2021-06-15 GFP是什么

蛋白标签（Protein tag）技术是指利用基因克隆手段，将具有特定功能的多肽，蛋白质结构域，甚至完整蛋白质与目标蛋白融合在一起，以实现目标蛋白的表达纯化，检测和示踪等应用的技术。蛋白标签融合已经成为蛋白质研究中最常用的技术之一，下面我就为大家盘一盘这些常用标签的特点及应用。

蛋白标签根据其功能，大致可以分为检测标签、表达纯化标签和示踪标签三类。

蛋白质的检测方法包括质谱、酶活检测、免疫分析等，其中应用最为广泛的是免疫分析，常用的方法有：WB（Western Blot）、ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）、IP（Immunoprecipitation）等。免疫分析需要将目标蛋白作为抗原，注射动物，然后从免疫血清中分离抗体，根据抗原-抗体间的免疫反应进行特异性检测。这种方法最大的缺陷就是每更换一个目标蛋白就要制备一个对应的抗体，操作繁琐，成本昂贵。融合标签的使用，使蛋白质免疫分析走向通用化和便利化。我们将特定的标签与目标蛋白融合后，两者是共同表达的，通过检测融合标签，可以得到目标蛋白的表达情况。经过长期的研究，目前已经开发出一些比较成熟的检测标签，下面就挑几个来介绍一下：

1) HA

HA标签，属于小标签，共9个氨基酸，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，对目标蛋白的空间结构影响小, 可融合到N端或者C端，可购买商业化的Anti－HA抗体检测。HA标签常用于蛋白质印迹，免疫荧光和免疫沉淀实验，偶尔用于ELISA和ChIP分析。

2) His

His标签，也是小标签，多指6个组氨酸多肽，该标签对目标蛋白的空间结构影响极小, 可融合到N端或者C端，一般无需切除也不会对目标蛋白功能产生影响，可购买商业化的Anti－His抗体检测。His标签常用于蛋白质印迹实验。

3) c-Myc

Myc标签，包含人类原癌基因Myc的10个氨基酸区段，序列为EQKLISEEDL，可融合到目标蛋白N端或者C端。由于可获得高特异性抗Myc单克隆抗体，因此在Western印迹，免疫荧光和免疫沉淀实验中被广泛使用，但是很少用于蛋白质纯化。目前，市场上已有很多可供选择的商业化c-Myc抗体。

4) Flag, 3×Flag

FLAG标签，是目标蛋白中一种比较流行的短肽标签，序列为DYKDDDDK，可以与蛋白质的C端或N端融合。由于其包含肠激酶的识别位点（DDDDK），可方便去除，因此比较适合融合在目标蛋白N端。Flag标签与同类标签相比，更具亲水性，因此通常不会变性或使与其连接的蛋白质失活，常用于真核表达系统中目标蛋白的检测。目前已经开发出性能更好的3×Flag 标签，共22个氨基酸，分子量2.7KDa。3×Flag标签序列不是唯一的，有文献直接用3个Flag的串联重复，这不利于标签的去除，常用的序列为序列为DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。3×Flag可免疫原性和与抗体的亲和性得到极大增强，适用于真核生物低水平表达的蛋白的检测和纯化。目前，市场上已有很多可供选择的商业化Flag及 3×Flag抗体。

5) S

S标签，是一段来源于胰腺核糖核酸酶 A（RNase A）N 末端的短肽，氨基酸序列为KETAAAKFERQHMDS。 通常将 S-tag 构建到目标蛋白的 N 末端或 C 末端上，可以使用商业化的 S-tag 抗体进行免疫检测。此外，S-tag与S-蛋白质（同样来自于RNase A）之间有强烈相互作用，因此S-tag可用于蛋白质纯化，但由于洗脱条件较苛刻，为了获得有功能的蛋白质推荐用蛋白酶切割标签，然后洗脱目标蛋白。

6) T7

T7标签，一种源自T7噬菌体衣壳蛋白的表位标签，序列为MASMTGGQQMG，可融合到目标蛋白质的N或C末端，可购买商业化的Anti－T7抗体检测。T7标签常用于蛋白质印迹实验。

7) V5

V5标签，是猿猴病毒5（SV5）副粘病毒P和V蛋白上存在的小表位（Pk）短肽，序列为RNA聚合酶α亚基的95-108位氨基酸残基GKPIPNPLLGLDST，可被融合到目标蛋白的N或C末端。在文献报道中，大多将V5融合到目标蛋白C端，常用于哺乳动物和昆虫细胞表达系统蛋白质印迹，免疫荧光和免疫沉淀检测。

蛋白质纯化的方法有很多，离子交换、疏水层析、分子筛和亲和层析，其中纯化效果最好的无疑是亲和层析，它利用基质与蛋白标签间的特异性结合，以极高的得率和纯度获得目标蛋白。下面就挑几个常用的纯化标签来介绍一下。

1) His

His标签，大多是指六个组氨酸组成的融合标签，即His6，可融合在目的蛋白的C末端或N末端。His标签在蛋白质纯化领域可谓是“最靓的仔”，1987年，Hochuli等首次提出利用组氨酸标签纯化蛋白质，至今His标签在蛋白质纯化领域仍有最广泛的应用。组氨酸残基侧链与固定的镍离子有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)。标签的分子量小，只有约0.84KD，一般不影响目标蛋白的功能，此外His标签也可用于免疫检测，而融合His标签的蛋白免疫原性较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。

2) GST

GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签，是蛋白质纯化最常用的标签之一，GST是大标签，它是一个完整的蛋白质，分子量约26KD。GST一方面具有高度可溶性，能够增加目标蛋白的可溶性；另一方面它可以在大肠杆菌中大量表达，提高目标蛋白的表达量。因此被广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。GST标签融合蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶的亲和树脂进行纯化，用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱，可得到高浓度、高纯度融合蛋白。不过由于GST标签较大，通常需要将该标签切除，因此GST一般融合在靶标的N端。对于目标蛋白为活性酶的情况，如果经过活性验证确认GST对酶的活性没有影响，也可以保留标签。目前，也有很多商业化的GST抗体可用于对目的蛋白进行用特异性检测。

3) MBP

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签，是蛋白质纯化最常用的标签之一，也是大标签，分子量大小在40kDa以上，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加目标蛋白在细菌中的溶解性，尤其是真核蛋白，也可以增加融合蛋白表达量。MBP可以和交联淀粉亲和树脂结合，结合的融合蛋白可用10-20mM麦芽糖在温和条件下洗脱，得到高纯度、高浓度目标蛋白。MBP的特点与使用方法与GST十分相似，也有专门的商品化抗体进行检测。需要注意的是，MBP序列有两种形式，一种N端含有信号肽，适用于毒性蛋白的表达纯化，一般融合在N端；一种不含信号肽序列，可融合在N端或C端，多融合在N端。

