盐酸羟胺跟苯甲醛有什么反应

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 一、 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 、 （1）0.05mol/L 磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A 母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO4·12H2O（分子量 358.14）71.7g； B 母液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4·2H2O（分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到 1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取 A 母液(Na2HPO4) 228.75ml，B 母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至 1000ml。 参考文献： 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）14.5mM 甲硫氨酸溶液：取 2.1637g Met 用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至 1000ml。 （3）30?M EDTA-Na2 溶液：取 0.001gEDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至 100ml。 （4）60?M 核黄素溶液：取 0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至 100ml，避光保存。 （5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取 0.1840g NBT 用 PBS 定容至 100ml，避光保存。 酶液制备： （可视情况调整） 样品 （新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中， 酶液制备：取 0.2g 加入 1.6ml 50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8） 在冰浴上研磨成匀浆， 转入离心管中在 4℃、 12000g 下离心 20min，上清液即为酶液。 2、酶活性测定 、 （1） 反应混合液配制(以 60 个样为准)： 分别取 Met 溶液 162ml， EDTA-Na2 溶液 0.6ml， 磷酸缓冲液 5.4ml，NBT 溶液 6ml，核黄素溶液 6ml,混合后摇匀； （2）分别取 3ml 反应混合液和 30?l 酶液于试管中 （3）将试管置于光照培养箱中在 4000 lux 光照下反应 20min； 同时做两支对照管，其中 1 支试管取 3ml 反应混合液加入 30?l PBS（不加酶液）照光 后测定作为最大光还原管，另 1 支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测 OD560(出现颜色即 可测定)。 （5）酶活性计算：SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原 50％所需酶量（测的样品值要 在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为 1 个酶活单位（u） 。 SOD 总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD 比活力＝SOD 总活性/蛋白质含量 SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW） ；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示； Ack 为照光对照管的吸光度； E 为样品管的吸光度； 为样品液总体积 A V （ml,1.6ml， 加入 PBS 的体积)；Vt 为测定时的酶液用量（ml，30ul） ；W 为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体 的质量 mg） ；蛋白质含量单位为 mg/g。 二、POD、CAT 酶活性的测定 粗酶液制备同 SOD。 1、 过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法） 、 过氧化物酶（ ）活性测定（愈创木酚法） （1）试剂配制： 0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)： 分别取 A 母液(Na2HPO4 ) 123ml 和 B 母液(NaH2PO4 ) 877ml 混匀即为 1000ml PBS(0.2M，pH6.0)； （2）反应混合液配制（以 60 个样为准） ： 取 200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入 0.076ml 液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热 搅拌溶解，冷却后加入 0.112ml 30％的 H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。 （3）样品测定： 取 3ml 反应液并加入 30?l 酶液， PBS 为对照调零， 以 而后测定 OD470 值 （测定 40 秒） 。 （边加样边测定，测定前等待 5 秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开 始记时的时间相差不大） （4）酶活性计算：以每 min OD 值变化（升高）0.01 为 1 个酶活性单位（u） 。 POD=（?A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ?A470：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提 取酶液总体积（ml，(1.6ml） ；Vs 为测定时取用酶液体积（ml，30ul） 。 2、 过氧化氢酶（CAT）活性测定 、 过氧化氢酶（ ） （1）试剂配制： 0.15mol/L 磷酸缓冲液 （pH7.0）取 A 母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和 B 母液(NaH2PO4) 292.5 ： ml 混合后用蒸馏水定容至 1000ml。 （2）反应液配制：取 200ml PBS（0.15M，pH7.0） ，加入 0.3092ml 30%的 H2O2（原液） 摇匀即可。 （3）样品测定：取 3ml 反应液加入 0.1ml（可视情况调整）酶液，以 PBS 为对照调零， 测定 OD240（紫外） （测定 40s） 。 （4）酶活性计算：以每 min OD 值减少 0.01 为 1 个酶活性单位（u） 。 CAT=[?A240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ?A240：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提 取酶液总体积（ml， 1.6ml） ；Vs 为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml） 。 四、超氧阴离子自由基（O2.-）产生速率的测定（羟胺氧化法） 1、试剂的配制 （1）1mM 盐酸羟胺溶液：称取 0.02085g 盐酸羟胺用蒸馏水定容至 300ml； （2）17mM 对氨基苯磺酸溶液：称取 1.1776g 对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰 醋酸：水=1：3 配制）加热溶解后定容至 400ml； （3）7mMα-萘胺溶液：称取 0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1 配制） 定容至 400ml。 2、O2.-含量的测定 （1）样品液提取方法同 SOD 测定； （2）取 0.5ml 提取液（酶液） （可视情况调整用量）中加入 0.5ml PBS（0.05M，pH7.8） ， 1ml 1mM 盐酸羟胺溶液后摇匀。 （3）在 25℃下保温 1 小时； （4） 依次先加入 1ml 17mM 对氨基苯磺酸， 再加入 1ml 7mM α-萘胺， 混合后快速摇匀； （5） 25℃下保温 20min 后在 3000×g 下离心 3min 后马上进行测定 在 （或置于冰箱待测） ； （6）以对照管调零（用水调零） ，取粉红色水相液测定 OD530 值（测定） ； （7）O2.-含量的计算：由测得的 OD530，查 NO2-标准曲线得到[NO2-]；根据羟胺与 O2.- 的反应式：NH2OH＋2O2.-＋H+ NO2-＋H2O2 ＋H2O 计算[O2.-]，即[NO2-]×2=[O2.-]；再 根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得 O2.-产生速率（以 nmol min-1mg-1 蛋白表示，也可以 nmol min-1g-1 鲜重表示） 。 O2.-产生速率=（C×V）/（t×W） （nmol min-1g-1 鲜重） C 为标准曲线上查得的浓度(umol/L)；V 为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体 积)；t 为反应时间(60min)；W 为样品鲜重(叶绿体实际质量 g) 参考文献： （6） 参考文献：王爱国，罗广华．植物生理学通讯，1990， ：55～57 五、丙二醛含量的测定 1、试剂配制： 10%TCA：100g 三氯乙酸 → 1L 0.67%TBA：3.35g 硫代巴比妥酸 → 500ml 10%TCA （避光） 2、测定步骤: 0.2 样品+1.6ml 10%TCA 研磨→12000g 离心 10min →上清 1.5ml +1.5 0.67% TBA →沸水 煮 30min →冷却，离心→上清 OD450，OD532，OD600 3、计算组织中 MDA 含量： MDA 浓度 C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450 MDA 含量(umol/g FW)=C×V/W 式中 V 为提取液体积(1.6ml)，W 为样品鲜重(0.2g)。 六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法） 植物细胞质膜透性的测定（电导仪法） 植物细胞质膜透性的测定 （1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几 遍后用吸水纸吸干水分； （2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或 15ml 大离心管）中，加 10ml 去离子水，在 室温下放置 3h 使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1)； （3）再放入恒温水浴锅中在 100℃沸水浴中煮 20min 以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温 后测定溶液电导率(R2)； （4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示） ： 相对电导率（%）=R1/R2×100% 还可以计算植株伤害程度： 伤害率=（处理电导率—对照电导率）/（煮沸电导率—对照电导率）×100% 七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法） 1、试剂的配制 （1）考马斯亮蓝溶液配制：称取 100 mg 考马斯亮蓝，溶于 50 ml 90％乙醇中，加入 100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1L。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温 下可在暗中保存一个月。 （2） 100?g/ml 牛血清蛋白 （BSA） 标准溶液： 称取 25mg BSA 加水溶解后定容至 100 ml， 再从中吸取 40ml 用蒸馏水定容至 100 ml（也可取 10mg BSA 定容至 100ml 即为 100?g/ml 标准 BSA 溶液） 。 2、样品可溶性蛋白含量的测定 （1）样品可溶性蛋白含量测定：取 20?l 提取液（酶液）加入 80?l，0.05M，pH7.8 磷 酸缓冲液（即稀释成 0.1ml 提取液） ，再加入 2.9ml 考马斯亮蓝溶液，反应 2min 后测 OD595 （以 100?l 缓冲液加 2.9ml 考马斯亮蓝为对照调零） 。 （2）蛋白质含量计算： 可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000) ；V C 为标准曲线查得的蛋白质含量（?g） T 为提取液总体积（稀释后的体积 ml） S ；V 为测定时所用提取液体积（ml，20?l） ；W 为样品鲜重（g） 。

