聚乙二醇为什么能防巨噬细胞吞噬

聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一种水溶性高分子材料,由于其在水中具有很低的界面自由能,而且分子链柔性好、活动性高,所以具有良好的生物相容性。

含有聚乙二醇结构的亲水性材料

表面上,血小板的粘附量都比较少.这可能是由于

容易被水介质润湿而具有较小的表面能.因此,有

理由认为,低表面能材料具有较好的抗血栓性.

生物相容性又可分为组织相容性和血液相容性

两种.组织相容性是指材料与人体组织,如骨骼,

牙齿,内部器官,肌肉,肌腱,皮肤等的相互适应

性,而血液相容性则是指材料与血液接触是不是会

引起凝血,溶血等不良反应.

高分子材料植入人体后,对组织反应的影响因

素包括材料本身的结构和性质(如微相结构,亲水

性,疏水性,电荷等),材料中可渗出的化学成分

(如残留单体,杂质,低聚物,添加剂等),降解

或代谢产物等.此外,植入材料的几何形状也可能

引起组织反应.

（2） 氨基乙酸：吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜。避免吸入尘埃。

（3） X-半乳糖 (X-gal)：对眼睛和皮肤有毒性。使用粉剂时遵循常规注意事项。应注意的是，X-gal 溶液是在一种有机溶剂（DMF）中制备的。

（4）β-半乳糖苷酶：有刺激性，可产生过敏反应。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜。

（5）苯二胺 ：吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（6）苯酚：有剧毒性和高度腐蚀性，可致严重烧伤。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好合适的手套和护目镜，穿好防护服，在通风橱内操作。若有皮肤接触药物，可用大量清水冲洗，并用肥皂和水清洗，不要用乙醇洗。

（7）苯甲基磺酰氟化物(PMSF)：为一有剧毒的胆碱酯酶抑制剂。对上呼吸道的黏膜、眼睛和皮肤有极大损害。戴好合适的手套和护目镜，在通风橱内操作。万一眼睛或皮肤接触到此药品，立即用大量的水冲洗，丢弃被污染的衣物。

（8）苯甲酸：有刺激性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜，不要吸入。

（9）苯甲酸苄酯：有刺激性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。避免接触眼睛。戴好合适的手套和护目镜。

（10）苯乙醇：有刺激性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜，远离火源、火花和明火。

（11）丙烯酰胺（未聚合的）：为一种潜在的神经毒素，可通过皮肤吸收（有累积效应）。避免吸入尘埃。称量丙烯酰胺和亚甲基双酰胺粉末时，戴好手套和面罩，在化学通风橱内操作。聚合的丙烯酰胺是无毒的，但是使用时也应小心，因为其中可能喊有少量未聚合的丙烯酰胺。

（12）蛋白酶K：有刺激性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜。

（13）碘化丙锭：吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。刺激眼睛、皮肤、黏膜和上呼吸道。可诱导突变并可能致癌。戴好手套和护目镜，穿好防护服，在通风橱内小心操作。

（14）碘乙酰胺：能碱基化蛋白质上的氨基，从而影响抗原的氨基酸序列分析。有毒性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作，勿吸入尘埃。

（15）叠氮化钠：有剧毒性，可阻断细胞色素电子转运系统。含此药物的溶液要明确标记。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜，并小心使用。此药品为氧化剂，故保存时要远离可燃物品。

（16）多聚甲醛：有剧毒。易通过皮肤吸收，并对皮肤、眼睛、黏膜和上呼吸道有严重破坏性。避免吸入尘埃。戴好手套和护目镜，在通风橱内操作。多聚甲醛是甲醛的未解离形式。

（17）3，3’-二氨基联苯胺四氢氯化物：为一种致癌剂，操作时要非常小心。避免吸入气体。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（18）二甲苯：可燃，高浓度有麻醉作用。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。始终远离热源、火花和明火。

（19）二甲苯蓝：见二甲苯。

（20）二甲次胂酸钠：可能为致癌剂，并含有砷，有剧毒性。戴好手套和护目镜，只在通风橱内操作。

（21）N，N-二甲基酰胺(DMF)：刺激眼睛、皮肤和黏膜。可通过吸入，摄入，和皮肤吸收发挥其毒性。慢性吸入可导致肝、肾损害。戴好手套和护目镜，在通风橱内操作。

（22）二甲亚砜(DMSO)：吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜，在通风橱内操作。DMSO为可燃物保存于密封容器中。远离热源、火花和明火。