4) CBD

CBD标签，一般是指来源于枯草杆菌的几丁质结合结构域，分子量约5kDa，该标签由NEB公司推出，结合其IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系统，用于（毒性）目标蛋白的表达与纯化。在IMPACT系统中，CBD和一个来源于酵母的intein蛋白质组成一个双效的融合标签。Intein是一个蛋白质剪接元件，类似于基因组中的内含子，intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，可以释放出与之相连的目的蛋白。也就是说融合表达产物在挂上亲和层析柱后只需要在低温（4℃）条件下用含DTT，或者巯基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脱，即可将目的蛋白洗脱，而将融合标签留在纯化柱上，而还原剂的小分子可以非常简单的去除。后来NEB推出了IMPACT-CN系统（即融合标签可以选择在目的蛋白的C端或者N端）和更加灵活便利的IMPACT—TWIN系统，感兴趣的可以自己去了解下。

（我使用过该系统，但效果并不像宣传的那么理想，原因有两个：1）因为要使用DTT作为切割剂，不适合含有内部二硫键蛋白质的纯化 2）融合基因在体内体外均存在较大的自剪切风险，在纯化毒性较大的蛋白质时，很难得到目标蛋白。）

5) Strep-tag

Strep标签，一般指Strep-tag II，是长度8个氨基酸的短肽，序列为WSHPQFEK，可以融合在目标蛋白N端或C端。Strep标签融合蛋白与链霉菌抗生物素蛋白柱上的基质特异性结合，D-生物素或其衍生物可作为洗脱剂，从而实现融合蛋白的特异性纯化。由于，抗体柱十分昂贵，Strep标签在蛋白纯化中并不常用。

6) Halo-Tag

Halo标签，是一种细菌脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的Halo-Tag配基有效地共价结合，分子量为33KDa，可融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系统中表达。

7) SNAP-tag

SNAP-标签，是一种人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的突变体，长度为182个氨基酸，分子量约19 kDa，可与任何目标蛋白质融合，并进一步用合适的配体（例如荧光染料）进行特异性和共价标记。将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。

8) SUMO

SUMO标签，是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-like modifier），在一级结构上与泛素只有18%的同源性，但两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现，SUMO可以作为融合标签，不但可以提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进目标蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。此外，使用SUMO蛋白水解酶，能识别完整的SUMO标签，并高效的把SUMO从融合蛋白上切割下来。该标签主要用于改善目标蛋白的表达，并非常用的纯化标签，要用于纯化可采用双标签。

9) NusA、TrxA、DsbA

NusA标签是一种反转录终止因子，能增加融合蛋白的溶解度和表达；TrxA标签是硫氧还蛋白，几乎存在于所有生物中，它即可能会增加融合蛋白的溶解度，方便地纯化细菌粗周质提取物，也有助于外源基因形成二硫键；DsbA标签是蛋白质二硫键异构酶，能够增加目标蛋白溶解度，有助于形成二硫键。

这三种标签，主要用于改善目标蛋白的表达，本身不用于纯化，必须与另一个亲和标签联用方可实现蛋白质纯化。而且这三种标签均具有细胞周质定位作用，因此一般融合在目标蛋白N端。这三个都属于大标签，可能会影响融合蛋白的性质，一般来说纯化后需要去除。

示踪标签主要是指利用标签本身的荧光或者催化底物发射荧光或者可见光，来检测目标蛋白在生物体内定位、转移、互作的情况。示踪标签一般分子量较大，需要在标签与目标蛋白之间加Linker序列，避免两个蛋白相互影响各自的功能。示踪标签可与检测标签联用，用于目标蛋白的检测分析，也可与纯化标签联用用于后继纯化。

1) GFP、EGFP、YFP

GFP（Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白）标签含有 238 个氨基酸，分子量约为 26.9 KDa，在维多利亚多管发光水母中发现的，在紫外线的照射下会发出绿色的荧光的蛋白，与靶蛋白融合后不会显著地影响天然蛋白质的组装和功能。EGFP 标签是增强型绿色荧光蛋白，与 GFP 相比，具有更高的折叠效率（由于正确折叠的蛋白质比例更高而增加的荧光），荧光强度更强、荧光性质更稳定。YFP（Yellow Fluorescent Protein ，YFP）标签，可以看做绿色荧光蛋白的一种突变体，其荧光向红色光谱偏移。这些标签与目标蛋白融合后，可以通过激光共聚焦显微镜，观察融合蛋白在生物体内的情况，常用于亚细胞定位、荧光共定位分析、在体荧光成像等实验。示踪标签可以加在目标蛋白的N端或C端，这个要视具体的情况而定，比如细胞定位示踪，如果定位序列位于目标蛋白N端，标签就要加在C端；如果定位序列位于C端，标签就要加在N；如果定位序列位于中间，可以加在N端或C端。

2) 萤光素酶

萤光素酶（Luciferase，Luc）常作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶，他们可以催化荧光素底物发射荧光，作为示踪标签常用于活体成像、药物分析等领域。携带荧光素酶标签（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大小鼠体内，之后注入荧光素底物，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

3) Gus

Gus标签，是细菌β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase），能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，初始产物并不带颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝染料，此靛蓝染料使具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色，可用肉眼或在显微镜下观察到。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因。用作融合标签时，gus标签可放在目标蛋白的N端或C端，所产生的融合蛋白一般仍具有GUS活性，这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件。

当然不是，几乎任何标签都可以作为检测标签。不过上面这些标签应用比较广泛，检测灵敏度较高，对应抗体、试剂等也比较成熟，是最为常用的检测标签，在加检测标签时，可以作为首选。

当然也不是，检测标签、纯化标签、示踪标签，在功能上没有绝对的界限，所有的检测标签也可以用于纯化，只不过需要先制备对应的抗体固定到纯化基质上，比如S标签需要S蛋白固定到纯化树脂上，这就需要购买专门的纯化柱料，十分昂贵。当然也可以采取通用的做法，比如通过protein A吸附抗体，再利用抗体吸附融合的目标蛋白，但是这样做纯化效率可能不太高，吸附能力也有限，而且成本较高（protein A柱料的价格是Ni-NTA柱料的5-10倍），虽然这种方法可以得到极高的纯度，但并没有被普遍采用。

标签选好了，那到底是该加在N端还是C端呢？在较多的报道中，标签一般加在目标蛋白的C端，因为蛋白质折叠是从N端开始的，加在N端有被目标蛋白包埋的风险。但是，目前没有统一的标准，要具体情况具体分析，最好参阅相关文献。

一般检测标签都是小标签，对目标蛋白的功能与结构影响不大，N端C端皆可。需要注意的是采用双标签的情况，如果是两个小标签，那就一边一个，一般不建议串联两个不同的标签，比如一个3×Flag检测标签，一个His纯化标签，那就应该把3×Flag放在N端，His放在C端，因为纯化之后大概率需要切除3×Flag，如果两者交换位置就无法实现这样的目的。