2.1.1 烷化剂

烷化剂能与一个或几个核酸碱基反应，引起DNA 复制时碱基配对的转换而发生遗传变异，常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等。

甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulphonate,EMS) 是最常用的烷化剂，诱变率很高。它诱导的突变株大多数是点突变，该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。

N- 甲基- N'- 硝基- N- 亚硝基胍（NTG) 是一种超诱变剂，应用广泛，但有一定毒性，操作时应该注意。在碱性条件下，NTG 会形成重氮甲烷（CH2N2），它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH2N2 对DNA 的烷化作用引起的[2]。

硫酸二乙酯（DMS) 也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用。乙烯亚胺，生产的较少，很难买到。使用浓度0.0001%~0.1%，高度致癌性，使用时需要使用缓冲液配置。

2.1.2 碱基类似物

碱基类似物分子结构类似天然碱基，可以掺入到DNA 分子中导致DNA 复制时产生错配，mRNA 转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。主要有5- 氟尿嘧啶（5- FU) 、5- 溴尿嘧啶（5- BU) 、6- 氯嘌呤等。程世清等[25]用5- BU 对产色素菌（分枝杆菌T17- 2- 39） 细胞进行诱变，生物量平均提高22.5%.

2．1.3 无机化合物

诱变效果一般，危险性较小。常用的有氯化锂，白色结晶，使用时配成0.1%~0.5%的溶液，或者可以直接加到诱变固体培养基中，作用时间为30min～2d。亚硝酸易分解，所以现配现用。常用亚硝酸钠和盐酸制取，将亚硝酸钠配成0.01~0.1mol/L 的浓度，使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。

2.1.4 其他

盐酸羟胺，一种还原剂，作用于C 上，使G- C 变为A- T。也较常用,使用浓度为0.1%～0.5%，作用时间60min～2h。

此外，诱变时将两种或多种诱变因子复合使用，或者重复使用同一种诱变因子，效果更佳。顾正华等[7]以谷氨酸棒杆菌ATCC- 13761 为出发菌株，经DMS 和NTG 多次诱变处理，获得一株L- 组氨酸产生菌。

2、诱变剂

2.1 诱变剂的选择

在选择诱变剂时，需要注意诱变剂的专一性，即某一诱变剂或诱变处理优先使基因组的某些部分发生突变而别的部分即使有也很少发生突变。对诱变剂专一性的分子基础不十分了解万尽管有关的修复途径必定对此有影响，但它们的关系并不那么简单，其它各种因素，包括诱变处理的环境条件也能影响突变类型。

