻止每一个磷酸化事件。它需要一种“鸡尾酒”的方法来阻止蛋白质分解。蛋白酶抑制剂在胁迫下可以不可逆、可逆和可逆地作用，可以是任何小分子，如氟化钠，也可以是进化过程中自身微生物抑制剂多肽类似物。它们可以与底物竞争活性位点，有时会破坏或者囤积蛋白酶功能所需的珍贵阳离子。  

竞争性抑制剂的作用是以类似底物的方式与活性位点结合通过修饰阻止蛋白酶，例如，酯化反应。许多大的竞争抑制剂通过增强亲和性和特异性结合。  

竞争性的阻碍因素。因素种类繁多，从抑肽酶，一种6kDa的多肽丝氨酸蛋白酶（在极端的pH值是可逆的），到正钒酸钠，一种抑制易受骗蛋白-酪氨酸磷酸酶的小分子。

螯合剂利用它们对金属离子的增强亲和力与金属离子螯合，而不能与其他成员发生反应。金属蛋白酶的活性部位需要锌、镁、锰、钙，甚至钴来活化水，水解肽键，以达到水解目的。把锌和乙二胺四乙酸（EDTA）结合起来，把钙和乙二胺四乙酸（EGTA）结合起来，金属蛋白酶就不再有活性了。

三、琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的

1.琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的

聚丙烯酰胺主要用于SDS-PAGE，是由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺单体组成的基质。它的优点是化学惰性，因此在蛋白质通过时不会与蛋白质发生相互作用，而且它可以用不同的孔径轻松地、重复地制造出具有不同分离特性的凝胶。

聚合反应，是自由基催化的乙烯基加成反应。该反应由TEMED引发，引发过硫酸铵（APS）自由基的生成。自由基将电子转移到丙烯酰胺/双丙烯酰胺单体上，使它们呈放射状并相互作用形成聚丙烯酰胺链。

在缺失双丙烯酰胺的情况下，丙烯酰胺会聚合成长链，而不是多孔凝胶。双丙烯酰胺交联丙烯酰胺链，是形成多孔凝胶基质的原因。通过改变丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例，可以控制交联的量，决定凝胶的孔径和分离特性。

2. 琼脂糖凝胶形成

琼脂糖—凝胶琼脂的主要成分，可以从某些海藻中分离出来—本身就是一种聚合物。但是，聚合不是琼脂糖凝胶形成的机制。  

在化学上，琼脂糖是一种多糖，其单体单元是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳吡喃糖的二糖。