His标签是应用最广泛的标签，既可以用于纯化也可以用于检测，而且大多数情况不需要切除，加在N端存在提前终止翻译和无法终止翻译的可能，产生的副产物不利于分离纯化；加C端时存在次级翻译起始的可能，产生的副产物也不利于分离纯化，双端His有利于目标蛋白的准确检测与纯化，但可能影响酶的活性。

纯化标签分子量较大，多数情况下要被切除，因此一般放在目标蛋白N端，检测标签放在C端，如过必需将大的纯化标签放在C端，检测标签可放在目标蛋白N端或者融合蛋白C端。但检测标签不能放在目标蛋白与纯化标签之间。

对于GFP标签，大多用于目标蛋白的细胞定位，应此标签的位置就由定位序列位置决定，定位序列在C端，GFP就应该放在N端，检测标签应该放在GFP的N端；反之，GFP应放在C端，检测标签放在GFP的C端。

当融合标签对目标蛋白的功能与结构没有影响时，不需要切除融合标签，这不是只针对小标签，大标签如GST、MBP等也是如此，NEB公司纯化的一些核酸工具酶就是融合了MBP标签的，我曾融合表达了MBP-APOBEC3A，MBP并不影响APOBEC3A的C→T活性，基因编辑技术中的AE和CE点编辑系统，就是基于Cas蛋白与APOBEC蛋白各自的功能实现的。两者分子大小相差极大但功能互不影响，就是因为各自的功能结构域折叠比较稳定，且无蛋白质间相互作用。如果融合标签与目标蛋白也满足这种关系，基本是不用去除标签的，不过这种影响是不可预料的，可以参考相关文献或者做预实验确定。

常用的去除蛋白标签的蛋白酶，及其识别序列如下表。

[1] Protein tag[维基百科], https://en.wikipedia.org/wiki/Protein_tag

[2] Kimple M E, Brill A L, Pasker R L. Overview of affinity tags for protein purification[J]. Current protocols in protein science, 2013, 73(1): 9.9. 1-9.9. 23.

[3] Marintcheva, B. Viral Tools for Protein Expression and Purification. Harnessing the Power of Viruses, 2018, 103–131.

[4] Terpe, K. Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 60: 523–33.

[5] Nilsson, J. et al. (1997) Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins. Protein Expr. Purif., 1997, 11: 1–16.

[6] Malhotra A. Tagging for protein expression[M]//Methods in enzymology. Academic Press, 2009, 463: 239-258.

荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因，具有检测灵敏度高，没有信号背景，并且不损害植物的优点。

来自维多利亚水母的绿色荧光蛋白（green：fluorescent：protein，GFP）是一种由238个氨基酸残基组成的单体蛋白，分子量27ku。它的特点是无需额外添加任何底物、酶、辅助因子等物质，也没有种属、组织和位置特异性，该基因是目前惟一在细胞内稳定表达且检测简单，结果真实可靠的新型报告基因，只要暴露于395nm的远紫外光或490nm的蓝光下便可受激而发出绿色荧光（508nm）。

通过突变与重新合成，将水母的密码子换成植物偏爱的密码子，GFP基因在植物中的表达效率与稳定性提高。而且，含此修饰GFP基因的转基因植物不仅形态正常，而且完全可育。

GFP就是绿色荧光蛋白，YFP就是Thr203以Tyr取代，发出黄色的荧光，成为黄色荧光蛋白

因此两者最大的区别则是发射波长了

亚细胞定位用YFP或者GFP都是可以的

需要考虑：

如果是标记在N端很可能影响定位

如果是红色的探针，选用绿色GFP比较经典，两者叠合的橙色也是很多文献上常采用的。但如果是蓝色的探针，则选用黄色YFP比较容易区分一点

骨架和细胞分裂

Kevin Sullivan's 实验室

酵母菌内SPB 和微管动力学

酵母菌中肌动蛋白的动力

果蝇中MEI-S332蛋白

果蝇有丝分裂和mRNA运输

网丙菌属细胞骨架

RNA剪切因子的核内运输

网丙菌属的趋化作用

网丙菌属中细胞骨架动力和细胞运动

核动力

网丙菌属中细胞动力

细胞骨架动力和胞内运输

动力学和泡囊运输

用GFP显示小囊运输

用GFP观察TGN运输

细胞骨架动力学和胞内运输

发育生物学

用GFP观察线虫的神经发育

分析果蝇神经发育的不对称性细胞分裂

线虫Lin-14

Fischbach lab

用GFP观察网丙菌属的形态发生学

GFP在小鼠发育中的标记方法

生物技术中的应用研究

1．分子标记

作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。

除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。

2．药物筛选

许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。

在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出哪些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。利用这一原理，已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR）的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段内被证实，根据荧光分布即可推断哪一种药物具有与hGR配体相类似的功能。利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。

3．融合抗体

近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体（杂交瘤技术一单克隆抗体）发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。单链抗体（Single-chain variable fragment，ScFv）是研究得较多的一种小分子抗体，其优越性在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。

由于技术上的的原因，一般融合抗体均置于原核表达系统如E.coli中表达。为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题。由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体。若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。

4．生物传感器

蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上来设计生物感受器。绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。第一个基于GFP的生物感受器为Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki几乎同时提出。这一感受器原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发生荧光共振能量转移。但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化，为克服这一缺点，人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到GFP上以构建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根据这一原理将TEM1 β-内酰胺酶(Bla）融合到GFP上。当缺少目标分子时，GFP处于静止状态不会产生荧光。但是当目标分子β-内酰胺酶抑制蛋白（BLIP）与Bla结合后，即使GFP活化产生荧光，而这一变化很容易被检测到。将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。

肿瘤发病机制的应用

GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。

在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。

肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP 的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。

在信号转导中的应用

新近研究发现，某些突变的 GFP 能够发生荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer,FRET）。FRET 是一种从荧光分子的激发状态到临近基态接受分子之间量子力学能量转移的现象。FRET 发生的前提条件是，荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量。如果供应分子和接受分子相互定位在几个纳米之内，则非常利于 FRET 的产生。因为 FRET 对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感 （在纳米范围内）。两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。由于 FRET 能量转移并非是 100 % 的效率，一个实用而有效的检测 FRET 的方法是，仅仅激发荧光供应分子，然后计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率。比值的变化是一个理想的观测细胞动态变化的指标。因为它消除了 GFP 分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的绝对效率等的影响。利用 FRET 可以作成 GFP 依赖的生物探针，现已有研究人员设计大分子或分子配对物来改变 GFP 之间原有生理信号反应的 FRET。

