如何用乙醇沉淀法浓缩质粒DNA

此次试验一般会有两个疑问：

1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

1.DNA不溶于乙醇

2.乙醇可以吸附水分子（极性相同）,使得溶液中相对的水分子减少,增大了DNA在水中的相对浓度.

3.附：乙醇沉淀DNA需要盐离子,用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷,降低DNA分子间的斥力,才能沉淀完全.

纯化DNA的常用方法是用酚抽提-乙醇沉淀法，适用于普通实验室操作。它通过交替使用苯酚、氯仿两种不同的蛋白质变性剂，可以增加去除蛋白质杂质的效果；氯仿可以去除核酸溶液中的微量酚，还可以加快有机相与液相混合，去除色素和蔗糖；在氯仿中加入少量的异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

【实验材料】

待纯化的DNA溶液。

【实验仪器】

高压灭菌锅，涡旋混匀器，台式高速冷冻离心机

【试剂配制】

1、Tris饱和酚（pH8.0）：氯仿：异戊醇混合液

酚：氯仿：异戊醇按体积比25：24：1配制，现配现用。

2、氯仿：异戊醇混合液

氯仿：异戊醇按体积比24：1配制，现配现用。

3、醋酸钠溶液

配制3 mol／L的醋酸钠溶液，调节pH值至5.2。

4、TE缓冲液

10 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），1 mmol／LEDTA（pH 8.0），配制完成后高压灭菌，4 ℃保存。

【实验步骤】

1、在待纯化的DNA溶液中加等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液，然后在涡旋混匀器上充分混匀。

2、将混合物12000 r／min离心10 min后，移取上层含DNA的水相到另一离心管中。如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则需要重新抽提水相，直到两相交界处无明显沉淀物。

3、向上层水相中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）混合液，在涡旋混匀器上充分混匀后12000 r／min离心10 min。

4、移取上层含DNA的水相到另一离心管中，加1／10体积的醋酸钠溶液，充分混匀，再向管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀，于-20 ℃保存30 min。

5、12000 r/min离心5 min，弃上清液；75%的乙醇12000 r/min离心洗涤5 min，弃上清液；用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥10-15 min（不要等DNA沉淀完全干燥，否则DNA不易溶解）。

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6、在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液，溶解后在-20 ℃以下长期保存。

溶解的原理是被溶解溶质的分子分散到溶解该物质的溶液分子间隙的过程，这个原理同样适用于DNA溶于水的过程，即DNA分子同水分子相互结合。乙醇分子和水的结合力大于DNA与水的结合力，故乙醇分子会抢占原来已经溶于水的DNA分子的位置，DNA分子因此被析出。为保证所形成的乙醇溶液的浓度，要加两倍以上体积的乙醇，这样能形成60%以上浓度的乙醇溶液，不一定是两倍，但是一定要高于这个值，否则DNA不容易析出。DNA提取的下一步加70%洗涤也是这个原理，其实量多量少不重要，关键是达到一定的条件。

可以，但是最好使用醋酸铵，也可以不加，回收效率可能会低一点，操作步骤：

方法一：

将忆确定的回收产物溶液于加有300 µL TE缓冲液的灭菌的1.5 mL Eppendorf管中。

加入等体积酚-氯仿-异戊醇，摇晃均匀。

12000 rpm离心5 min。

小心将水相移到另一1.5 mL Eppendorf管中，加入2.5~3倍体积（780 µL即可）预冷无水乙醇，以及10%水相体积的3 M NaAC（pH 5.2）。

置液氮3 min，取出后可置于－20℃放几min。小心防止管子爆裂。

12000 rpm离心10 min。

迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无水乙醇清洗后置于恒温器上干燥（55℃）5~10 min至无乙醇气味，再加入20 µL ddH2O溶解。

取20 µL电泳定量后－20℃储存备用。

方法二：

先把乙醇-20度预冷，酶切完后加入2倍体积的无水乙醇，-20度放置10min以上，12000rpm离心10min，管底出现白色沉淀，倒掉上清，换用70%乙醇重复一次，再用水溶解白色沉淀既可，损失率蛮大，回收率只有40%，或者更低。