（23）二硫苏糖醇(DTT)：为一强还原剂，有恶臭味。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。当使用固体形式或高浓度溶液时，戴好手套和护目镜并在通风橱内操作。

（24）4ˊ，6-二脒基-2ˊ-苯基吲哚盐酸(DAPI)：可能为一种致癌剂。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。可引起刺激。避免吸入。戴好手套和护目镜，在通风橱内操作。

（25）放射性物质：当计划的一个实验涉及放射性物质的使用时，应包括以下内容：同位素的理化性质（如半衰期，放射型，辐射能量），辐射物质的化学形式，其辐射度（具体的活性）总量，化学浓度，需要使用多少就预定多少，使用放射性物质时，要始终戴好手套和护目镜，穿实验室工作服。X和γ射线为由仪器产生放射性物质辐射出的短波电磁波，它们会丛放射源辐射出来或聚成光束。它们的潜在危险决定于暴露于其中的时间、强度和它的波长。。

（26）放线菌素D：是一种畸胎剂和致癌剂，有剧毒。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害，甚至是致命的。应避免吸入。戴好手套和护目镜，并始终在化学通风橱内操作，放线菌D见光分解。

（27）高压玻璃器皿时要格外小心。高压锅和金属容器中的玻璃器皿，宜放入金属网中或蒲氏隔板中。在真空状态下使用玻璃器皿，如真空收集器、干燥设备或氩气条件下的反应器等，要谨慎操作。戴好护目镜。

（28）过二硫酸铵：对黏膜组织、上呼吸道、眼睛和皮肤有极大的破坏性。吸入可致命。戴好手套和护目镜，穿好防护服。必须在化学通风橱内操作。操作后要彻底清洗。

（29）过氧化氢：有腐蚀性、毒性，对皮肤有强损害性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜，只在化学通风橱内操作。

（30）环乙酰亚胺：吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。戴好手套和护目镜，只在化学通风橱内操作。

（31）磺基蓖麻酸（二水合物）；对黏膜和呼吸系统有极大破坏性。不要吸入粉尘，戴好手套和护目镜，在化学通风橱内操作。

（32）甲氨蝶呤(MTX)：为一种致癌剂和致畸胎剂。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。暴露于其中可导致胃肠反应，骨髓抑制，肝或肾损害。戴好手套和护目镜，在化学通风橱内操作。

（33）甲醇：有毒，可致失明。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。要有足够的通风以减少挥发气。不要吸入这些气体。戴好手套和护目镜，在化学通风橱内操作。

（34）甲基磺酸乙酯(EMS)：为一种可诱导机体突变和突变和致癌的挥发性有机溶剂。吸入，摄入，皮肤吸收可造成伤害。

（35）甲醛：有剧毒性和挥发性。也是一种致癌剂。可通过皮肤吸收，对皮肤、眼睛、黏膜和上呼吸道有刺激或损伤。避免吸入气体。戴好手套和护目镜。始终在通风橱内操作。远离热源、火花和明火。

（36）甲酸：有剧毒，对黏膜组织、上呼吸道、眼睛、皮肤有极大的损伤。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（37）甲酰胺：可导致畸胎。其挥发的气体刺激眼睛、皮肤、黏膜和上呼吸道。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。操作高浓度甲酰胺时要在通风橱内操作。尽可能将反应的溶液盖住。

（38）焦磷酸钠：有刺激性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。不要吸入粉尘。

（39）焦碳酸二乙酯(DEPC)：是一种潜在的蛋白质变质剂，且为可疑的致癌剂。开启时瓶口不要指向操作者或其他人。瓶内压可导致喷溅。戴好手套并穿实验室工作服，在通风橱内操作。

（40）聚丙烯酰胺：无毒性，但仍应谨慎使用，因为其中可能含有少量未聚合的物质。

（41）聚乙二醇(PEG)：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。避免吸入粉末。戴好手套和护目镜。