工业遗传学家很难正确地预言改良某一菌种时需要何种类型的分子水平的突变。因此，为了产生类型尽可能多的突变体，最适当的方法是采用几种互补类型的诱变处理。远紫外无疑是所有诱变剂中最为合适的，似乎可以诱导所有已知的损伤类型。采取有效、安全的预防方法也很容易。在化学诱变剂中，液体试剂比粉末试剂更易进行安全操作。的另一个不利因素是它有产生紧密连锁的突变丛的趋势，尽管这种效应在某些体系中能成为有利条件。最后，必须认识到可能某些特异菌系用某些诱变剂是不能被诱变的。当然这一点通过测定易检出的突变体，如抗药性突变体或原养型回复突变体的诱变动力学可以相当容易地得到验证。[8]

2.2 诱变剂的剂量

从随机筛选的最佳效果看，诱变剂的最适剂量就是在用于筛选的存活群体中得到最高比例的所需要的突变体，因为这会使在测定效价的阶段更省力。

因此在菌株改良以前，为了决定所用诱变剂的最适剂量，并为突变性的增强技术打下基础，聪明的做法通常是测定不同诱变剂处理不同菌种时的突变动力学。用高单位突变本身来测定最适剂量有时是不可能的，因为这种突变的检测很困难。但如使用容易检出的标记如耐药标记，只要估计到方法的局限性，还是可以提供一些有价值的资料的。[9]

1,铬黑T干粉指示剂：

称取0.5g铬黑T，加100gNaCl充分混合、碾磨均匀，储存于棕色瓶中，密塞备用。此法所配置的固体铬黑T指示剂可以较长时间保存，只是使用时不如液体铬黑T那样方便。

2铬黑T液体指示剂：

根据固体铬黑T性质稳定、易溶于水和乙醇的特点，可分别选用水、95%乙醇、丙三醇和三乙醇胺作为溶剂。

1），用水、95%乙醇或丙三醇作为溶剂时，0.5g铬黑T必须加入10ml硬度缓冲液，再以水、95%乙醇或丙三醇溶解并稀释到100ml。不能直接用95%的乙醇溶解并稀释至100ml。

2）用三乙醇胺，0.5g铬黑T溶于100ml三乙醇胺中，可最多用25ml乙醇代替三乙醇胺以减少溶液的粘性，因为三乙醇胺具有胺类的碱性，可不加硬度缓冲液。

以上所配的铬黑T液体指示剂用棕色瓶储存于冰箱中，使用方便。

其中，铬黑T水溶液因为发生聚合反应和氧化反应只能保存几天；铬黑T乙醇溶液因乙醇易挥发性也只能保存一个月左右；铬黑T丙三醇溶液或三乙醇胺溶液则可较长时间保存。4种溶剂以三乙醇胺为最佳，因其不仅减慢铬黑T的聚合速度，而且在用EDTA-Na2滴定Ca2+、Mg2+时三乙醇胺作为掩蔽剂消除Fe3+、Al3+对铬黑T指示剂的封闭作用。

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本标准参照采用ISO 5983―1979 《动物饲料——氮含量的测定和粗蛋白含量计算》。

1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。

2 引用标准 GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备

3 原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。

4 试剂

4.1 硫酸（GB 625）：化学纯，含量为98％，无氮。

4.2 混合催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水（GB 665），6g硫酸钾（HG 3—920）或硫酸钠（HG 3—908），均为化学纯，磨碎混匀。

4.3 氢氧化钠（GB 629）：化学纯，40％水溶液（m／V）。

4.4 硼酸（GB 628）：化学纯，2％水溶液（m／V）。

4.5 混合指示剂：甲基红（HG 3—958）0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220）0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。

4.6 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按GB 601制备。

4.6.1 盐酸标准溶液：c（HCl）＝0.1mol／L。8.3mL盐酸（GB 622，分析纯），注入 1000mL蒸馏水中。

4.6.2 盐酸标准溶液：c（HCl）＝0.02mol／L。1.67mL盐酸（GB 622，分析纯），注入1000mL蒸馏水中。

4.7 蔗糖（HG 3—1001）：分析纯。

4.8 硫酸铵（GB 1396）：分析纯，干燥。

4.9 硼酸吸收液：1％硼酸水溶液1000mL，加入0.1％溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1％甲基红乙醇溶液7mL，4％氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。

5 仪器设备

5.1 实验室用样品粉碎机或研钵。

5.2 分样筛：孔径0.45mm（40目）。

5.3 分析天平：感量0.0001g。

5.4 消煮炉或电炉。

5.5 滴定管：酸式，10、25mL。

5.6 凯氏烧瓶：250mL。

5.7 凯氏蒸馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。

5.8 锥形瓶：150、250mL。

5.9 容量瓶：100mL。

5.10 消煮管：250mL。

5.11 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动，全自动蛋白质测定仪。6 试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。

7 分析步骤

7.1 仲裁法

7.1.1 试样的消煮

称取试样0.5～1g（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶（5.6）中，加入6.4g混合催化剂（4.2），与试样混合均匀，再加入12mL硫酸（4.1）和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶（5.6）置于电炉（5.4）上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力（360～410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。

7.1.2 氨的蒸馏（蒸馏步骤的检验见附录A）

7.1.2.1 常量蒸馏法 将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入60～100mL蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸（4.4）吸收液和2滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶（5.6）中加入50mL氢氧化钠溶液（4.3），轻轻摇动凯氏烧瓶（5.6），使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1～2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。

