某一个蛋白，SDS凝胶电泳表明其分子量位于16900于37100标准带之间，当用巯基乙醇和碘乙酸处理该蛋白后经SD

DNA胶用来分离、确定或者纯化DNA片段。用于DNA测序反应的测序胶不在这儿讨论。每位实验室成员有不同的制胶方法。

样品准备

6 X 上样缓冲液： 30% (V/V) 甘油， 0.25%(W/V) 溴酚蓝， 0.25% (W/V) 二甲苯腈蓝，蒸馏水配制。贮于－20’C 。

样品缓冲液与DNA在60’C 温育5 分钟。

标准分子／分子质量标记

琼脂糖凝胶中，指示剂溴酚蓝与分子质量大约600bp的DNA分子一起迁移，而二甲苯腈蓝则与大约4000bp的DNA分子共迁移。确切的迁移与琼脂糖的质量与浓度有关。

溴酚蓝与二甲苯腈蓝也可以用做聚丙烯酰胺凝胶中DNA的指示染料。

市场上有无数的DNA标准分子质量标记。其中大多数是已知DNA酶切产生的片段组合。这些标准DNA标记产生不同大小的片段，使人更容易快速估计未知片段的大小，也提供了胶与胶之间差异的参照。也可以自己制备标准，但是通常太麻烦，不值得这么做。

表1指示剂染料的迁移

 聚丙烯酰胺（％）溴酚蓝a二甲苯腈蓝a

聚丙烯酰胺凝胶   

 3.5100460

 5.065260

 8.045160

 12.02070

 20.01245

变性聚丙烯酰胺凝胶   

 5.035130

 6.026106

 8.01970-80

 10.01255

 20.0828

a 数值表示与染料共迁移的DNA 片段的大致长度（核昔酸对）

分子标尺是DNA梯子，各大小片段间有一定的间距。最适用于精确测定样品DNA的分子质量。大多数包含有明显可见的参考条带。

保留一份最常用的DNA 标准分子标记。两组有用的DNA 标准标记分别为(bp): λ／ Hind Ⅲ： 23, 130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125

ФX174/ Hae Ⅲ: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118, 72

样式

中型胶盒vs 小型胶盒。小型胶用于监测酶切进程或者查看质粒抽提的质量，这是DNA

胶的两种最大用途。小型胶相对中型胶的优势在于电泳结束的时间较快（不到1 小时，中型胶3~4 小时）以及所需DNA 较少。Southern

印迹在大一点的胶上做较好，因为信号可能较弱需要较多的DNA 。

制备型胶VS 分析型胶。分析型胶用来收集信息。在制备型胶上，感兴趣的DNA 将被取走。制备型胶通常比较大，可容纳大批的样品。一块制备型胶可能只在胶的上端有一个极大的孔。

分离试剂

琼脂糖或者聚丙烯酰胺：分离能力VS 分离范围！

琼脂糖（分离范围大）的使用已经标准化，适于分离200bp-50kb 分子，水平方式电泳。10000kb 的DNA 可采用脉冲电场凝胶电泳(PFGE) 。

用聚丙烯酰胺（分离能力好）来分离小的DNA 片段， 5bp-500bp, 通常制备成垂直式凝胶。碱性琼脂糖凝胶用来水解DNA

和分析单个DNA 链。使用碱性琼脂糖凝胶的原因通常是想查看cDNA 合成过程中第一步由逆转录合成的第一和第二条DNA

链的大小。往热的琼脂糖中加入碱液会水解琼脂糖，所以先以中性溶液制成胶，再在电泳前用新鲜配制的碱性电泳缓冲液平衡凝胶。

经化学修饰的低熔点琼脂糖在较低温度下融化(30’C 成胶， 65’C 融化） 。分辨力好于普通琼脂糖， 但不及聚丙烯酰胺。在冷库中跑电泳以防止琼脂糖凝胶的融解。低熔点琼脂糖很有用，因为有很多种方法从低熔点琼脂糖中回收DNA。

采用合适的琼脂糖浓度。见表2

表2 DNA 电泳所采用的胶浓度

种类成分分离范围

A琼脂糖（％）线性DNA 分子的有效分离范围(kb)