（42）菌种（运输）：健康教育福利部门根据运输器具将各种细菌划分为不同的类别。大肠杆菌的非病原种（K12）和枯草芽孢杆菌为第一类，正常运输条件下是无危害或危害性很微小的。但是沙门菌、嗜血杆菌、链霉菌和假单孢菌的一些菌种为第二类。第二类细菌为“一般潜在危害剂：能造成不同严重程度的疾病，但在普通实验室技术下可操作。”

（43）抗淬灭剂：见苯二胺。

（44）考马斯亮蓝：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（45）联结剂(DMP)：刺激眼睛、皮肤和黏膜。可通过吸入，摄入，皮肤吸收发挥其毒性。不要吸入气体，戴好手套、面罩和护目镜。

（46）链霉素：有毒性，怀疑为致癌剂和突变诱导剂。可导致过敏反应。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（47）亮肽素；吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（48）邻苯二甲酸二丁酯：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。不要吸入气体。

（49）磷酸二氢钠：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（50）磷酸：高腐蚀性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（51）磷酸钾：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。不要吸入粉尘，在通风橱内操作。

（52）磷酸钠：刺激眼睛和皮肤。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。不要吸入粉尘。

（53）磷酸氢钠：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（54）硫氰酸胍：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（55）硫氰酸胍盐；见硫氰酸胍。

（56）硫酸：剧毒性，对黏膜组织、上呼吸道、眼睛和皮肤有极大的损伤。可造成烧伤，与其他物质（如纸）接触可能引发火灾。戴好手套和护目镜，在通风橱内操作。

（57）硫酸镁：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（58）氯仿：刺激眼睛、呼吸道、皮肤和黏膜。为一种致癌剂。有肝、肾毒性。有挥发性。避免吸入蒸汽。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（59）氯化铵：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（60）氯化钙：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（61）氯化钾：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（62）氯化锂：刺激眼睛、呼吸道、皮肤和黏膜。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（63）氯化镁：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（64）氯化锰：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（65）氯化铁：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（66）氯化锌：有腐蚀性，对胎儿有潜在危险。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（67）3-（N-吗啉）-丙磺酸：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。刺激眼睛、呼吸道、皮肤和黏膜。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（68）没食子酸丙酯(NPG0：见苯甲酸。

（69）柠檬酸钠：见柠檬酸。

（70）柠檬酸：有刺激性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（71）硼酸：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（72）羟胺：有腐蚀性和毒性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（73）氢氧化铵：为氨的水溶液。具有腐蚀性。操作时要小心。氨气可从氨水中挥发出来，具有腐蚀性、毒性和爆炸性。戴好手套。必须在通风橱内操作。

（74）氢氧化钾：剧毒性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。溶液为强碱性，当心使用。戴好手套。

（75）氢氧化钠：溶液有剧毒，强碱性，当心使用。戴好手套。其他所有高浓度碱溶液都应以类似方式操作。

（76）秋水仙碱：有剧毒，可致命，可导致癌症和可遗传的基因损害。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。不要吸入粉尘。

（77）β-巯基乙醇：吸入或皮肤吸收可致命，摄入有害。。高浓度溶液对黏膜、上呼吸道、皮肤和眼睛有极大损害。β-巯基乙醇有难闻气味。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（78）去氧胆酸钠：刺激黏膜和呼吸道。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。使用粉末时，戴好手套和护目镜。不要吸入粉尘。

（79）溶剂；谨慎操作。

（80）溶菌酶：对黏膜有腐蚀性。戴好手套和护目镜。

（81）三氯乙酸：有很强的腐蚀性。戴好手套和护目镜。

（82）三乙胺：有剧毒，易燃。对皮肤、眼睛、黏膜和上呼吸道有强腐蚀性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。始终在通风橱内操作。远离热源、火花和明火。

（83）三乙醇胺：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。始终在通风橱内操作。

（84）十二烷基磺酸钠(SDS)：有毒性和刺激性，有严重损伤眼睛的危险。。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。不要吸入粉尘。