7.1.2.2 半微量蒸馏法 将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。将半微量蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸（4.4）吸收液和2滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶（5.8）内。蒸汽发生器 （5.7）的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10～20mL注入蒸馏装置（5.7）的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠溶液（4.3），小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶（5.8）使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。 注：7.1.2.1和7.1.2.2蒸馏法测定结果相近，可任选一种。

7.1.2.3 蒸馏步骤的检验 精确称取0.2g硫酸铵（4.8），代替试样，按7.1.2或7.2.2步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为21.19±0.2％，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。

7.1.3 滴定 用7.1.2.1或7.1.2.2法蒸馏后的吸收液立即用0.1mol／L（ 4. 6. 1）或0 .02mol／L（4.6.2）盐酸标 准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。

7.2 推荐法

7.2.1 试样的消煮 称取0.5～1g试样（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入消化管中，加2片消化片（仪器自备）或6.4g混合催化剂（4.2），12mL硫酸（4.1），于420℃下在消煮炉上 消化1h。取出放凉后加入30mL蒸馏水。7.2.2 氨的蒸馏 采用全自动定氮仪（5.11）时，按仪器本身常量程序进行测定。 采用半自动定氮仪（5.11）时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL硼酸（4.4）为吸收液，加入2滴混合指示剂（4.5），蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50mL氢氧化钠溶液（4.3）进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100mL时为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。7.2.3 滴定 用0.1mol／L的标准盐酸溶液（4.6.1）滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。

8 空白测定 称取蔗糖0.5g，代替试样，按第7章进行空白测定，消耗0.1mol／L盐酸标准溶液（4.6.1）的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol／L盐酸标准溶液（4.6.2）体积不得超过0.3mL。

9 分析结果的表述

9.1 计算见下式：

粗蛋白质（％）＝（V2－V1）c×0.0140×6.25／（m×V′／V）

式中： V2—— 滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL；

V1—— 滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL；

C—— 盐酸标准溶液浓度，mol／L；

m—— 试样质量，g；

V—— 试样分解液总体积，mL；

V′—— 试样分解液蒸馏用体积，mL；

0.0140—— 与1.00mL盐酸标准溶液〔c（HCl）＝1.000mol／L〕相当的、以克表示的氮的质量。 6.25—— 氮换算成蛋白质的平均系数。

9.2 重复性 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋白质含量在25％以上时，允许相对偏差为1％。 当粗蛋白含量在10％～25％之间时，允许相对偏差为2％。 当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。

我有个现成的 其他的我现在没时间 你自己找吧

http://www.china-animal.com.cn/standard/article/2006-10-20/2253-1.htm

牧草我没做过 如果粗蛋白的含量比较低的话建议取样加倍

补充一下

．饲料中Ca的测定方法 GB/T 6436-92

1. 简述：本标准适应于配合饲料，浓缩料，预混合料和单一饲料。

2. 原理：将试样中有机物破坏，使钙溶解制备成溶液，用三乙醇胺、乙二胺、和淀粉溶液消除干扰离子的影响，在碱性溶液中以钙黄绿素为指示剂，用EDTA标准溶液络合滴定钙，可快速测定钙的含量。

3. 试剂：

1) 盐酸羟胺（AR）；

2) 盐酸 1+1（V1+V2）；

3) 氢氧化钾溶液 200g/L；

4) 三乙醇胺水溶液1+1( V1+V2)；

5) 乙二胺水溶液1+1（V1+V2）；

6) 淀粉溶液；10 g/L （1%） 称取1 g可溶性淀粉加入200ml烧杯中，加5ml水润湿。加95ml沸水搅匀，煮沸，冷却备用（现配现用）；

7) 孔雀绿水溶液：1 g/L；

8) 钙黄绿素-甲基百里香酚蓝指示剂：0.1g钙黄绿素与0.10g甲基麝香草酚蓝与0.3克百里香酚蓝，5g氯化钾研细混匀，贮存于磨口瓶中备用；

9) EDTA 标准滴定溶液 (对钙的滴定度为0.4 g/ml)。

4.试样制备:

方法: 称取试样适量(预混料1 g，浓缩料，全价料，鱼粉等 2-4 g 于坩埚中)，精密称定，在电炉上小心炭化，再加入高温炉于550oC下灼烧3h（或测定粗灰分连续进行），在盛灰坩埚中加入盐酸溶液（1+1）10ml，小心煮沸，冷却至室温，将此溶液过滤（脱脂棉）转入容量瓶中（100ml），用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。

5．测定

准确移取试样分解液5 ml，加水50 ml，加淀粉溶液10 ml，三乙醇胺2 ml， 乙二胺1 ml， 1滴孔雀石绿，滴加氢氧化钾溶液10 ml，加0.1g盐酸羟胺(每滴一种试剂都需摇匀)，加钙黄绿素少许，在黑色背景下立即用EDTA标准滴定溶液，滴定至绿色消失呈现紫红色为滴定终点.

