在植物育种过程中，可用不同化学物质（如EMS、秋水仙素）处理获得新品种，请分析回答以下问题．Ⅰ甲磺酸

基本信息：

中文名称

1-乙基-3-甲基咪唑鎓甲烷磺酸盐

中文别名

1-乙基-3-甲基咪唑甲基磺酸盐

英文名称

1-Ethyl-3-methylimidazolium

Methanesulfonate

英文别名

1-ethyl-3-methylimidazol-3-ium,methanesulfonate1-Ethyl-3-MethyliMidazoliuM

Methanesulfonate

CAS号

145022-45-3

上游原料

CAS号

中文名称

616-42-2

亚硫酸二甲酯

65039-09-0

氯化-1-乙基-3-甲基咪唑

75-75-2

甲烷磺酸

616-47-7

N-甲基咪唑

62-50-0

甲磺酸乙酯

下游产品

CAS号

名称

145022-45-3

1-乙基-3-甲基咪唑鎓甲烷磺酸盐

更多上下游产品参见：http://baike.molbase.cn/cidian/407033

分子基础：

一、自发突变(spontaneous mutation)

自发突变可能由复制错误、DNA损伤和转座作用等引起。

1.DNA复制错误(errors of DNA replication)

DNA碱基有互变异构体，造成DNA复制过程中的DNA错配。

（1）转换：Purine→ Pu或者 Pyrimidine→ Py

（2）颠换：Pu →Py或者Py→Pu

（3）移码突变：增加或减少几个碱基,导致蛋白质翻译错位。

（4）缺失和重复：大片段碱基的缺失或重复，如E.coli乳糖发酵调节基因lacⅠ中四碱基重复序列。

野生型： 5‘-GTCTGGCTGGCTGGC-3’

突变型FS5： 5‘-GTCTGGCTGGCTGGCTGGC-3’

突变型FS2： 5‘-GTCTGGCTGGC-3’

2、DNA损伤（lesions）

（1）脱嘌呤 由于碱基和脱氧核糖间的糖苷键受到破坏,从而引起一个鸟嘌呤或腺嘌呤从DNA分子上脱落下来.

（2）脱氨基 C脱氨基变成UA脱氨基变成H,：

AA­T →→ → H-T→→→ H-C→→→ H-C

↘→A-T ↘→G-C

BG­C →→ → G-U→→→ A-U→→→A-U

↘→G-C ↘→A-T

造成转换

（3）氧化损伤（oxidative lesions）: O2- OH- H2O2

可对DNA造成损伤

二、诱发突变（induced mutaion）

多种理化因素都可以诱导DNA的突变：

1、诱变机制

（1）碱基类似物 例：5-BU 和5-BrdU是胸腺嘧啶(T)的结构类似物，酮式结构易与A配对；烯醇式结构易与G配对。另有2-氨基嘌呤(2-AP, A类似物)、5- 氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶等。

（2） 特异性错配 例烷化剂: 甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍( NG)、芥子气等。通过改变碱基结构使碱基错配。

如：G-C当G烷基化后可与T配对，导致碱基转换。

或者烷化剂使嘌呤脱落，造成转换、颠换、断裂或其他突变

子 （3） 嵌合剂的致突作用

例 .吖啶类染料: 吖啶橙、吖啶黄素、原黄素等碱基对的类似物，易造成移码突变。

（4） 辐射诱导效应

①紫外线UV:形成嘧啶二聚体，如T二聚体，①同一条单链内，影响复制时与A的配对，使复制中止；②双链之间，影响双链变性，并影响复制。

重复、缺失、移码突变

②电离辐射：如X-ray、可引起碱基的降解或脱落，A变成HC变成T，出现转换。

物理——物理化学——生物化学——大分子损伤

ⅴ黄曲霉的作用

使鸟嘌呤G脱落，SOS修复引入A, 造成突变。

2、碱基替换的遗传效应

(ⅰ) 同义突变（samesense mutation）不改变氨基酸的密码子变化，与密码子的兼并性有关. 如GAU/GAC—Asp.

(ⅱ) 错义突变（missense mutation） 碱基替换的结果引起氨基酸序列的改变.

(ⅲ) 无义突变（nonsense mutation）编码区的单碱基突变导致终止密码子(UAG/UGA/UAA)的形成, 使 mRNA的翻译提前终止, 形成不完全的肽链.

