巯基乙醇在电泳中的作用

50mM的β巯基乙醇配置：算出来mol，然后最好用移液枪配制浓溶液，然后稀释后用，这样可以配制减少误差。比如液体的纯度是90%，密度是0.8，我们就可以知道1ml液体含有多少羟基乙醇(m=pV*0.9)，然后n=m/M，最后c=n/V。

如果你要跑还原性电泳，样品需要用含有β-巯基乙醇的loading buffer沸煮5分钟，这样使蛋白间的二硫键在还原剂β-巯基乙醇的作用下被打开，得到的是蛋白的一级结构。

而非还原的电泳就是在loading buffer中不加入还原剂β-巯基乙醇，这样的电泳比较能够真实的反应蛋白当时的情况，比如二聚体或者多聚体之类的。

化学性质

乙醇的官能团是羟基（—OH），其化学性质主要由羟基和受它影响的相邻基团决定，主要反应形式是О—H键和C—О键的断裂。羟基的结构特征是氧的电负性很大，分子中的C—О键和O—H键都是极性键，因而乙醇分子中有2个反应中心。由于α-H和β-H受到C—О键极性的影响具有一定的活性，因此它们还能发生氧化反应和消除反应等。

以上内容参考：百度百科-2-巯基乙醇

聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式：非变性电泳（Native-PAGE）和变性电泳（SDS-PAGE）。非变性电泳，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开；而变性电泳（SDS-PAGE）仅根据蛋白质亚基分子量的不同分开蛋白质（可以忽略电荷因素）。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

强还原剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。有些蛋白含有二聚体或多聚体，如果加入β-巯基乙醇，它会还原多聚蛋白之间和内部的二硫键，这样，电泳的样品将会被完全还原成单体甚至亚基形式，不加还原剂的样品则会保持聚体的形式。

SDS-PAGE有非还原SDS-PAGE和还原SDS-PAGE之分，均是变性条件下的电泳。非还原与还原的区别是在样品处理时是否加入还原剂（如β-巯基乙醇或DTT等）。

在进行电泳方法选择时，首先要明确目标蛋白的结构特点，以及电泳目的预期，来决定是否需加入还原剂。

如需测定目标蛋白的纯度及分子量，且目标蛋白为单体结构，二聚体、多聚体以及降解物均为其杂质成分，则一般采用非还原SDS-PAGE：采用该电泳方法，二聚体、多聚体在凝胶中的位置会处于单体分子量2倍或多倍的位置，利于观察及各组分的定性定量分析。

如果仅需测定蛋白质亚基结构的分子量，则需采用还原SDS-PAGE，将二聚体、多聚体降解为单体，甚至降解为更低级的亚基结构（如抗体的重链和轻链）。理想情况下，若还原充分，仅可见亚基条带。

来源：网页链接

SDS使蛋白质变性，用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸-蛋白复合物。在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。

巯基乙醇用于打开二硫键的，使蛋白质的四级或三级结构被破坏。

甘油使样品处于下面，不易飘起，并有保护作用。

溴酚蓝用于显色，起指示作用。

扩展资料

SDS的用途

1、用作洗涤剂和纺织助剂，也用作牙膏起泡剂、矿井灭火剂、乳液聚合乳化剂、羊毛净洗剂等。

2、用作阴离子型表面活化剂、乳化剂及发泡剂。

3、GB 2760-96规定为食品工业用加工助剂。发泡剂；乳化剂；阴离子型表面活性剂。用于蛋糕、饮料、蛋白、鲜果、果汁饮料、食用油等。

4、用作药物、化妆品、合成树脂的乳化剂。牙膏、灭火器的发泡剂。用作丝毛类精品织物的洗涤剂。金属选矿的浮选剂。

5、用作洗涤和纺织助剂，也用作牙膏发泡剂，灭火泡沫液，乳液聚合乳化剂，医药用乳化分散剂，洗发剂等化妆制品，羊毛净洗剂。

6、生化分析，电泳，离子对试剂。

（本方案摘自《蛋白质技术手册》汪家政、范明）

组分：Tris-HCl pH6.8（60 mM）；SDS （2%）；溴酚兰（0.1%）；甘油（25%）；β-巯基乙醇（14.4 mM）

配制过程：

1. 量取1M Tris-HCl （pH6.8） 0.6 ml；50%的甘油5 ml；10%的SDS溶液2 ml；1%的溴酚兰1 ml；

2. 加入去离子水定容至10 ml；

3. 分装；

4. 在4℃可保存数周，-20℃可保存数月之久。

你还可以参考下面这个配方：

2×SDS凝胶加样缓冲液 组分（摘自《分子克隆》第三版）

Tris-HCl pH6.8（100 mM）；SDS （4%）；溴酚兰（0.2%）；甘油（20%）；β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（200 mM）