6． 计算

钙的含量：X（%）=

式中： T--------EDTA标准滴定溶液对钙的滴定度，mg/ml

V0-------试样分解液的总体积，ml

V1-------分取试样分解液的体积，ml

V2--------实际消耗EDTA标准滴定溶液的体积，ml

m---------试样的质量，g

所得结果应表示至二位小数

7． 重复性：

每一试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。

含钙量在5%以上，允许相对偏差3%；

含钙量5%--1%时，允许相对偏差5%；

含钙量1%以下，允许相对偏差10%。

四．饲料中总磷量的测定方法。分光 光度法 CB/T 6437—92

1． 简述：本标准适应于配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料和单一饲料。

测定范围磷含量 0——20mg/ml。

2． 方法原理：

将试样中的有机物破坏，使磷游离出来，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理，生成黄色的(NH )3PO4NH4VO316MoO3，，在波长420mm下进行比色测定。

3． 试剂：

1) 盐酸（1+1水溶液） 硝酸 高氯酸

2) 钒钼酸铵显色剂：称取偏钒酸铵1.25g，加硝酸250ml，另称取钼酸铵25g，加水400ml加热溶解，在冷却的条件下，将两种溶液混合，用水定容成1000ml。避光保存，若生成沉淀，则不能继续使用。（注：钼酸铵倒入偏钒酸铵中）。

3) 磷标准液：将磷酸二氢钾在105oC干燥1h，在干燥器中冷却后称取0.2195g溶解于水，定量转入1000ml容量瓶中，加入硝酸3ml，用水稀释至刻度，摇匀，即为50mg/ml的磷标准液。

4. 试样的分解

干法: 与Ca测定试样的制备方法一致，在实际中，Ca，P 使用同一分解液.

5. 标准曲线的制备：

准确移取磷酸标准液，取0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0ml于50ml容量瓶中，各加钒钼酸铵显色剂10ml，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10min以上，以0ml溶液为参比，用10mm比色池，在420nm波长下，用分光光度计测定各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

6．试样的测定：

准确移取试样分解液0.5ml—10ml（含磷量50—750mg）（实际中取0.5ml）于50ml容量瓶中，加入钒钼酸胺显色剂10ml，按5的方法显色和比色测定，测得试样分解液的吸光度，用标准曲线查得试样分解液的含磷量。

7． 计算：

样品中总磷含量（P%）=

式中： m---------试样的质量，g；

m1----------由标准曲线查得试样分解液磷含量，mg；

V1---------移取试样分解液的体积，ml；

V-------试样分解液的总体积，ml；

所得到的结果应精确到0.01%

8． 允许差

每个试样称取两个平行样品进行测定，以其算术平均值为测定结果，其间分析结果的相对偏差不大于下表所列相对允许偏差：

磷含量 % 允许偏差 %

＞0.5 10

≥0.5 3

五、饲料中粗灰分的测定方法

1、 简述：本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及各种单一饲料中粗灰分的测定。

2、 方法原理：

试料在550℃灼烧后所得残渣，用质量百分率来表示。残渣中主要是氧化物、盐类等矿物质，也包括混入饲料中的砂石、土等，故称粗灰分。

3、 测定步骤：

将干净坩埚放入高温炉，在550±20℃下灼烧30min，取出，在空气中冷却约1min，放入干燥器冷却30min，称其质量。再重复灼烧冷却至恒重。

在已恒重的坩埚中称取2g试料，精密称定，在电炉上小心炭化，在炭化过程中，应将试料在较低温度状态加热灼烧至无烟，尔后升温灼烧至样品无炭粒，再放入高温炉，于550±20℃下灼烧3h。取出，在空气中冷却约1min，放入干燥器冷却至30min，称取质量。再同样灼烧1h，至恒重。

4、 计算结果：

式中： m0——为恒重空坩埚质量，（g）；

m1——为坩埚加试料后质量，（g）；

m2——为灰化后坩埚加灰分的质量，（g）；

所得结果应表示至0.01%

5、 允许误差：

粗灰分含量在5%以上，允许相对偏差为1%；

灰分含量在5%以下，允许相对偏差为5%。

六、饲料中水溶性氯化物的测定方法 快速测定法（GB/T 6439-92）

1． 简述：本标准用于测定配合饲料和单一饲料中水溶性氯化物的测定，以及原料中水溶性氯化物的测定。

2． 方法原理：使试样中氯离子溶解于水中，用硝酸银标准滴定液使氯化物形成氯化银沉淀，过量的硝酸银使铬酸钾指示液变色。

3． 试剂：

1) 10%的铬酸钾指示剂

2) 0.1mol/L硝酸银标准滴定液（

4． 测定方法：

称取5-10g样品，准确至0.001g，准确加蒸馏水100ml，搅拌15min，放置至澄清（或过滤），准确移取上清液25ml，10%铬酸钾指示剂1ml，用硝酸银标准溶液滴定，呈现出砖红色，且1min不褪色为终点。

5． 计算：

式中：V0——试样稀释的总体积，ml；

V2——滴定用硝酸银溶液的体积，ml；

V1——移取试液的体积，ml；

C——硝酸银溶液的麾尔浓度，mol/L；

m——称取试样的重量，g；

实际中：V0=100ml；V1=25ml；

氯含量在3%以下（含3%），允许绝对误差0.05；氯含量在3%以上，允许相对偏差3%。

七、饲料中粗蛋白的测定方法 GB/T 6432—1994

1、 简述：本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。

2、 原理：凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮量转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。

3、 试剂：

1) 硫酸：化学纯、含量为98%，无氮；

2) 混合催化剂：0.4g硫酸铜，6g硫酸钾或硫酸钠，磨碎混合均匀；

3) 氢氧化钠：40%水溶液（m/v）；

4) 硼酸：2%水溶液；

5) 混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。

6) 盐酸标准溶液：0.1mol/L（8.3ml盐酸注入1000ml蒸馏水中）。

标定：

4、 试样的消煮：

称取试样0.5g，精密称定，放入凯氏烧瓶中，加入3.4g混合催化剂，再加和10ml浓硫酸和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，共加热3小时。

5、 常量蒸馏法

将试样消煮液冷却，加入60~100ml蒸馏水，摇匀，冷水冷却。将蒸馏装置的冷凝管来端浸入装有50ml硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶中加入50ml氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯氏并行瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体积为100ml。降下锥形瓶使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1~2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。