如镰刀型贫血症：血红蛋白B链(146Aa)，6号氨基酸的替换, 导致明显的表型症状。Glu→Val, 若Glu →Asp则影响较小。

3、码突变及其产生

在基因的外显子中插入或缺失1, 2或4个核苷酸,使阅读信息发生错位,从而使翻译的蛋白质序列与原来完全不同. eg. E.coli中乳糖发酵的调节基因(lacⅠ):

野生型:5‘-GTCTGGCTGGCTGGC-3’

移码突变Ⅰ: 5‘-GTCTGGCTGGCTGGCTGGC-3’

移码突变 Ⅱ: 5‘-GTCTGGCTGGC-3’

4、突变热点和增变基因

基因中某些位点比其它位点突变率高，称突变热点。

例 分析T4-Phage r Ⅱ基因1500个突变体： r ⅡA (1800bp)有200个位点； r ⅡB (850bp)有108个位点 。

形成原因：

（1）、 5-MeC的存在，5-甲基胞嘧啶(MeC)脱氨基后变成T, 使G-C部位转变成A-T部位；

（2）短的重复序列的存在，容易配对错位，造成重复或缺失

（3）与诱变剂类型有关，不同诱变剂出现不同的热点。

（ 4）增变基因(mutator gene)：该基因的突变会使整个基因组的突变频率增高，例 A. DNA多聚酶基因，突变后使多聚酶的3’ → 5’校正功能降低或丧失，使基因组突变频率增高；

B. dam基因，突变后使碱基的错配修复功能降低或丧失，使基因组突变频率增高。

三、诱变与肿瘤

肿瘤的形成与否取决于机体中癌基因和抑癌基因的平衡，抑癌基因突变会致癌。一些诱变剂可以特异性的诱导抑癌基因突变，导致肿瘤发生。eg. 黄曲霉素、UV(ultraviolet)等。

黄曲霉素可诱导P53基因G → T颠换，导致肝癌的发生；

UV可诱导P53基因5’ -TC-3’发生C → T颠换，形成“T二聚体”，导致人类鳞状细胞皮肤癌的发生。

四、定点诱变

定义：利用人工合成的寡核苷酸，在离体的条件下，制造基因中任何部位的位点特异性突变的技术。

反义遗传学（reverse genetics）：合成—连接(单链M13)—复制—转化—检测

复制后相当于200%的DNA，其中后复制合成的DNA单链都不含C，

所以复制后的A占40%，G占60%，C占30%(因为后合成的不增加C的含量)，

T占剩下的70%，其中一条链中T占碱基总数的40%，所以另一条DNA中T占碱基总数的30%。

对于做分子生物学实验的人来说，293细胞再熟悉不过了。常在文献中看到不同的293名字，全然没考虑过293细胞原来还是团队作案，分身无数。

从文章中看到293细胞的谱系变化如下

在1973年，科学家从一个父母谱系不祥的人类流产胚胎的肾脏中分离出最原始的293细胞（human embryonic kidney (HEK) 293 cell line），该细胞被转入修改后的5型腺病毒DNA片段，一开始转化非常困难，一直到几个月后，科学家得到一个稳定的可以快速生长的293单克隆细胞株，自此HEK293 or 293细胞(ATCC CRL-1573)诞生。已知这个长达4.35 kb的腺病毒基因组片段已整合到宿主细胞的19号染色体中，并编码E1A/E1B蛋白，这些蛋白可干扰控制细胞周期的信号通路通路并抑制细胞凋亡。细胞遗传学分析证实293系假三倍体。 https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx#characteristics 为了方便起见，以下HEK293全用293来指代。

1985年，使用逐渐适应性培养的方法（培养在低钙环境中），从293细胞中构建出了293S细胞。293S后面的S是suspension（悬浮）的缩写，顾名思义，293S就是悬浮的293细胞。而这个细胞的构建过程大约花费了7个月的时间。

2001-2002年293SG细胞出现，该细胞由293S经由甲磺酸乙酯（EMS）诱变得来，并筛选出蓖麻毒素抗性克隆。 该品系缺乏N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶I活性（由MGAT1基因编码），因此主要用于Man5GlcNAc2 N-聚糖修饰糖蛋白。 然后，获得含有TetR报告系统的糖工程细胞，可使用四环素诱导的蛋白表达。 该细胞系被广泛用于生产均一的N-糖基化蛋白，并被称为293SG。同时还有用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的293FTM和糖工程技术293SGGD细胞系（2010年）。

1985年，表达SV40 T抗原的温敏等位基因的293T诞生，这使得含有SV40 ori的载体得以扩增，从而显著提高瞬时转染的表达水平。SV40 T可与p53形成复合物并抑制p53，从而可能进一步损害基因组完整性。需要注意的是，由于SV40大T抗原的存在，该细胞对G418耐药，因此在使用该细胞进行试验的时候应避免使用G418作为抗性基因筛选。