 0. 360~5

 0 .620 ~1

 0.710~0.8

 0 .97 ~0.5

 1.26~ 0.4

 1.54~ 0.2

 2 .03~ 0.1

B丙烯酰胺（％ ）有效分离范围（ 核昔酸对）

 3. 5100 ~ 1000

 5.080 ~ 500

 8 .060 ~ 400

 12 .040 ~ 200

 20.010 ~ 100

A 选择般能分开你要分析的D N A 大小的琼脂糖浓度。

B 如果你感兴趣的DNA 小于1kb, 可用聚丙烯酰胺凝胶。

缓冲液

制胶和实际电泳采用同种缓冲液。

如果用水代替缓冲液来配胶（这是最常犯的错误之一），胶上几乎没有电导， DNA就会移动得很慢或者根本不移动。这时候需要重新配胶。

最常用于DNA 的缓冲液是TAE (Tris－醋酸－ EDTA) 与TBE (Tris硼酸－EDTA),有时候也用TPE 。

用不同缓冲液来制胶、跑胶，结果有所不同。例如，双链线性DNA 片段在TAE 中比TBE 或者TPE 中迁移大约快15% ，而超螺旋DNA 的分辨率在TAE 中较好。

推荐使用TBE 。它具有最强的缓冲容量。

如果忘记在胶中加溴化乙锭，可以加到电泳缓冲液中。

表3 常用电泳缓冲液

缓冲液工作溶液高浓度贮液（每升）

Tris－乙酸(TAE)l X: 0.04 mol/L Tris- 乙酸

0.001 mol/L EDTA

50 X : 242 g Tris 碱

57.1 ml 冰乙酸

100 ml 0. 5 mol/L EDTA (pH 8.0)

Tris – 磷酸(TPE)1 x : 0. 09 mol/L Tris- 磷酸

0.002 mol/L EDTA

10 X : 108 g Tris 碱

15 .5 ml 85 ％磷酸(1.679 g/ ml)

40 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8 .0)

Tris－硐酸a(TBE)0.5X: 0.045 mol/L Tris －绷酸

0.001 mol/L EDTA

5 X: 54 g Tris 碱

27 .5 g 硐酸

20 ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)

碱b1 X : 50 mN NaOH

1 mmol/L EDTA

1 x: 5 ml 10 N NaOH

2 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)

a 高浓度TBE 长时间储存会产生沉淀。为避免产生沉淀，储存5 X 溶液于玻璃瓶，室温， 丢弃任何有沉淀的批次。TBE 的琼脂糖凝胶电泳最初采用1 X 的工作强度（即1：5 稀释高浓度贮液），但是0.5 x 的工作溶液能提供足够的缓冲能力。现在几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1:10 稀释贮液来进行。TBE 的聚丙稀酰胺凝胶电泳是用1 X 工作强度进行的，是通常琼脂糖凝胶电泳强度的两倍。用于聚丙稀酰胺电泳垂直槽的缓冲液的贮备液很小，而穿过其中的电流量很大。需要1 X TBE 来提供足够的缓冲能力。

b 碱性电泳缓冲液应该新鲜配制。

电源

电压的使用。随着电压的增大，琼脂糖凝胶的分辨有效范围减小。为获得大于2kb的DNA 片段的最佳分辨率，以5V/cm

或者更低的电压进行电泳（两个电极之间的距离，cm) 。5-10 V/cm 可适用于大多数的胶。对一些缓冲液来说， 100 V 大约是50 mA 。

如果电泳过夜，总电压可以是20-25 V 。可以在第二天早上调高电压。

采用稳功率而不是稳压或者稳流可以防止大的电压峰或者产生过热。

以比普通胶慢得多的速度电泳低熔点胶，避免产热。

染色

胶融化之后加入溴化乙锭。每10 ml 琼脂糖溶液加1 μI 10 mg/ml 的溴化乙锭。

并不一定要往缓冲液中加溴化乙锭，可以在电泳后染色，胶体中的溴化乙锭已足够看到大多数条带。

分析

胶中的DNA 可以通过紫外透视灯观察。

戴手套，把胶平放在塑料薄膜上。可以用一个托架或者盘子来移取胶／塑料薄膜，但是托盘将会吸收过多的紫外线，可能看不到染色较浅的条带。

没有经RNA 酶处理的DNA 胶经常可以看到在胶的底部类似扩散条带的tRNA 。

为什么会有这么多的DNA 条带？即未被酶切的质粒DNA 可能在胶上呈现不止一条。

因为超螺旋环形（未被酶切） 、带切口环形（部分酶切）以及线性（完全酶切） DN在胶上以不同速度迁移，因此一个未完全酶切的DNA 可能显示三条不同的条带。

很难预测哪一条带是哪一个DNA, 因为琼脂糖浓度、电流强度与缓冲液类型都有一定影响，但是一般来讲，超螺旋DNA 像一颗致密子弹一样穿过凝胶，跑得最快，线性及切口DNA 紧随其后。