6、 蒸馏步骤的检验

精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按上述步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为21.1g±0.2%，否则应检查加碱，蒸馏和滴定各步骤是否正确。

7、 滴定

用0.1mol\L的标准盐酸溶液滴定吸收液，溶液由蓝色变成灰红色为终点。

8、 计算：

式中： V2——滴定试样时所需用的标准盐酸溶液的体积，ml；

V1——滴定空白时所需标准盐酸溶液的体积，ml；

C——盐酸的标准溶液的浓度，mol/L；

m——称取试样的质量，g。

0.0140——每毫克当量氮的克数；

6.25——氮换算成蛋白质的平均系数。

9、 重复性

每个试样的平行样进行测定，以其算术平均什为结果。

当粗蛋白质在25%以上时，允许相对偏差为1%；

当粗蛋白质在10%~25%之间时，允许相对偏差为2%；

当粗蛋白质在10%以下时，允许相对偏差为3%。

真蛋白的检测

1）称1克样品于200ml烧杯中

2）加50ml水煮沸

3）加10%硫酸铜20ml

4）加2.5%氢氧化钠20ml边加边搅拌

5）放置1小时后过滤

6）用70度的热水反复洗残渣,直到滤液无硫酸根离子为止

7）放入烘箱65~75度,干燥两个小时

8）其余和做粗蛋白一样(硫酸过量一点)

八、饲料中粗脂肪测定方法。GB/T 6433—1994

1、 简述：本标准适用于各种单一、混合饲料和预混料中粗脂肪的测定方法。

2、 方法原理：索氏脂肪提取器中用乙醚提取试样，称提取物的重量，除脂肪外还有有机酸，磷脂、脂溶性维生素，叶绿素等，因而测定结果称粗脂肪或乙醚提取物。

3、 试剂与仪器

2) 无水乙醚（AR）

3) 索氏脂肪提取器（带球形冷凝管）：100或150ml。

4) 索氏脂肪提取仪。

4、 使用索氏脂肪提取器测定：

索氏提取器应干燥无水。抽提瓶（内有沸石数粒）在105±2℃烘箱中烘干60min，干燥器中冷却30min，称重，再烘干30min，同样冷却称重，两次重量之差小于0.0008g为恒重。

称取试样1---5g，于滤纸筒中，或用滤纸包好，放入105℃烘箱中，烘干120min（或称测水分后的干试样，折算成风干样重），滤纸筒应高于提取器虹吸管的高度，滤纸包长度应以可全部浸泡于乙醚中为准。将滤纸筒或包放入抽提管，在抽提瓶中加无水乙醚60----100ml，在60---75℃的水浴（用蒸馏水）上加热，使乙醚回流，控制乙醚回流次数为每小时约10次，共回流约50次（含油高的试样约70次）或检查抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。（将试样在无水乙醚中浸泡三小时，效果更佳）

取出试样，仍用原提取器回收乙醚直到抽提瓶全部收完，取下抽提瓶，在水浴上蒸去残余乙醚，擦净瓶外壁。将抽提瓶放入105+-2℃烘箱中烘干120min，干燥器中冷却30min称重，再烘干30min，同样冷却称重，两次重量之差小于0.001g这恒重。

5、 计算：

粗脂肪（%）=

式中：m-----风干试样重量，g

m1-----已恒重的抽提瓶重量，g；

m2----已恒重的盛有脂肪的抽提瓶重量，g.

6、 重复性

每个试样取两平行样进行测定，以其算术平均值为结果。

粗脂肪含量在10%以上（含10%）允许相对偏差为3%。

粗脂肪含量在10%以下时，允许相对偏差为5%。

九、饲料中粗纤维的测定

1 适用范围

本标准规定了饲料中粗纤维含量的测定方法。适用于各种混合饲料、配合饲料、浓缩饲料及单一饲料。

2、 原理

用浓度准确的酸和碱，在特定条件下消煮样品，再用乙醇除去可溶物，经高温灼烧扣除矿物质的量，所余量为粗纤维，它不是一个确切的化学实体，只是在公认强制规定的条件下测出的概略成分，其中以纤维素为主，还有少量半纤维素和木质素。

3、 试剂

3.1 硫酸溶液0.128±0.005mol/L：

3.2 氢氧化钠溶液，0.313±0.005mol/L：

3.3 酸洗石棉、95％乙醇、乙醚、正辛醇（防泡剂）。

4.4消煮器：有冷凝球的600mL高型烧杯或有冷凝管的锥形瓶。

4.5抽滤装置：抽真空装置，吸滤瓶和漏斗。（滤器使用200目不锈钢网或尼龙滤布）

4. 6古氏坩埚：30mL，预先加入酸洗石棉悬浮液30mL（内含酸洗石棉0.2～0.3g）再抽干，以石棉厚度均匀，不透光为宜。上下铺两层玻璃纤维有助于过滤。

7、 分析步骤

7.1 仲裁法

称取1～2g试样，准确至0.0002g，用乙醚脱脂（含脂肪大于10％必须脱脂，含脂肪不大于10％，可不脱脂），放入消煮器（或大的三角烧瓶中），加浓度准确且已沸腾的硫酸溶液（3.1）200mL和1滴正辛醇，立即加热，应使其在2min内沸腾，调整加热器，使溶液保持微沸，且连续微沸30min，注意保持硫酸浓度不变。试样不应离开溶液沾到瓶壁上。随后抽滤，残渣用沸蒸馏水洗至中性后抽干。用浓度准确且已沸腾的氢氧化钠溶液（3.2）将残渣转移至原容器中并加至200mL，同样准确微沸30min，立即在铺有石棉的古氏坩埚上过滤，先用25mL硫酸溶液洗涤，用沸蒸馏水洗至中性，再用15mL乙醇洗涤，抽干。将坩埚放入烘箱，于130±2℃下烘干2h，取出后在干燥器中冷却至室温，称重，再于550±25℃高温炉中灼烧30min，取出后于干燥器中冷却至室温后称重。