在低于35℃的水溶液中，这些聚合物链通过非共价键相互作用（像氢键）和静电相互作用被保持在多孔凝胶结构中。 

加热溶液会破坏这些非共价相互作用，并使链脱离。  

当溶液冷却时，这些非共价相互作用被重新建立并且形成凝胶。 

所以，琼脂糖（和琼脂）凝胶是通过氢键和静电相互作用而不是通过聚合形成的。

四、乙醇是如何沉淀DNA和RNA的

乙醇沉淀法是一种在水溶液中浓缩和脱盐核酸（DNA或RNA）的常用方法。最基本的步骤是在水溶液中加入盐和乙醇，迫使核酸从溶液中沉淀出来。

通过离心分离沉淀的核酸。核酸颗粒在70%的冷乙醇中洗涤，进一步离心后，干燥去除乙醇，核酸颗粒被重新悬浮在干净的缓冲液中。

1. 关于溶解度

首先我们需要知道为什么核酸能溶于水。水是一个极性分子，由于非共享的电子对，它在氧原子附近有部分负电荷，在氢原子附近有部分正电荷。  

由于这些电荷，极性分子，如DNA或RNA，可以与水分子静电作用，使它们很容易溶于水。  

因此，极性分子可以被描述为亲水性分子，而非极性分子是疏水性的，它们不易与水分子相互作用。 

核酸是亲水性的，这是由于糖磷酸主链上带负电荷的磷酸（PO3-）基团。

2.  盐的作用

盐在实验中的作用是中和糖磷酸骨架上的电荷。一种常用的盐是醋酸钠（乙酸钠），在溶液中，乙酸钠分解成NA+和[CH3COO]-。  

带正电的钠离子中和了核酸上PO3-基团的负电荷，使分子的亲水性大大降低，因此在水中的溶解度大大降低。

3. 乙醇的作用

溶液中Na+离子与PO3-离子之间的静电吸引受库仑定律的支配，受溶液介电常数的影响。  

水具有很高的介电常数，这使得Na+和PO3-很难结合在一起。  

另一方面，乙醇具有较低的介电常数，使得Na+更容易与PO3-相互作用，屏蔽其电荷，使核酸不太亲水，导致其从溶液中脱落。

4. 温度的作用

低温（如-20或-80℃）下保存核酸/盐/乙醇混合物用于沉淀核酸通常在实验中认为是必要的。  

然而，这不是必需的，因为浓度低至20ng/mL的核酸在0-4℃时会沉淀，因此在冰上孵育15-30分钟就足够了。

5. 70%无水乙醇洗涤步骤

把沉淀的DNA颗粒中的残留盐洗掉。

6. 关于核酸沉淀的一些建议：

a. 盐的选择

使用醋酸钠（0.3M终浓度，pH值5.2）进行常规DNA沉淀；  

对于含有SDS的DNA样品，使用氯化钠（终浓度为0.2M），因为NaCl使SDS在70%乙醇中保持可溶性，因此不会与DNA一起沉淀；  

对于RNA，使用氯化锂（0.8M终浓度）。这是因为2.5-3体积的乙醇应用于RNA沉淀，而LiCl比NaAC更易溶于乙醇，因此不会沉淀，但要注意氯离子会抑制蛋白质合成和DNA聚合酶，因此LiCl不适合用于体外翻译或反转录RNA的制备。在这种情况下，使用NaAC。

使用乙酸铵（2M终浓度）去除dNTPs，但不用于制备应用于T4多核苷酸激酶反应的DNA，因为铵离子抑制酶活性。

提高低浓度或小核酸片段沉淀的产率（<100个核苷酸）

a. 将MgCl2添加至最终浓度0.01M ；

b. 将离心前在冰上孵育的时间增加到1小时。

分子式：C2H3NaO2▪nH2O（n=3或0）[3]

相对分子质量：136.08（三水物）[3]

82.03（无水物）[3]

性状为无色透明单斜晶系棱柱状结晶或白色结晶性粉末，无臭或稍带醋气味，略苦，于干燥湿热空气中易风化。相对密度1.45，加热至58℃溶于结晶水中，至120℃失去结晶水而成白色粉末，315℃以上时熔融并分解成碳酸钠。易溶于水（46.5g/100mL，20℃，0.1mol/L水溶液pH为8.87）、丙酮等，溶于乙醇，不溶于乙醚。[3]

相对密度：1.45（三水合物）；1.528（ 无水物）[2]

折光率：1.464[2]

熔点（℃）：58[2]

溶解性：易溶于水、乙醇、乙醚。[2]

计算化学数据

1、疏水参数计算参考值（XlogP）：无[2]

2、氢键供体数量：0[2]

3、氢键受体数量：2[2]

4、可旋转化学键数量：0[2]

5、互变异构体数量：无[2]

6、拓扑分子极性表面积：40.1[2]

7、重原子数量：5[2]

8、表面电荷：0[2]

9、复杂度：34.6[2]

10、同位素原子数量：0[2]

11、确定原子立构中心数量：0[2]

12、不确定原子立构中心数量：0[2]

13、确定化学键立构中心数量：0[2]

14、不确定化学键立构中心数量：0[2]

15、共价键单元数量：2[2]

毒理学数据

1、皮肤/眼睛刺激：

兔子皮肤标准德雷兹染眼实验：500mg/24H 对皮肤有轻微的刺激作用。[2]

兔子眼睛标准德雷兹染眼实验：50ug/24H 对眼睛有轻微的刺激作用。[2]

2、急性毒性：

大鼠经口LD50：3530mg/kg[2]

大鼠吸入LC50：>30gm/m3/1H[2]

小鼠经口LD50：6891mg/kg[2]

小鼠皮下LD50：3200mg/kg[2]

小鼠静脉注射LDLO：1195mg/kg[2]

兔子皮肤LD50：>10mg/kg[2]

兔子经静脉注射LDLO：1300mg/kg[2]

合成方法

1、将三水醋酸钠置于瓷皿中，在120℃下加热至获得干燥的白色物质，得无水醋酸钠。[2]

在有机合成中，例如用无水醋酸钠和碱石灰共熔制备甲烷时，所用无水醋酸钠应在临用前制备。将适量三水醋酸钠放在瓷蒸发皿中，在玻棒搅拌下加热至约58℃时，三水醋酸钠溶解于结晶水中，水分逐渐蒸发后，得到白色固体，此时温度约为120℃。继续加热至固体熔融，但温度不要超过三水醋酸钠的熔点（324℃），以免醋酸钠分解为丙酮及碳酸钠。在搅拌下稍冷却，趁热在乳钵中研细，并立即储存于密闭容器中备用。[2]

Ca（CH3COO）2+ NaCO3→ 2CH3COONa + CaCO3↓[2]

2、用结晶碳酸钠中和醋酸，过滤后蒸发、冷却、结晶，在常温下干燥而成。[2]

3、用硫酸钠和碳酸氢钠处理醋酸钙而成。[2]

4、醋酸钠的生产方法很多，可以用稀醋酸或醋酸钙与纯碱作用而得；也可以用硫酸钠与醋酸钙复分解而得。工业上还常采用药厂和香料厂的下脚料回收醋酸钠。[2]

把628kg稀醋酸倒入反应器中，把200kg纯碱分次加入反应器中。不搅拌，开动引风机抽气。反应平稳后开动搅拌，使纯碱和醋酸充分反应，然后打入蒸发器加热浓缩至液体密度为1.24g/cm3时停止加热。反应液过滤后打入结晶器中，用NaOH调节Ph值为9.2，冷却至35℃结晶。抽去表面母液，甩干结晶得到350kg白色粉末状产品。一次产率约为70%。[2]