简单小结：通过上面的描述，我们这里有一张更为详细的293细胞谱系图

（1） 293T/17由293T细胞中共转染入 pBND （从BAG质粒修改而来）和 pZAP （wild-type moloney virus，小鼠白血病病毒M-MuLV改造而来）质粒 而得。该细胞系在保有293T细胞的特性之外，由于逆转录病毒片段的插入，使得细胞可以用于 产高滴度的逆转录病毒 ，同时该细胞仍在对G418耐药。

（2）根据ATCC的介绍，293T/17 SF是悬浮状态的293T/17。由于SV40 T的存在，使其可以用于 提高瞬时转染情况下细胞的蛋白表达水平 。已经证实含有CMV启动子的表达载体在293T/17 SF细胞系中具有高水平的蛋白表达。但文献中图示提出293T/17 SF是由293T/17经由EBV病毒感染而来，但我没有找到相关证据，该文献也并未指出参考资料，有可能是图片指示不明。

寻找pZAP和pBND ，这两个质粒打到谷歌上都很难搜索出来，对于pZAP还好，而pBND只有在非常老的文章里面我才能找到一些踪影。通过研究者两个质粒的backbone以及文章描述，我们大概可以明白：（1）293T细胞具有SV40 T区域，使得带有SV40 ori质粒能够快速扩增；（2）在293T细胞中转入带有逆转录病毒元件+半乳糖苷酶(B-galactosidase)-SV40 promoter的质粒，结合SV40大T抗原，从此逆转录病毒产量得以提高。

将pCRIPenv-和pCRIPgag-2载体共转染到293T/17中，得到ANJOU 65细胞系。ANJOU 65细胞与pCRIPgag-2和pGPT2E载体共转染，获得BOSC 23生态型包膜表达包装细胞系。ANJOU 65细胞也与pCRIPAMgag载体和表达gpt耐药基因的质粒共转染，获得Bing(见ATCC CRL-11554)两性包膜表达包装细胞系。

293H细胞来自表达E1A腺病毒基因的HEK293细胞，具有更好的粘附性，可用于用于噬菌斑检测和其他依赖于anchorage dependent applications。

（1）在293H中插入EBNA-1（Epstein-Barr virus nuclear antigen 1，EBV病毒核抗原）基因得到293E，在稳定表达EBV’s EBNA1蛋白的细胞系中使用含有EBV oriP（EBV复制起点）的重组蛋白表达载体，可显著提高重组蛋白产量。

（2）293-6E是在293H细胞中插入缺少Gly-Gly-Ala重复区的EBNA1（EBNA1t）而得，Gly-Gly-Ala结构域的缺乏使得瞬时基因表达得到增强，蛋白表达能力提升。与HEK293-EBNA相比，其产生重组蛋白的能力增强。

293-F是293细胞系的一个快速增长的衍生细胞系，GIBCO说可以用于无菌悬浮培养。

293FT细胞由293F细胞系中插入SV40 large T antigen，其特点是增殖速度快，易转染，主要用于用于慢病毒的生产。此外需要注意，该细胞也是G418耐药细胞系。

Flp-In 293 T-REx细胞系是为了快速生成稳定的细胞系而设计的，它可以确保从Flp-In表达载体上获得的蛋白的均匀表达。这些细胞在转录活跃的基因组位点上包含一个稳定整合的FRT位点，有针对性的整合Flp-In表达载体，确保高水平目的基因。Flp-In t -293细胞系包含稳定整合的pFRT lacZeo和pcDNA 6 TR(来自T-REx系统)。用Flp- in表达载体和Flp重组酶载体pOG44共转染Flp- in细胞系，可将表达载体定向整合到每个细胞的同一位点，保证基因表达的同质性。（公司主页翻译而来）

293FTM细胞来源于Flp-In 293 T-REx 293细胞，该细胞系中转入了ecotropic receptor质粒和MAPPIT(哺乳动物蛋白-蛋白相互作用阱)报告质粒，该细胞系主要用于蛋白相互作用关系的研究。

综合来看，293细胞在转入SV40 T之后名字上会多一个“T”，该类细胞粘附生长并生长速度快，之后根据不同需求则有了不同的变体：（1）悬浮培养用293衍生细胞系，名字会加“S”或者“SF”，一般通过适应性试验得到；（2）高产逆转录病毒293细胞系，转入带有SV 40启动子以及含有小鼠白血病腺病毒片段的载体，使得细胞高产腺病毒；（3）用于产蛋白的293细胞；（4）用于包装慢病毒的293细胞；（5）用于构建特异性表达蛋白的293细胞。具体该怎么选择293细胞，心里有数了吧~

参考文献：