（85）双丙烯酰胺：是一种潜在的神经毒素，可通过皮肤吸收，避免吸入，在称量时，戴好手套和护目镜。

（86）四环素：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（87）N，N，N’，N’-四甲基乙二胺：对皮肤、眼睛、黏膜和上呼吸道有极大损伤。吸入可致命，长时间接触可产生严重刺激或烧伤。戴好手套和护目镜。穿防护服，必须在通风橱内操作。使用完毕要彻底清洗。易燃性，其挥发气体可到达一定距离，形成引燃源，瞬间发生火灾。远离热源、火花和明火。

（88）四水合乙酸镁：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（89）四唑氮蓝；有危险性，小心操作。

（90）碳酸钠：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（91）同位素125I；在甲状腺，为一潜在的健康杀手。无论何种形式的同位素都用铅板遮挡。操作同位素时，要戴一到两副手套，着取决于同位素的用量和所进行的操作难度。

（92）胃酶抑素：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（94）硝酸：具有挥发性，操作时要小心。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。远离热源、火花和明火。

（95）硝酸银：强氧化剂，小心操作。皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。与其他物质接触会发生爆炸。

（96）溴酚蓝：皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（97）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷：对眼睛和皮肤有毒性。皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（98）5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸酯：有毒性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（99）5-溴-2’-脱氧脲苷；为致畸胎剂。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。有刺激性。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（100）溴乙啡啶：为一种强致突变剂，有毒性。避免吸入粉尘。操作含此染料的溶液时，戴上手套。

（101）血（人类）和血产品和爱普斯坦病毒：其中可能含有隐藏的传染性物质，如乙型肝炎病毒、HIV，可能造成实验上室传染。戴一次性手套，使用吸枪式吸管，在生物安全橱中、操作，防止形成悬浮和污染。污染的塑料器皿在丢弃前要高压处理；污染的液体高压处理或丢弃前用漂白粉处理至少30min。

（102）N，N’-亚甲基丙烯酰胺：为毒药，作用于中枢神经系统。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。有刺激性。戴好手套和护目镜。

（103）亚精胺：有腐蚀性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。有刺激性。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（104）亚铁氰化钾：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。有刺激性。戴好手套和护目镜。在通风橱内相当谨慎地操作。远离强酸。

（105）盐酸：有挥发性。吸入，摄入，皮肤吸收可致命。对皮肤、眼睛、黏膜和上呼吸道有极大损害。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（106）盐酸胍：刺激黏膜、上呼吸道、皮肤和眼睛。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（107）盐酸胍盐：见盐酸胍。

（108）乙醇：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（109）乙基亚硝基脲：见N-乙基-N-亚硝基脲

（110）N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）：有致癌性，为潜在的突变诱导剂。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。用1ml/LNaOH溶液清洗所有接触过ENU的物品。

（111）乙酸铵：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（112）乙醇胺：有毒性。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。具有高腐蚀性，并可与酸发生强烈反应。

（113）乙酸：使用时要非常小心。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（114）乙酸钠：见乙酸。

（115）乙酸铀酰：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。在通风橱内操作。

（116）异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。

（117）异丁烯酸酯：有毒。吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。不要吸入其气体。

（118）异硫氰酸胍盐：见硫氰酸胍盐。

（119）抑肽酶：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤还可导致过敏反应。暴露其中可引起胃肠反应，肌肉疼痛，血压改变或支气管痉挛。戴好手套和护目镜。不要吸入粉尘，必须在通风橱内操作。