制胶

琼脂糖凝胶

DNA 胶现配现用。事先配制的胶可以储存在电泳缓冲液中或者包在塑料薄膜中， 置于冰箱过夜。

利用稀释后的10X 贮液和琼脂糖来制胶。在三角烧瓶中配制所需的量，或者在玻璃瓶中配制足以制成几块的胶。琼脂糖会固化，但是可以在微波炉中重新融化。储存琼脂糖／缓冲液＂溶液＂于室温。

琼脂糖有几个级别。越纯（越昂贵）污染的蛋白质越少，盐类与其他多糖等污染物也越少。也有适于分离不同大小核昔酸的琼脂糖。如果需要回收DNA, 使用你能承受的最贵的琼脂糖，因为污染物可能抑制酶活性，成为成功克隆的主要障碍。

微波炉加热

把盖子松松地放在瓶子上，必须能让空气流出，否则瓶子有可能爆炸。如用的是烧瓶，用大一点的，减少暴沸的可能。你可以让口开着或者用塑料膜松松地扎在开口上，不要用铝箔！

把微波炉调到高温。新鲜配制的琼脂糖比固化的琼脂糖需要更长的加热时间。100 ml 可能需要3~5mm，更多的话大约6-l0min 。

1 min 后，停掉微波炉，戴着手套抓住瓶子，摇转瓶子及其内容物。混合均匀的东西加热得更快更平稳。

把瓶子放回微波炉中再加热。1 min 后停止，摇匀。

再把瓶子放回微波炉加热，直到即将沸腾。

用夹子或者耐热手套取出瓶子。

待琼脂糖冷却，直到能用手触摸。倒胶之前摇匀。如果发现部分琼脂糖已经开始固化，用微波炉稍稍加热一下。

电泳缓冲液还有一个组分是EDTA（乙二胺四乙酸），加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+

等离子，防止电泳时激活

DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

此外，我们常常用“电泳法”判断液体的性质，是胶体还是溶液。在高中化学中我们就用过这种方法判断给定的液体是否为胶体。

在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).

1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用.

2)电泳

取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.

3)银染法

将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色.

四、SSCP的应用

自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生 有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.最近Sugano等用银染色SSCP法，成功地检测 了c-Ki-ras2基因第12位的突变，电泳和银染色过程在2.5小时内完成.SSCP还用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤 1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法检测了28名B 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并与DNA-SSCP和直接基因测序法进行了比 较，发现在全长2.6kbp的凝血因子IX基因组中，有20处碱基点突变，RNA-SSCP可检测 出其中的70%，而DNA-SSCP只能检测出35%，显示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的灵敏 性.

SSCP法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染 情况、以及病原体传播途径的研究中.Yap用巢式PCR对来自不同国家和地区的HBV标品 进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同，不 仅证明了HBVDNA具有地区性变异，而且排除了交叉性污染的可能性，为保证PCR诊断 结果的可靠性找到了好方法.另外，Yap等还将SSCP用于DNA定量分析上，他们将SSCP 与竞争性PCR法相结合进行乳腺癌细胞突变p53基因的定量分析，并取得了初步成功. 该方法的优点在于，内标和待测DNA只有一个碱基不同，这样使内标和待测DNA有相同 的扩增条件，从而更准确地测出DNA的量.从以上可以看出，SSCP正在分子生物学领域 发挥着巨大的作用.

五、SSCP注意的事项

SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP达到最佳效果，应注意下列事项.

①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变， SSCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段 可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的 立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的 结果.

②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链 的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用 较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以 上.

③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温 度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度 升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较 高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使 不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使 之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.

④DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的 影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链 上的位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来).White曾 设计了一组样品DNA片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发 夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%)，说明 DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检.

⑤SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因 此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判 定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检 测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无 变化.例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有 改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具 体实验进行选择确定.总之，SSCP分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法， 适合临床实验室的要求.它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入.随着 SSCP分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具.

琼脂糖凝胶电泳是常用的分离和检测方法，琼脂是最常用的载体支持物，核酸分子具有电荷效应和分子筛效应，利用此特性可达到分离检测的目的。一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(agarose，约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。1.琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。2.琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98%~99%)，近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。3.琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。4.电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。二、DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系①DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。②琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。表琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/%0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.12、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA(covalentlyclosedcircular，cccDNA)>直线DNA>开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=0)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0)，由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。3、电泳方法①凝胶类型用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。②缓冲液系统缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TEA)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍0.5×工作溶液即能提供足够缓冲能力。③凝胶的制备以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。④样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。⑤电泳琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。⑥染色和拍照常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。注意事项：电泳中所使用的染料EB是致癌物质，一定要小心，避免其接触皮肤等，进行电泳操作的时候一定要带手套，手套要及时更换，现在也除了一些EB的替代物，如Goldview等。