研究发现可以通过调节 GFP 来改变 FRET。把一个释放蓝色荧光的 GFP 融合到一个绿色荧光 GFP 突变体上，并在它们之间介入一个蛋白酶敏感的间隔子,这两个 GFP 恰好可以发生 FRET，当加入蛋白酶时，间隔子被切除，两个 GFP 之间的距离发生弥散性改变，FRET 被完全阻断。该实验提示我们，可以通过偶联 GFP 到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子，来动态观测活细胞的生理功能。

在上述实验基础上，研究人员开始设计 FRET 依赖的 Ca 2+ 敏感指示剂，其设计原理是，钙调蛋白 (CaM) 通过肌球蛋白轻链激酶(MLCK) 结合到 CaM 结合区。蓝色荧光蛋白和绿色荧光蛋白通过 CaM 和 MLCK 区域融合在一起，当 Ca 2 + 增多时，形成更多的 Ca 2+ - CaM 复合物，并从 MLCK 结合到 CaM 结合区域。该实验发现，通过改变两个 GFP 之间的距离，可以增加 FRET。另有一些研究人员，并没有把两个 GFP 融合在一个单一结构中，而是把一个 GFP 融合到 CaM 上，另一个 GFP 融合到 CaM 结合区域。结果发现，当 Ca 2+ 结合到 CaM 上，出现分子间异源二聚体，两个 GFP 足够接近而产生 FRET。这个实验提示了一个非常重要的现象，即 FRET 不仅可以在分子内发生，而且还可以在分子间发生。

最近，有学者用 GFP 依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学，通过利用带有 GFP 标记的蛋白激酶 A 转染细胞，观测有关 cAMP 的动态荧光变化。通过融合蓝色荧光 GFP 到调节亚单位或融合绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位，设计出了 cAMP 传感器。当 cAMP 浓度很低时，两个荧光分子距离很近，并出现 FRET，如果增加 cAMP 浓度，发生 FRET 的可能性急剧下降。利用该方法，可以检测出 cAMP 的动态变化,并开创了在整体条件下，研究 cAMP 调节信号转导途径的新方法。

GFP 的结构虽然具有高度完整性，但是实验中发现，在 GFP 中某些确定的位置，插入外源基因，完全没有丧失其荧光性。当把 CaM 插入黄色荧光 GFP 突变体中，得到 Ca 2+ 传感器，当 Ca 2+ 结合到 CaM 上，导致生色团去质子化，使荧光强度增加 7 倍。当在黄色荧光 GFP 中插入一个 Zif268 锌指结构，可以得到传导 Zn 2+ 的 GFP，结果发现荧光少量增加，为改变前的 1.7 倍，K d 值约 0. 4mmol。插入外源基因致使 GFP 荧光敏感性增强的现象，提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导的新路径。

光伏发电

瑞典研究人员不再盯着植物作为样板，转而将目光投向拥有高超光伏转化能力的水母，开发出提升收获太阳能的技术。利用水母身上提取的绿色荧光蛋白（GFP），该小组制作的装置可用这些“黏黏绿”将紫外光转化为自由电子。该小组制造的电池由在二氧化硅基底上被一个小缝隔开的两个简单的铝电极组成，GFP置于两电极中间并起连接作用。当把紫外光放进来的时候，GFP不断将光子抓走，并产生电子进入电路产生电流。同时，GFP非常廉价，不需要昂贵的添加剂或昂贵的加工，此外，它还能被封装成独立的不需要外光源的燃料电池。科学家相信，此能源装置缩小后可用来驱动微小的纳米设备。

神经生物学

神经极性发育

tracking intracellular transport of peptide neurotransmitters using GFP Allen Lab

Enhancer trapping using tau-GFP as reporter localized to axons

其他应用

Cell surface organization in Natural Killer cells Dan Davis

localization of calmodulin in S. pombe with GFP

GFP-plakoglobin and expression plasmids Klymkowsky lab

Molecular Motion Laboratory Yale University

Measuring diacylglycerol in vivo with a GFP-PKC chimera Tobias Meyer

Bentley Lab using GFP for on-line bioprocess monitoring &control

Tracking viral proteins with GFP fusions

GFP vectors and technology

Clontech Inc.Supplier of constructs for making GFP fusions

DeltaVision 3D microscopy platform optimized for imaging GFP in living cells in real time

GFP Expression Truly Amazing Web Site about GFP technology

Universal Imaging Corp. makers of the MetaGFP image processing platform

Quantum Biotechnologies IncSuppliers of GFP and BFP constructs

GFP in Arabidopsis

BabCo/Covance antibody to GFP

Lightools GFP plate illumination systems

GFP in Chlamydomonas

Other Interesting GFP Links

GFP Resources for Teachers

Picture of Aequoria victoria,source of GFP

Structure of green fluorescent proteinFull text of Yang et al Nature Structural Bio paper

Table of GFP mutant forms

Optics in Cell Biology

应用前景

野生型 GFP 合成后需经一定的折叠过程形成正确构象后才有功能，而且在 470 nm 处的荧光强度相对较低。为了改善 GFP 荧光特性 （如摩尔吸收值及释放波谱），对 GFP 进行了突变和重组实验。Chalfie 等 通过测定大肠杆菌和线虫体内重组 GFP 的荧光光谱发现，它和提纯的天然 GFP 光谱完全一致。突变实验发现，多数突变导致 GFP 部分或完全丧失荧光活性，但某种突变使 GFP 明显地改变激发和释放波谱。例如用 The 替代 Ser 65，在 490 nm 处出现一个单一激发峰值，激发后产生的荧光强度是野生型的 6 倍，对光淬灭具有更强的抵抗性，并且出现红移现象，该突变蛋白质与 FITC 的性质相似 同样 Leu 替代 Phe 64，即增加 GFP 的可溶性，荧光强度增强 35 倍。3 个氨基酸同时突变时，在 360 nm 至 400 nm 之间，出现最大激发峰，而且增大生色团形成的机率，可溶性更强，荧光强度为野生型 GFP 的 18 倍。现有人认为，低浓度 GC 含量是 GFP 低表达的原因之一，为此，研究人员合成了高 GC 含量的特殊 GFP，并且发现这种 GFP 有更强的荧光强度。此外，用人蛋白质中偏爱的密码子替代相应的野生型 GFP 中密码子可提高 GFP 在哺乳动物中的表达效率。许多 GFP 突变蛋白，不仅改变了激发和释放波谱，而且提高生色团形成的效率、溶解度、蛋白质表达等。

不同的突变体给应用提供了更广阔的前景，但是也发现某些突变体在生理变化的 pH 值范围内显示了更大的敏感性。研究人员利用一个 pH 敏感的 GFP 突变体检测细胞质、细胞核、高尔基体和线粒体基质中的 pH 值，发现在这些区域测量到的数值与以前报道的测量值有非常好的吻合。GFP 依赖的 pH 检测子，与小分子染料不同，这种检测手段不必考虑染料渗透、环境水解等一系列问题，且 GFP 具有高度选择定位性，适合于所有对于基因转染敏感的细胞。更重要的是，这个实验说明利用组织特异性启动子GFP 检测特定组织,通过融合到目的蛋白，可以检测特定类型的细胞、细胞器或特定的细胞内区域中的 pH 值。这样开创了检测以前所不能到达部位 pH 值的可能性。