用途

1、测定铅、锌、铝、铁、钴、锑、镍和锡。络合稳定剂。乙酰化作用的辅助剂、缓冲剂、干燥剂、媒染剂。[2]

2、用于测定铅、锌、铝、铁、钴、锑、镍、锡。用作有机合成的酯化剂以及摄影药品、医药、印染媒染剂、缓冲剂、化学试剂、肉类防腐、颜料、鞣革等许多方面。[2]

3、用作缓冲剂、调味剂、增香剂及ph值调节剂。作为调味剂的缓冲剂，可缓和不良气味并防止变色改善风味时使用0.1%-0.3%。具有一定的防霉作用，如使用0.1%-0.3%于鱼肉糜制品及面包。亦可用作调味酱、酸菜、蛋黄酱、鱼糕、香肠、面包、黏糕等的酸味剂。与甲基纤维素、磷酸盐等混合，用于提高香肠、面包、黏糕等的保存性。[2]

4、用作硫黄调节型氯丁橡胶炼焦的防焦剂，用量一般为0.5质量份。还可用作动物胶的交联剂。[2]

5、本品可用于碱性电镀锡的添加，但对镀层及电镀过程并无明显影响，不是必要成分。乙酸钠常用作缓冲剂，如用于酸性镀锌、碱性镀锡和化学镀镍。[2]

鉴别方法

1、5%试样溶液的钠盐反应：将氯化钠或硝酸钠的溶液，与五倍容量的醋酸钴双氧铀试液（取醋酸钴双氧铀结晶40g，加于由冰醋酸30g和用水定容至500mL的混合液中，加热使之溶解）混合并摇振后，产生金黄色沉淀。[3]

2、醋酸盐反应：中性的醋酸盐溶液遇氯化铁试液（取氯化铁FeCl3▪6H2O 9g，溶于水并定容至100mL，约为1mol/L）后可产生深红色，但如加入无机盐，则呈色即遭破坏。[3]

3、做红外光谱测试，应符合标准品的红外谱图。[3]

含量测定

原理

醋酸钠在水溶液中，是一种很弱的碱（pKb=9.24），不能在水中用强酸准确滴定，因此需用非水滴定法。选择适当的溶剂如冰醋酸则可大大提高醋酸钠的碱性，可以HClO4为标准溶液进行滴定，其滴定反应为：[4]

H2Ac++ ▪ClO4-+ NaAc = 2HAc + NaClO4[4]

邻苯二甲酸氢钾常作为标定HClO4▪HAc 标准溶液的基准物，其反应如下：[4]

C6H4▪COOH▪COOK + H2Ac+ + ▪ClO4-= C6H4▪COOH▪COOH + HAc + KClO4[4]

由于测定和标定的产物为NaClO4和KClO4，它们在非水介质中的溶解度都较小，故滴定过程中随着HClO4▪HAc 标准溶液的不断加入，慢慢有白色混浊物产生，但并不影响滴定结果。本实验选用乙酸酐、冰醋酸混合溶剂，以结晶紫为指示剂，用标准高氯酸-冰醋酸溶液滴定。[4]

步骤

1、HClO4▪HAc滴定剂的标定

准确称取KHC8H4O40.15-0.2g于干燥锥形瓶中，加入冰醋酸20-25mL使其溶解，加结晶紫指示剂1滴，用HClO4▪HAc（0.1mol/L）缓缓滴定至溶液呈稳定蓝色（略带紫色），即为终点，平行测定三份。取相同量的冰醋酸进行空白试验校正。根据KHC8H4O4的质量和所消耗的HClO4▪HAc的体积，计算HClO4溶液的浓度。[4]

2.醋酸钠含量的测定

准确称取0.1g无水醋酸钠（0.25g试样三水醋酸钠），置于洁净且干燥的250mL锥形瓶中，加入20mL冰醋酸使之完全溶解，再加5mL乙酸酐，加结晶紫指示剂1滴，用0.1mol/LHClO4▪HAc标准溶液滴至溶液由紫色转变为蓝色，即为终点。平行测定三份，并将结果用空白试验校正。根据所消耗的HClO4▪HAc体积（mL），计算试样中醋酸钠的质量分数。[4]

注意事项

乙酸酐（CH3CO）2O是由2个醋酸分子脱去1分子H2O而成，由于72%HClO4溶液中含有水，乙酸酐与水发生剧烈反应，反应式为：[4]

（CH3CO）2O + H2O = 2CH3COOH[4]

同时放出大量的热，过热易引起HClO4爆炸，因此，配制时不可使高氯酸与乙酸酐直接混合，只能将HClO4缓缓滴入到冰醋酸中，再滴加乙酸酐。[4]

贮存方法

1、密封干燥保存。[2]

2、用内衬塑料袋，外套编织袋或麻袋包装。醋酸钠具有潮解性，贮运中要注意防潮，严禁与腐蚀性气接触，防止曝晒和雨淋，运输要加防雨覆盖物