不含硫代试剂的加样Buffer可在室温保存。β-巯基乙醇或二硫苏糖醇临用前加入。

百度知道里有这么一句：“用CTAB法提取某些易发生褐变物种的DNA时不加肯定会对细胞产生影响，但具体会有何影响则视具体物种，操作环境和具体方法的不同而定”。虽然百度知道的可信性有点...不过物种不同所以效果不同也的确是普遍存在的现象。

我做实验的感觉是，东西做出来是王道，现成的protocol只是参考。比如我自己提蛋白用的裂解液的配方是自己摸出来的，跟其他人和文献上都不一样。如果你们实验室这种提取方法提取出的DNA质量的确好，并且是可重复的，那就这么做好了。机理细节，也许就是物种特异性、氧化性不强，也有可能是你们用的这一批巯基乙醇质量一般，或者混入了其他东西。如果想要验证，可以再买另一个公司的试试，当然如果只focus在DNA上，并且现在已经很好了，就这么做下去也不妨。不是不求甚解，而是主次有别。

植物学门外汉，一家之言，仅供参考。祝实验顺利=)

问一下你们试验提取的是不是总蛋白？还是特定的一种蛋白？我想应该是提的总蛋白，那么就应该做到：尽量提取完全；应使所有蛋白全部处于溶解状态；防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性。看看你的目的蛋白的特性，是亲水性的还是疏水性的，再决定留上清还是沉淀，如你的样品是蛋白质沉淀物，加入50--100ul的SDS加样缓冲液并在同样加热后在上样

1.SDS-PAGE的类型

在SDS-PAGE中，由于蛋白质与SDS结合后都带负电，因此是阳极电泳。

与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳相似，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳也可分为圆盘电泳、垂直平板电泳和水平平板电泳。其中平板电泳较常使用。

  SDS-PAGE一般来说不采用连续电泳方式，因为在SDS-PAGE中蛋白质间不存在电荷密度差异，多采用不连续电泳方式。不连续电泳中蛋白质的分离主要取决于其分子大小和形状。不连续电泳的分离胶可以是均一胶，也可以是梯度胶。

2.SDS-PAGE的原理

  对于SDS-PAGE，由于在电泳体系中加入了十二烷基硫酸钠（SDS）和强还原剂（如巯基乙醇，二硫苏糖醇等），其中SDS作为阴离子去污剂会破坏蛋白质的氢键和疏水相互作用，导致蛋白质构象改变，而巯基乙醇等可以打开蛋白质分子内的二硫键，使其分解为亚基，因此电泳过程中蛋白质的生物活性丧失或减弱，但电泳后可恢复或部分恢复其活性。

  在离子强度低时，主要以单体形式存在的SDS可以与蛋白质结合，生成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，复合物所带的负电荷远远超过蛋白质原有的负电荷，这使得不同蛋白质间电荷的差异被掩盖。而SDS-蛋白质复合物形状都呈椭圆棒形，棒的长度与蛋白质亚基分子量有关，所以在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白只存在分子大小的差别，利用这一点可将不同的蛋白质分开 （分子筛效应），因此SDS-PAGE常用于检测蛋白质亚基的分子量及鉴定纯度。

  与常规PAGE类似，不连续SDS-PAGE对蛋白质的分离除了基于分子筛效应外，还基于其对样品的浓缩效应。

3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法

  样品缓冲液中须含有3～4倍于蛋白质的SDS以及足够断裂二硫键的β-巯基乙醇或二硫苏糖醇，而且蛋白须完全变性展开。由于每克伸展的蛋白质结合1.4g单体SDS，因此通常在样品缓冲液中加1％～2％（10～20g/L）SDS，在凝胶及电泳缓冲液中加0.1%SDS。