荧光蛋白已有非常广泛的应用，GFP 可应用于转染细胞的确定，体内基因表达的测定，蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测，免疫分析、核酸碱基探针分析，以及分子间第二信使钙离子和 cAMP 水平的指示，细胞间隙pH 变化的检测。另外，GFP 也可以和其他蛋白质形成融合蛋白，作为基因治疗检测指标。但是，GFP 在应用中还发现有许多问题亟待解决 :⑴荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难，⑵多数生物具有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，这个荧光背景会影响某些 GFP 的检测，⑶实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株，可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关，(4)另外，需要注意，由于GFP本身分子量较大，以融合蛋白形式表达的GFP有可能对蛋白本身的细胞定位等特性产生影响，在使用GFP作为标签时需要进行仔细分析。

[编辑本段]1.美籍华裔化学家

2008年度诺贝尔化学奖获得者之一

个人简介

姓名：钱永健 英文：Roger Yonchien Tsien.罗杰钱

性别：男

出生：1952年5月

生于：纽约 成长：新泽西州利文斯顿 国籍：美国 祖籍：中国浙江杭州

父亲：钱学榘，美国波音公司的工程师（与钱学森同系钱王第34世孙） 母亲：李懿颖

舅舅：麻省理工学院的工程学教授。

哥哥：钱永佑（Richard Tsien），神经生物学家，美国科学院院士，斯坦福大学教授、曾任生理系主任

堂兄：钱永刚（钱学森的长子），解放军某研究所高级工程师、上海交通大学兼职教授

荣誉：

1968年，即以金属如何与硫氰酸盐结合为题获西屋科学天才奖 （The Westinghouse Science Talent）

1972年，拿了美国国家优等生奖学金进入哈佛大学获学士（化学和物理，Witha National Merit Scholarship）

1977年，获得剑桥大学博士及博士后（生理学）。

1981年，钱永健来到加州大学伯克利分校，并在这里工作8年，成为大学教授。

1989年，钱永健将他的实验室搬到加州大学圣迭戈分校，现在他是该校的药理学教授以及化学与生物化学教授。

1995年，当选美国医学研究院院士，

1998年，当选美国国家科学院院士和美国艺术与科学院院士。

重要奖项

1968年，即以金属如何与硫氰酸盐结合为题获西屋科学天才奖 （The Westinghouse Science Talent）

1991年，帕萨诺基金青年科学家奖；

1995年，比利时阿图瓦－巴耶－拉图尔健康奖；

1995年，盖尔德纳基金国际奖；

1995年，美国心脏学会基础研究奖；

2002年，美国化学学会创新奖；

2002年，荷兰皇家科学院海内生物化学与生物物理学奖；

2004年，世界最高成就奖之一以色列沃尔夫奖医学奖。

2004年，获沃尔夫奖（Wolf Prize in Medicine），全美化学学会，蛋白质学会等多项大奖

2008年，与美国生物学家马丁·沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修2名科学家以绿色荧光蛋白的研究获得该年度诺贝尔化学奖。

【生物发光现象研究】

1994年，华裔美国科学家钱永健（Roger Y Tsien）开始改造GFP，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色。到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好，现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮。不过真发现的有用东西并不很多。成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白，包括红色荧光蛋白。

生物发光现象，下村修和约翰森以前就有人研究。萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin），有化学反应如氧化，以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修和约翰森的研究。

下村修和约翰森用过几种实验动物，和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母。1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班要回家了，他把产物倒进水池里，临出门前关灯后，依依不舍地回头看了一眼水池，结果见水池闪闪发光。因为水池也接受养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响水母素，不久他就确定钙离子增强水母素发光。1963年，他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系。其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。

1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光，但不知其因。在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，他们纯化到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白GFP。Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中知道的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。

下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。他离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后，同事普腊石(Douglas Prasher)非常感兴趣发明生物示踪分子。1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物学研究者就很好应用，比用蛋白质方便多了。

普腊石1992年发表GFP的cDNA后，不做科学研究了。他申请美国国家科学基金时，评审者说没有蛋白质发光的先例，就是他找到了，也没什么价值。一气之下，他离开学术界去麻省空军国民卫队基地，给农业部动植物服务部工作。当时他如果花几美元，就可以做一个一般研究生都能做，但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内，比如细菌里，看到荧光，就完全证明GFP本身可以发光，无需其它底物或者辅助分子。

将GFP表达到其它生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。

水母素和GFP都有重要的应用。但水母素仍是荧光酶的一种，它需要荧光素。而GFP蛋白质本身发光，在原理上有重大突破。

Chalfie的文章立即引起轰动，很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，其实不过是跟风性质，没有原创性。

纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修和约翰森的研究遥遥领先，而很少人注意。如果其他生化学家愿意，他们也可以得到水母素和GFP，技术并不特别难。在1974年以后，特别是八十年代后，后继的工作，很多研究生都很容易做。其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜色，并非显而易见。

研究内容

钱永健是和下村修研究相关的一位重要科学家。他在成像技术中，有两项重要工作都与下村修有一定关系。

第一项是钙染料

1980年钱永健发明检测钙离子浓度的染料分子，1981年改进将染料引入细胞的方法，以后发明更多、更好的染料，被广泛应用。检测钙的方法有三种：选择性电极、水母素、钙染料。在钱永健的钙染料没有出现以前，具有空间检测能力的只有水母素，但当时水母素需要注射到细胞内，应用不方便，而钱永健的染料可以通透到细胞里面去。水母素和钙染料各有优缺点，目前用染料的人多。钱永健还发明了多种染料用于研究其他分子。

第二项是GFP

1994年起，钱永健开始研究GFP，改进GFP的发光强度，发光颜色（发明变种，多种不同颜色），发明更多应用方法，阐明发光原理。世界上应用的FP，多半是他发明的变种。他的专利有很多人用，有公司销售。

钱永健的工作，从八十年代一开始就引人瞩目。他可能是世界上被邀请给学术报告最多的科学家，因为化学和生物都要听他的报告，既有技术应用、也有一些很有趣的现象。他1952年出生，年龄允许等很多年（而80高龄的下村修没有这个优势）。所以，钱永健多年被很多人认为会得诺贝尔奖，可以是化学、也可以是生理奖。必须指出，钱永健非常肯定下村修的工作，钱较早公开介绍下村修的发现。

两兄弟分别获Rhodes和Marshall学者奖（通常认为是美国大学生竞争性最强的两个奖学金，克林顿总统曾获Rhodes）.