7.2 推荐法

称1～2g试样（脱脂步骤同手工方法）于G2玻璃沙漏斗中，用坩埚夹将漏斗插入热萃取器；从顶部加入预先煮沸的硫酸溶液200mL和两滴正辛醇，将加热旋扭开到最大位置，待溶液沸腾后，将旋扭调到合适位置，使溶液保持微沸30min，抽滤，用沸蒸馏水洗至中性，加入预先煮沸的氢氧化钠溶液200mL，同样准确微沸30min，抽滤，用沸蒸馏水洗至中性，将坩埚转移至冷萃取器，加入25mL95％乙醇，抽干，将漏斗转移到烘箱，于130±2℃下烘干2h，取出后在干燥器中冷却至室温，称重。再放入500±25℃高温炉中灼烧1h，干燥器中冷却至室温后称重。型号不同的仪器具体操作步骤见该仪器使用说明书。

8 测定结果的计算

8.1 计算公式

粗纤维（％）＝（m1－m2）/m

式中：m1——130℃烘干后坩埚及试样残渣重，g；

m2——550℃（或500℃）灼烧后坩埚及试样残渣重，g；

m—— 试样（未脱脂）质量，g。

8.2 重复性

每个试样取两平行样进行测定，以算术平均值为结果。

粗纤维含量在10％以下，绝对值相差0.4。粗纤维含量在10％以上，相对偏差为4％。

常用化学诱变剂的种类及作用机制

（一）烷化剂

是栽培作物诱发突变的最重要的一类诱变剂。药剂带有一个或多个活泼的烷基。通过烷基置换，取代其它分子的氢原子称为"烷化作用"所以这类物质称烷化剂。

烷化剂分为以下几类：

1. 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐

代表药剂：甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）

2. 亚硝基烷基化合物

代表药剂：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU）

3. 次乙胺和环氧乙烷类

代表药剂：乙烯亚胺（EI）

4. 芥子气类

氮芥类、硫芥类

烷化剂的作用机制--烷化作用 作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。

（二）核酸碱基类似物

这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。

代表药剂：

5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR） 为胸腺嘧啶（T）的类似物

2-氨基嘌呤（AP） 为腺嘌呤（A）的类似物

马来酰肼（MH） 为尿嘧啶（U）的异构体

作用机制：作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。

（三）其它诱变剂

亚硝酸 能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA复制紊乱。HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。

叠氮化钠(NaN3) 是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，而且无残毒。

以下是具体的使用方法，希望对你有点作用！！！！！！！！！！

化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。

化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能宜接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防上污染环境，造成公害。

一、碱基类似物

用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5－IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的给、结构类似物。最常用是5－BU和AP。

当将这类物质加人到培养基中，在繁殖过程中可以掺人到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，困此，也叫掺人诱变剂。显然这一类诱变剂要求微生物细胞必顿处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。

（一）碱基类似物的诱变机制

正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。

5-BU 导致A：T碱基对转换为GC碱基

2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中A：T－ G：C或G：C－ A：T的转换。

（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）

1．单独处理

将微生物液体培养到对数期．离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液．饥饿培养8-10h，消耗其体内的贮存物质、将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25-40ug／ml，温合均匀．取0.1-0.2ml菌悬液加人到琼脂培养基上涂布培养。在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理。培养后挑取单菌落，进行筛选。如果是处理真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度，常处理浓度为 0.1mg／ml。

2．与辐射线复合处理

据报道；如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗人到DNA分予中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用射线要好。因此碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂。从而提高突变率。

二、烷化剂

（一）烷化剂的作用机制

烷化剂分单功能烷化剂和双功能或多功能烷化剂两大类。前者仅一个烷化基团，对生物毒性小，诱变效应大。后者具有两个或多个烷化基团，毒性大，致死率高，诱变效应较差。主要原因是双功能烷化剂有硫芥、氮芥。

烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占烷化作用的10％左右。因此，由这些位点改变所引起的突变仅是少数。

烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂，而造成突变。

（二）烷化剂的性质

溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生分解。它们大部分半衰期很短，其长短与温反、溶液PH关系很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。 有毒！！！！

（三）常用的烷化剂

亚硝基胍（NTG）

黄色晶体物质，性质不稳定，容易光解，黄色变为绿色时，诱变效应际低。

有超诱变剂之称，常用缓冲溶液有磷酸缓冲液和Tri缓冲液。

诱变处理方法：

①用一定值的磷酸缓冲液或Tri缓冲液洗制成菌悬液。②NTG母液：配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲液，其比例为缓冲液9ml：NTG丙酮溶液lml，浓度为NTG 1mg/ml ；使用时取母液0.2ml + 菌悬液1.8ml，NTG终浓度为100ug/ ml。一般随菌种不同而异，细菌一般为100-1000 ug/ ml，放线菌、真菌为l000-3000 ug/ ml。③放线菌在生长适宜的温度下培养，（细菌30-35℃、真菌25-28℃、放线菌30-32℃）处理若干时间，一般细菌20-60min,孢子90-120 min④终止反应。冷的生理盐水50倍稀释处理，或经过离心洗涤处理，作一定稀释度分离于平皿。如果是细菌，把后培养基按一定浓度加入到菌体沉淀物中，振荡培养1.5-2h，经2-3次细胞分裂，再涂平皿。