制胶

  SDS-PAGE多采用不连续的电泳方式，其制胶方法与常规PAGE的制胶方法基本一致，但由于凝胶中含有SDS，容易起泡，低温下又易结晶析出，因此单体储备液不需抽气，聚合时的凝胶也不适宜在4℃放置。制胶模具的准备也同常规PAGE相同。下面就介绍不连续电泳中的阳极电泳的制胶方法。

（1）凝胶储备液的配制

① 丙烯酰胺储备液T＝30％，C固定，2.6%～3%。

② 4×分离胶缓冲液 如pH＝8.8、1.5mol/L Tris-HCl缓冲液，含0.4%SDS。

③ 4×浓缩胶缓冲液 如pH＝6.8、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液，含0.4%SDS。

④ 10％过硫酸铵溶液（AP）。

注：丙烯酰胺是神经毒剂，应戴手套操作。电泳时的试剂应达到电泳纯，并使用重蒸水配制溶液。

（2）分离胶配方

A液/ml B液/ml 重蒸水/ml 10%AP/μl TEMED/μl

x/30×10=x/310/4=2.510-x/3-2.5约503～5

  根据聚合的快慢来调节AP和TEMED的用量，使凝胶在20～60min内聚合。

（3）制备浓缩胶

制备样品和加样

  5×样品缓冲液：pH＝6.8、0.06mol/L （0.4mol/L）Tris-Hcl缓冲液，含25％（50％）甘 油、2％（10％）SDS、5％ （体积分数）巯基乙醇和0.1％溴酚蓝。

  将蛋白质溶液与5×样品缓冲液以4：1（体积比）的比例混合（如果蛋白质溶液浓度过高，需预先脱盐处理）后，在100℃水浴中加热3～5min，使蛋白质充分变性，再于10000r／min离心5min，取上清加样。

电泳

  电泳缓冲液：pH＝8.3，0.025mol/L Tris-0.192mol/L Gly缓冲液，含0.1％SDS。

1、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用很好的并且长期的保护SH基团，得到较窄的谱带另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，以防止银染时的纹理现象。

染色和检测

（1）考马斯亮蓝法，在SDS-PAGE后，凝胶的固定和染色时间应比常规PAGE的长1倍左右，或用多倍体积染色液染色，以排除SDS的影响。

（2）银染法，在电泳后染色之前，必须将凝胶多次漂洗，以除去SDS。

4.影响分离结果的因素

缓冲系统

  在SDS对蛋白质的助溶作用以及负电荷的包裹作用影响下，蛋白质的分离仅依据亚基的分子大小，因此缓冲系统的选择比较简单，只要利于分离并保持蛋白质的稳定以及不与SDS发生相互作用即可。常用的缓冲系统有 Tris-Gly缓冲液，其余如磷酸缓冲液（多用于连续电泳）、Tris-醋酸盐缓冲液、Tris-硼酸盐缓冲液、咪唑缓冲液以及SDS-尿素系统 （用于分离低分子量蛋白样品）。离子强度一般为0.01～0.2mol/L。

  SDS-PAGE为阳极电泳，在凝胶缓冲液中加入 0.1％SDS，在样品缓冲 液中加1％ ～2％SDS和1％～6％巯基乙醇 （或3％二硫苏糖醇），并加适量溴酚蓝，在电极缓冲液中加0.1％SDS，不连续电泳的凝胶缓冲液和样品缓冲液中还需加适量甘油。

凝胶浓度

  由于凝胶浓度决定凝胶孔径大小，而凝胶孔径影响电泳效果 （即凝胶的分子筛效应）。特别是对于SDS-PAGE，由于电泳分离只取决于SDS-蛋白质亚基胶束的大小，因此凝胶浓度的选择尤为重要。应根据样品中蛋白质的分子量范围选择合适的凝胶浓度

C=2.6% C=5%

凝胶浓度（T）/%分子量范围/kDa凝胶浓度（T）/%分子量范围/kDa

5

10

15

20

25-200

10-70

＜50

＜40

5

10

15

20

60-170

20-100

10-50

5-40

而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白.这个技术首先是1967年由shapiro建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视.

SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二.三级结构.而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂.在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异.

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,于连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率.

浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带.当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电级液选TRIS/甘氨酸.电泳开始后,HCL解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子.蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中.电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层.