钱学森堂侄与两位美科学家共享诺贝尔化学奖

中新网10月8日电 综合报道，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会于当地时间10月8日11时45分左右(北京时间10月8日17时45分左右)宣布，将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·查尔菲Martin Chalfie，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人在发现绿色荧光蛋白方面作出突出成就。他们三人将分享诺贝尔奖金。

下村修和Martin Chalfie分别出生于1928年和1947年。他发明多色莹光蛋白标记技术，为细胞生物学和神经生物学发展带来一场革命。

按照传统，2008年诺贝尔奖颁奖仪式将在今年12月10日举行。生理学或医学奖、物理学奖、化学奖、文学奖和经济学奖都将在瑞典首都斯德哥尔摩举行。今年诺贝尔奖每项奖金仍为1000万瑞典克朗(约合140万美元)。

颁奖盛况

瑞典皇家科学院常任秘书贡诺•厄奎斯特首先宣读了获奖者名单。他说，这三位科学家因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而获奖。他们将平分诺贝尔化学奖奖金1000万瑞典克朗（约合140万美元）。 随后，化学奖评选委员会主席贡纳尔•冯•海伊内和评委莫恩斯•艾伦贝里分别介绍了三位获奖者的成就。他们说，绿色荧光蛋白是研究当代生物学的重要工具，借助这一“指路标”，科学家们已经研究出监控脑神经细胞生长过程的方法，这些在以前都是不可能实现的。

他们说，下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出绿色荧光的蛋白质，即绿色荧光蛋白。随后，马丁•沙尔菲在利用绿色荧光蛋白做生物示踪分子方面做出了贡献；钱永健让科学界更全面地理解绿色荧光蛋白的发光机理，他还拓展了绿色以外的其他颜色荧光蛋白，为同时追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。

在记者招待会上，厄奎斯特拨通钱永健的电话向他表示祝贺。钱永健在回答新华社记者提问时说，华裔科学家获得诺贝尔奖会令华人感到骄傲和自豪，也能激励更多中国年轻人投身于科研事业。钱永健还对在场媒体表示，他很高兴能够成为今年的获奖者，虽然之前也有传言，但这确实出乎预料。

钱永健的研究历程

拥有“世界上最美丽的大脑”

在获奖名单公布前夕，钱永健在电话中被告知他获得了2008年诺贝尔化学奖，并被邀请参加12月将在斯德哥尔摩举行的颁奖典礼。这无疑是钱永健至今为止获得的最重要的奖项。

此前，钱永健已获得无数有“含金量”的专业奖项，其中包括2004年获得的有“诺贝尔指针”之称的沃尔夫医学奖。此外，他还拥有不少于60项的美国专利发明。

凭借化学与生物方面的天分，钱永健找到了让绿色荧光蛋白更亮更持久发光的方法，并创造出了更广泛的荧光蛋白色彩，包括黄、蓝、橙等颜色。“我总是被色彩所吸引，”钱永健说，正是色彩，让他的工作更有趣，“当工作进展得不顺利时，因为色彩，我可以把工作继续进行下去。如果我天生是色盲，估计我不会取得今天的成就了。”

钱永健的天分与成就是圈内人士公认的。钱永健长期的合作者、美国加州大学圣迭戈分校国家显微成像与研究中心的主任马克·爱利斯门说，钱永健是他见过的最聪明的人。

他在接受《圣迭哥联盟论坛报》采访时这样评价钱永健：“他拥有世界上最美丽的大脑，不仅因为他能够深入思考如何填补已知科学领域的空白，更因为他知道如何发现新问题。他挖掘得很深，理解问题又快，还擅长把问题的各部分统一起来看，发现新的研究工具，以此帮助其他科学家挖掘其它新问题。”

对此，钱永健谦虚地强调自己并不是荧光蛋白的发现者，“我只是那一个制造工具的人。”

曾几度“转向”最终回归化学

钱永健因为其在荧光蛋白研究领域的成果，被授予诺贝尔化学奖。其实，兴趣广泛的他，并非从一开始就选择了这条道路。

钱永健是一个拥有广泛兴趣的人。因为气喘，小时候只能待家里，由于对化学的爱好，于是他就在自家的地下室，搭起自己的“小化学实验室”，摆弄瓶瓶罐罐。16岁时，钱永健还获得西屋科学天才奖，当时他研究的是如何将金属融进硫氰酸。这个“西屋科学天才奖”是全美最久远，也是最负盛名的科学类比赛，获奖者经常被看作是“小诺贝尔获得者”。之后，他又通过获得的西屋奖学金，进入哈佛大学念书。

虽然成绩出色，但钱永健也有过对化学厌倦的时刻。在哈佛大学求学时，他就对呆板的课程设置颇为不满，所以自己上了不少钢琴课。

而在剑桥大学继续深造时，他想做一些更有意思的事，所以从化学转到了分子生物学，又转到了海洋学。“我总有一些关于在蓝色大海上航行的梦想，但是结果表明，我的工作和这个美梦无关。我的研究包括测量海湾的石油污染状况。最后，我终于明白，我根本不关心藻海的深度问题。”

于是，钱永健又从海洋学转到了生理学，并获得博士学位。当时，他的研究主要侧重于人脑，这对于他来说更有研究的乐趣。

在钱永健看来，人脑是一部让人心醉的织布机，“它需要更为熟练、更为精细、更有创造性的方法把碎片拼织起来。”此后，他又“回归”化学，开始了自己对于绿色荧光蛋白的研究之路。

对自己的癌症研究充满信心

美国国家幼儿健康与人类发展学会的细胞器生物学负责人杰尼佛说：“钱永健有巨大的影响，正是他，展示了以绿色荧光蛋白为基础的反应物的一系列应用可能，并且方便这一切在生物学界的使用，钱博士对于细胞生物的发展起到了至关重要的影响。”

绿色荧光蛋白目前正受到科学界越来越广泛的关注。而在1992年以前，关于绿色荧光蛋白的科研文章寥寥无几，但仅去年，根据统计，与绿色荧光蛋白或荧光蛋白相关的科研文章达到12000篇。有科学家预测，这一数量还将持续增长。

钱永健对于荧光蛋白是否可以用在神经生物学以及癌症攻克方面有特别兴趣。他的父亲就是因为得癌而死。“他得了胰腺癌，诊断出来6个月后，他就离开了我们。”

虽然钱永健在荧光蛋白的研究领域已有了革命性贡献，但他已计划把这类工作留给他的同事，而把更多时间和精力用在人体状况的研究方面，包括攻克癌症、动脉粥样硬化以及中风之类疾病。

钱永健坦言，自己对癌症的研究可能没有任何结果。“科学的历史上，到处都是科学家在一项研究上成功，而在另一项研究上失败的例子。”