处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH浸泡处理。

NTG除以上直接以溶液处理外，还可以按以下方法诱变处理，摇瓶振荡处理：在接菌后的培养基中加人5-10 ug/ ml NTG．并加几滴吐温60或吐温80，使成乳化状（注意吐温对该菌生长是否有影响）；在平皿上生长过程处理：如果将NTG、琼脂和菌体混合制成平板，NTG浓度为10-50 ug/ ml。或将琼脂培养基制成平板．然后将NTG和菌体混合涂抹平析，此时NTG浓度为10-20 ug/ ml。

经后培养的培养液．除部分进行平皿分离外。剩余的培养液可以加人适量的药物，保存于冰箱内数天。如日本有人把经过NTG处理后的大肠杆菌培养液，用50％甘油（最终浓度为12.5％）于-40℃、-80℃保存。在以后数天内随时可取出融化，稀释分离，突变体死亡很少。

据报道．无论是用辐射处理，还是用化学诱变剂处理后的菌悬液或后增养液，浸在冰浴中2-3h，试验的重复性很好。认为在大肠杆菌、枯草杆菌和放线菌等可以采取这一措施来提高诱变效果。

NTG是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例用自来水大量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜，洗净。

2．甲基磺酸乙酯（简称EMS）

甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于水，不稳定，易水解成无活性物质。

EMS的诱变处理方法：

① EMS 母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。

②取新鲜的菌体，经前培养至对数期．离心洗涤，用缓冲液制成8 ml菌悬液（107-108ml-1）。对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，悬液含 106 ml-1。

③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌悬液中。在适宜温度下处理一定时间（根据预实验绪果确定）。处理的最终浓度为0 .lmol／L。对于真菌孢子，则为0.2-0.5rnol／L。

④EMS处理一定时间后，用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次离心、洗涤，以终止反应。

EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。

三、脱氨剂

亚硝酸是一稀常用的诱变剂，毒性小．不稳定，易挥发．其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO和NO2

（一）亚硝酸的诱变机制

脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。A→H，C→U，G→X。 A：T→G：C和G：C→A：T。亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。

亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，DNA复制，从而导致奕变。

（二）亚硝酸的处理方法

1．试剂的配制

（1）1mol／L pH4.5醋酸缓冲液

（2）0.1mol／L亚硝酸钠溶液

（3）0.07mol／L pH8.6磷酸氢二钠溶液

以上试剂用前均要灭菌。

2．处理方法

取孢子悬液1 ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液lml，最后处理浓度为0.025 mol／L ；25-26℃保温10-20min，加入的磷酸氢二钠溶液 20 ml，使出下降至pH 6. 8左右，以终止反应。稀释分离于平板。

如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05 mol／L。

在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。

四、移码诱变剂

移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。它们主要包括吖啶黄、吖啶橙、ICR－171、ICR-191等。移码诱变剂对噬菌体有强烈的诱变作用，诱发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更为显著。如某些产生抗生素的放线菌。用处理后，发现产量明显下降，主要就是由于控制抗生素合成的质粒脱落造成的。

吖啶黄的性质和使用方法：

淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，见光易分解。

使用时，先用少许乙醇溶解，配成一定浓度的母液。通常处理方法是特它们加入培养基中，使最后浓度为10-50ug/ml，混合后制成平板，适温培养，在生长过程中处理。另外还可将吖啶黄加人到培养液中，浓度为10-20 ug/ml ，在适温条件下，振荡培养过程中处理。

五、羟化剂【以羟胺为例】

羟胺的简称HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性。

1.羟胺的诱变机制

当羟胺浓度为0.1-1.0mol／L pH6.0时，主要与胞嘧啶反应，使羟化的C与A配对，在0.1-1.0mol／L pH9.0，羟胺可以与鸟嘧啶反应，10-3 mol／L时，羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。但据分析，羟胺与T、G反应的是它的产物，而不是它本身。此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氯，也具有诱变作用。

2．羟胺的处理方法

常用浓度为0.1％-5％，可直接在溶液中处理，时间1-2h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中。然后接入孢 子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理．所用浓度比直接处理时低些。

六、金属盐类

用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。其中氯化理比较常用，与其他诱变剂复合处理，效果相当显著。

氯化锂称之为助诱变剂，氯化锂是白色粉末，易溶于水，使用时通常加到培养基中。

为了速免受破坏．倒平板时，当培养基温度冷却到50-60℃时才加入制成平板，然后把细菌或孢子涂布分离，处理终浓度为0.3％-1.5%。

七、其他化学诱变剂

1．秋水仙素

秋水仙碱是诱发细胞染色休多倍体的诱变剂。秋水仙碱的主要作用是破坏细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成。导致多倍体的产生。

2．抗生素

作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素、争光霉素、丝裂霉素、放线菌素、光辉霉素和阿霉素等。这些抗生素都是抗癌药物，它们在微生物育种中虽有应用，但效果不如烷化剂等诱变剂显著，应用并不广泛。一般不单独使用，常与其他诱变剂一起复合使用。

八、直视化学诱变剂的操作安全

化学诱变剂多数是极毒的致癌药品，在进行诱变操作后的处置以及诱变剂的保藏等方面的安全防护都是极其重要的。如有疏忽，就可能对健康和环境带来恶果，万万不可麻痹。