（120）月桂酰基氨酸钠：吸入，摄入，皮肤吸收可造成损伤。戴好手套和护目镜。不要吸入粉尘。

mL时,过氧化氢对壳聚糖的降解基本无效果,而高于此浓度时,过氧化氢则大大提高了壳聚糖的降解速率。选择不同过氧化氢浓度便可有效调节壳聚糖的降解速率。

的制备

 2.1 概述

 在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。

 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：

 ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。

 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。

 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。

 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。

 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：

 ①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。

 ②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。

 ③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。

 ④生物材料的破碎和预处理。

 ⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。

 ⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。

 ⑦产物的浓缩，干燥和保存。



 分析测定的方法主要有两类：

 即生物学和物理、化学的测定方法。

 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；

 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。

 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。

要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：

 ①在水和各种有机溶剂中的溶解性。

 ②在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。

 ③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。

 ④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。

 ⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。

 ⑥对其他生物分子的特殊亲和力。

 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。

 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：

 ①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；

 ②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。

 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。

 2.2 生物大分子制备的前处理

 2.2.1 生物材料的选择

 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。

 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。

 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。

 植物要先去壳、除脂。

 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。

 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。

 2.2.2 细胞的破碎

 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。

 (1)机械法：

 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。

 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。

 (2)物理法：

 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。

 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。

 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。

 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。

 (3)化学与生物化学方法：

 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。

 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。

 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。

 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。



 2.2.3 生物大分子的提取

 “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。

 影响提取的因素主要有：

 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；

 由固相扩散到液相的难易；

 溶剂的pH值和提取时间等。

 通常：

 极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；

 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；

 温度升高，溶解度加大；

 远离等电点的pH值，溶解度增加。

 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。

 ⑴ 水溶液提取：

 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：

 1) 盐浓度（即离子强度）：

 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。

 绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。

 为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。



 2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。

 3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。

 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。

 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。

 ⑵ 有机溶剂提取

 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。

 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。

 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。

例如，胰岛素（见讲义p36）。

 2.3 生物大分子的分离纯化

 由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。

 为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：

 沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。

 2.3.1 沉淀法

 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。

 其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。

 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：

 ⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。

 ⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。

 ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。

 ⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。

 ⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。

 2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法）

 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。

 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：

 ①成本低，不需要特别昂贵的设备。

 ②操作简单、安全。

 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。

 ⑴ 中性盐沉淀蛋白质的基本原理

 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图 4”所示。

 ⑵ 中性盐的选择

 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：

 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：

 表2-1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）

 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃

（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103

 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2

 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101









 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵

盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯

度提高了四倍。

 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的

作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的

（NH4）2SO4保存可达数年之久。

 4) 价格便宜，废液不污染环境。

 ⑶ 盐析的操作方法

 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。

 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。

 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。

 ⑷ 盐析曲线的制作

 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下(讲义p39)：

蛋白质量(mg)或酶活力

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱

和度％

 ⑸盐析的影响因素

 1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25 mg/mL～30mg/mL。

 2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。

 3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。



 2.3.1.2 有机溶剂沉淀法

 ⑴基本原理

 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：

 ①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。

 ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。



 有机溶剂沉淀法的优点是：

 ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。

 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。

 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。

 ⑵有机溶剂的选择和浓度的计算

 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。

 为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。

 ⑶有机溶剂沉淀的影响因素

 1) 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。

 一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。

 2) 样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。

 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。



 3) pH值：选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。

 4) 离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。

 沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。

 2.3.1.3 选择性变性沉淀法

 这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯。

 ⑴ 热变性

 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。

 ⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性

 使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。

 ⑶ 选择性酸碱变性

 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。

 2.3.1.4 等电点沉淀法

 利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。

 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。

 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。

 2.3.1.5 有机聚合物沉淀法

 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是

“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 简写为 PEG )，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。

 本方法的优点是：

 ①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。

 ②沉淀效能高，使用很少量的P“EG即可以沉淀相当多

的生物大分子。

 ③沉淀后有机聚合物容易去除。

 2.3.2 透析

 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。

 透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常为1万左右。

 用1％ BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 检查NaCl、KCl等。

 2.3.3 超滤

 超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。

 超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。

 超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。

 微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa，膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。

 超滤所用操作压为4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔径为10—100埃，用于分离大分子溶质。

 反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。

 超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。

 在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。

 超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。

 超滤技术的关键是膜。

 常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，能连续用1～2年。

 超滤膜的基本性能指标：水通量（cm3/(cm2•h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。

 超滤装置由若干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。

 由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。

 2.3.4 冰冻干燥

 冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，

2.转化作用：由外源性DNA导入宿主细胞,并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。供体菌死亡时释放或人工方法提取DNA，受体菌主动摄取外源性DNA 。

3.转导作用：当噬菌体从被感染的细胞释放出来,再次感染另一细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用，分普遍性转导和局限性转导。

4. 溶原性转换：噬菌体DNA与细菌染色体整合，从而使受体菌获得新的性状。

5. 原生质体融合：用溶菌酶或青霉素去除细菌细胞壁以产生原生质体，然后在聚乙二醇作用下使两个原生质体融合。