不过，钱永健还是对自己的研究充满信心，因为动物实验已表明这项研究是有成功希望的。

生平

钱永健1952年出生于美国纽约，父亲是一名机械工程师，舅舅们在麻省理工学院当工程学教授。童年时代的钱永健就显露出科学天赋。

由于儿时患有哮喘，钱永健不得不尽量避免室外运动。他经常花上数小时在地下实验室中做化学实验。实验产生的鲜艳色彩让他着迷。

16岁那年，凭借一个金属易受硫氰酸盐腐蚀的调查项目，钱永健在美国全国性奖项“西屋科学人才选拔赛”中获一等奖。这项比赛现名“英特尔科学人才选拔赛”，是美国历史最久、最具声望的科学竞赛，参赛者以高中生为主，又称“少年诺贝尔奖”。

钱永健1972年获哈佛大学化学和物理学士学位，时年20岁。

有机染料

在英国剑桥大学读研究生时，钱永健发明出一种更好的染料，可追踪细胞内的钙水平。

钙在多种生理反应中扮演关键角色，包括神经冲动调节、肌肉收缩、受精作用等。不过，计量细胞内钙水平的方法当时还相当原始，需要穿透细胞壁注射钙结合蛋白，这种方法通常会毁坏研究细胞。

钱永健利用化学技术发明出有机染料，与钙质结合时会戏剧性地改变荧光。

此外，钱永健还找到了为钙质“上妆”的方法，使染料无需注射即可穿透细胞壁。

钱氏家族的传奇

钱永健的父亲钱学榘与钱学森是堂兄弟，两人均毕业于上海交通大学，并赴美国留学。对于家族的长辈钱学森，钱永健非常推崇。去年在接受《细胞生物学杂志》采访时，他特意提到，母亲和父亲的家族中有很多工程师，其中，钱学森是中国原子弹项目的负责人。

1952年，钱永健出生在纽约。或许是家学渊源，他打小就对科学产生兴趣。读小学时，父母给他买了化学实验玩具，但他觉得不过瘾。后来，钱永健在学校图书馆发现一本化学书，里面讲到怎么将紫色的溶液变成绿色，他于是被化学深深吸引。读高中的时候，他家地下室已经摆满瓶瓶罐罐。兄弟俩甚至悄悄制造火药，结果不慎起火，烧到乒乓球桌。尽管出现了事故，父母并没有阻止孩子们的化学实验，钱永健也只是将实验地点搬到室外的混凝土露台。

16岁时，钱永健凭借美国科学基金会资助的一个化学项目，获得专为中学生设立的西屋科学奖。不过，钱永健在哈佛大学就读时，并不喜欢当时的化学教学方式，兴趣开始向神经科学转移。后来，他获得奖学金，将前往英国剑桥大学攻读博士，其指派的导师是理查德·阿德里安（Richard Adrian）。

当时，钱永健的大哥钱永佑（Richard Tsien）刚好从英国牛津返回。钱永佑后来在斯坦福大学任职，并且和钱永健一样成为了美国科学院院士。钱永佑告诉弟弟，阿德里安是一位研究肌肉的电生理学家。钱永健顿时愣住了，因为那时他想研究的是大脑。

不过，阿德里安给了钱永健极大的自由度，钱永健开始研究如何观察大脑的神经信号网络。1980年，钱永健发明出检测钙离子浓度的染料分子。钙离子是生物体内的重要信号分子，因此，钱永健的这一发明被广泛应用于生物体内成像技术。很长一段时期，生物学家们忽视了钙离子的化学问题，化学家不了解钙离子信号的生物意义。兼具化学和生物背景的钱永健，则在多次失败之后有所斩获。

两年后，钱永健与漂亮的姑娘温迪（Wendy Globe）成婚。

Q939.94 兽医微生物学

S831.5 饲料与营养

TS201.3 食品微生物学

也可以自己去查：http://www.ztflh.com/

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关键词:钙信号特异性�

研究报告

超干贮藏对芥兰种子生活力和活力的影响�

提要:1年的监测结果显示：芥兰种子开放贮藏时的生活力和活力下降最快，超干种子（含水量为4.91%、3.25%和2.84%）具有良好的耐藏性，其种子发芽率和简化活力指数增大，抗老化能力、超氧物歧化酶和过氧化氢酶的活性增强，膜透性降低，以2.84%含水量的芥兰种子贮藏效果为最好。�

关键词:超干贮藏芥兰种子种子含水量生活力活力�

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几种影响N-甲基-N-亚硝基脲诱导向日葵叶绿体基因突变的生理因素

提要:用诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲（NMU）诱变向日葵种子时，温度、2,4-二硝基苯酚（DNF）、利福平（R）、KT、硝酸铵（AA）、二氨基苯甲酸（DABA）和处理时间都会影响NMU对向日葵叶绿体的突变诱导效果。突变诱导的最佳温度为15℃，2,4-二硝基苯酚、利福平、硝酸铵和二氨基苯甲酸明显降低花叶植株的频率，而KT则增加叶绿体突变的频率，在0.015%KT作用下，叶绿体突变频率由（8.5±2.9）%提高到（25.0±4.2）%。咖啡因（COF）对诱导叶绿体突变没有任何作用。�

关键词:N-甲基-N-亚硝基脲； 叶绿体； 基因突变�

异源三倍体黄瓜的离体繁殖和鉴定�

提要: 对甜瓜属双二倍体种（Cucumis hytivus� Chen and Kirkbride, �2n=4x=38）与栽培黄瓜“北京截头”（�C. sativus� cv. Beijingjietou, 2n=2x=14）杂交的种子进行胚拯救。假定为杂种植株的顶芽和腋芽用于离体繁殖的结果表明：在MS+2.2mg·L-1

6-BA和MS +3.0 mg·L-1 KT+0.2 mg·L-1 NAA培养基上诱导不定芽的增殖系数分别为6.53和6.63；丛生芽在MS+0.2 mg·L-1 6-BA的培养基上伸长，大约10 d后取整齐一致的芽用于生根，在1/2MS+0.2 mg·L-1 IBA上生根率达91.7%。田间组培苗的单性结实能力比“双亲”更强；果刺黑色，与C.hytivus相同；叶深绿色，不同于双二倍体特有的淡黄绿色而“北京截头”一致；花粉粒可染率不到10%，根尖体细胞染色体鉴定为为2n= 3x=26，从而确定其为异源三倍体黄瓜。�

关键词:远缘杂交异源三倍体离体繁殖黄瓜

马尾松树种失水的热动力学研究�

提要: 根据热重法研究不同产地的马尾松失水动力学的结果，提出单分子失水动力学假设，并推导出速率方程，所获得的速率方程与实验结果一致。在此基础上，根据过度态理论计算了活化熵和活化焓。�

关键词:马尾松； 树种； 失水动力学； 热重分析法�

蛋白核酸合成抑制剂和蛋白磷酸化对基因表达的调节�

提要:环己酰亚胺和放线菌素D明显降低小麦幼苗中BADH基因的表达，表明BADH基因表达在转录和转译水平上受到调控。 氯霉素则有增加表达的效应。 线粒体可能形成阻遏蛋白参与调节。 H7和甘露糖降低BADH基因表达，相应地冈田酸（Okadaic acid）明显增加表达，说明蛋白磷酸化积极参与小麦幼苗中BADH基因表达的调节。�

关键词:蛋白质合成； 核酸合成； 蛋白磷酸化； 抑制剂； 甜菜碱醛脱氢酶基因； 小麦�

氮肥对旱作小麦光合作用与环境关系的调节�

提要:土壤水分胁迫下，测定不同供氮小麦生理指标与环境因子的结果表明，25%的空气湿度是氮对作物调控的下限。在此值以上，增施氮肥可以提高光合速率适应高温和高湿的能力，扩大气孔导度受空气温度和湿度抑制的范围，提高叶片保水能力，从而增强小麦抗旱能力。�

关键词:氮素；小麦；净光合速率；气孔导度；气温；湿度�

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水杨酸提高香蕉幼苗抗冷性初探�

提要:0.5 mmol·L-1水杨酸（SA）明显减少香蕉幼苗叶片在5℃下的萎蔫面积，提高植株的抗冷性。在常温下，0.5 mmol·L-1 SA不影响SOD活性，但明显降低CAT与ASP活性，提高POD活性。在7℃低温胁迫及恢复期间，SA可诱导SOD、CAT及ASP活性上升。�

关键词:低温； 水杨酸； 香蕉； H2O2； 保护酶�

缺磷胁迫下不同长豇豆品种幼苗中IAA含量的变化

提要:缺磷胁迫下对缺磷敏感程度不同的3个品种长豇豆幼苗根中IAA含量均提高，二芦白升幅最大，芦花白次之，香港青最小；嫩茎叶中IAA含量都升高，香港青升幅最大，芦花白次之，二芦白最小。缺磷胁迫下长豇豆幼苗中IAA含量升高，并可能从地上部向根系运转，因而根冠比提高。�

关键词:长豇豆； 缺磷胁迫； IAA含量�

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花期减少施钙量对不同钙效率番茄果实钙形态和含量的影响�

提要:花期降低施钙量后，钙低效番茄品种L-402果实中钙含量显著降低，高效品种江蔬一号降低不显著，镁含量显著增加，钾含量有增加趋势。果实底端的钙含量高于顶端，降低施钙量后果实水溶性钙含量和比例显著提高，果胶酸钙含量和比例降低，磷酸钙含量也降低。钙低效品种L-402水溶性钙含量的增加，以及果胶酸钙和磷酸钙的降低程度，都大于高效品种江蔬一号，且降钙后果实顶端的草酸钙含量和比例增加。�

关键词:番茄果实； 低钙； 钙形态； Ca、K、Mg含量�

摘除雌花对甜瓜成熟叶片中糖及相关酶活性的影响�

提要:甜瓜有果株的成熟叶片中蔗糖、葡萄糖、果糖含量与无果株的无显著差异，水苏糖与棉子糖含量略低于无果株，肌醇半乳糖苷(合成水苏糖的前体)含量显著低于无果株，蔗糖磷酸合成酶（SPS）和肌醇半乳糖苷合成酶活性与无果株的无显著差异，水苏糖合成酶活性显著高于无果株。�

关键词:甜瓜； 库强糖； 酶； 转运�

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鲜茶叶摊放过程中呼吸速率、β-葡萄糖苷酶活性、游离态香气和糖苷类香气前体含量的变化�

提要:鲜茶叶在12 h摊放过程中，总的变化趋势是:随着摊放时间的延长，叶组织逐步失水；细胞的呼吸速率逐渐降低；内源β-葡萄糖苷酶活性明显提高；游离态香气的含量增加，摊放4 h最高，此后下降并稳定在这个相对低的水平上；糖苷类香气前体含量较鲜茶叶上升，特别是在摊放0~8 h期间，后期有所下降，在摊放10 h后与鲜茶叶中的含量相当。�

关键词:鲜茶叶； 糖苷类香气前体； β-葡萄糖苷酶； 摊放； 呼吸速率�

榛树种子的休眠和萌发�

提要:鉴定榛子各部分浸提液的结果显示，果皮、种皮及胚都存在导致休眠的抑制物质；榛树果实有一定的吸水性，据此推测种子休眠可能不是因果皮的不透水性造成；0.5、2、5 mg·L-16-BA可以解除种子休眠，促进萌发。�

关键词:榛树种子； 休眠； 萌发

技术 与方法

外源DNA导入烟草后D1代植株的蛋白质电泳分析

提要:检测使用花粉管通道技术向受体烟草NC89导入供体烟草CV87的总DNA后,得到的D1代植株及其亲本蛋白质的PAGE和SDS-PAGE的结果显示，供体、受体及D1代个体在PAGE和SDS-PAGE的谱带上存在多态性。供体有特征谱带，DZ9811和QD9812等个体表现了供体的特征谱带。�

关键词:烟草； 外源DNA导入； 蛋白质电泳； PAGESDS�PAGE�

用磷酸二酯酶定量检测植物钙调素方法的改进 �

提要:从磷酸二酯酶（PDE）提取方法、钙调素（CaM）测定反应时间、测定体系中的Ca2+和cAMP浓度、样品处理及活性计算等方面对叶正华等[1] 测定钙调素的PDE法作了改进。实验表明，改进后的方法使PDE的提取比较简便快捷，CaM检测过程中的误差减小，结果的准确性、重复性和可比性都更好，可用于多个样品的同时测定。�

关键词:磷酸二酯酶； 钙调素； 定量检测； 活性

信息与资料�

硝酸还原酶也是植物体内的NO合成酶

提要:一氧化氮 (NO) 是一种广泛存在于植物体内的氧化还原信号分子和毒性分子。文章介绍了近年来有关植物硝酸还原酶具有催化亚硝酸盐单电子还原合成NO功能及其调节机制和生理意义的研究进展。�

关键词:硝酸还原酶； 一氧化氮； 亚硝酸盐； 单电子还原； 合成�

专题介绍

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用�

提要:绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母(Aequoria victoria)体内的一种发光蛋白，近十年来成为在生物化学和细胞生物学研究和应用中用得最广泛的蛋白质之一。文章就绿色荧光蛋白的特性及其在植物分子生物学中应用的研究进展作了概述。�

关键词:绿色荧光蛋白； GFP； 变种； 植物分子生物学�

紫外线B辐射与植物体内酚类次生代谢的关系�

提要:概述了植物酚类次生代谢产物对紫外线B（UV-B）增强引起的辐射伤害的防御作用，酚类次生代谢与其它防护机制的相互关系。�

关键词:紫外线B； 酚类次生代谢； 防御