动物肝脏中dna的提取实验中每步的上清液与沉淀中分别含什么物质

蓝色。

DNA遇二苯胺变成蓝色。二苯胺和DNA沸水呈现蓝色，是因为发生了可逆反应的平衡移动，显示蓝色的离子数量明显多于其他时就会产生蓝色效应。脱氧核糖核酸是分子结构复杂的有机化合物。作为染色体的一个成分而存在于细胞核内。功能为储藏遗传信息。DNA分子巨大，由核苷酸组成。核苷酸的含氮碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶；戊糖为脱氧核糖。二苯胺为白色至浅灰色结晶。有花香和苯胺的气味，需避光保存。熔点53℃，沸点302℃。不溶于水，溶于二硫化碳、苯、乙醇、乙醚等。能与强酸生成盐。DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色。二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤:

1.提取细胞核物质:顺时针方向搅拌，稍快，稍重。

5

min

2.溶解DNA:

3.析出含DNA的黏稠物:蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢

4.过滤:取黏稠物

5.再溶解:顺时针方向搅拌，较慢。3

min

6.过滤:取滤液。

7.提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5

min

8.DNA的鉴定:沸水浴5min

大学:

DNA提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。

将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

2.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法②化学试剂法:用SDS处理细胞③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

3.DNA提取的几种方法

(1).浓盐法

A.

利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M

氯

纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的

氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA

钠盐沉淀出来.

B.

也可用0.15

MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA

时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA

的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA

的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.

(2).阴离子去污剂法

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA

.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA

(3).苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA

联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA

的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA

。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态

(4).水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%

，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.

结果就是得到DNA

样品准备

6 X 上样缓冲液： 30% (V/V) 甘油， 0.25%(W/V) 溴酚蓝， 0.25% (W/V) 二甲苯腈蓝，蒸馏水配制。贮于－20’C 。

样品缓冲液与DNA在60’C 温育5 分钟。

标准分子／分子质量标记

琼脂糖凝胶中，指示剂溴酚蓝与分子质量大约600bp的DNA分子一起迁移，而二甲苯腈蓝则与大约4000bp的DNA分子共迁移。确切的迁移与琼脂糖的质量与浓度有关。

溴酚蓝与二甲苯腈蓝也可以用做聚丙烯酰胺凝胶中DNA的指示染料。

市场上有无数的DNA标准分子质量标记。其中大多数是已知DNA酶切产生的片段组合。这些标准DNA标记产生不同大小的片段，使人更容易快速估计未知片段的大小，也提供了胶与胶之间差异的参照。也可以自己制备标准，但是通常太麻烦，不值得这么做。

表1指示剂染料的迁移

 聚丙烯酰胺（％）溴酚蓝a二甲苯腈蓝a

聚丙烯酰胺凝胶   

 3.5100460

 5.065260

 8.045160

 12.02070

 20.01245

变性聚丙烯酰胺凝胶   

 5.035130

 6.026106

 8.01970-80

 10.01255

 20.0828

a 数值表示与染料共迁移的DNA 片段的大致长度（核昔酸对）

分子标尺是DNA梯子，各大小片段间有一定的间距。最适用于精确测定样品DNA的分子质量。大多数包含有明显可见的参考条带。

保留一份最常用的DNA 标准分子标记。两组有用的DNA 标准标记分别为(bp): λ／ Hind Ⅲ： 23, 130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125

ФX174/ Hae Ⅲ: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118, 72

样式

中型胶盒vs 小型胶盒。小型胶用于监测酶切进程或者查看质粒抽提的质量，这是DNA

胶的两种最大用途。小型胶相对中型胶的优势在于电泳结束的时间较快（不到1 小时，中型胶3~4 小时）以及所需DNA 较少。Southern

印迹在大一点的胶上做较好，因为信号可能较弱需要较多的DNA 。

制备型胶VS 分析型胶。分析型胶用来收集信息。在制备型胶上，感兴趣的DNA 将被取走。制备型胶通常比较大，可容纳大批的样品。一块制备型胶可能只在胶的上端有一个极大的孔。

分离试剂

琼脂糖或者聚丙烯酰胺：分离能力VS 分离范围！

琼脂糖（分离范围大）的使用已经标准化，适于分离200bp-50kb 分子，水平方式电泳。10000kb 的DNA 可采用脉冲电场凝胶电泳(PFGE) 。

用聚丙烯酰胺（分离能力好）来分离小的DNA 片段， 5bp-500bp, 通常制备成垂直式凝胶。碱性琼脂糖凝胶用来水解DNA

和分析单个DNA 链。使用碱性琼脂糖凝胶的原因通常是想查看cDNA 合成过程中第一步由逆转录合成的第一和第二条DNA

链的大小。往热的琼脂糖中加入碱液会水解琼脂糖，所以先以中性溶液制成胶，再在电泳前用新鲜配制的碱性电泳缓冲液平衡凝胶。

经化学修饰的低熔点琼脂糖在较低温度下融化(30’C 成胶， 65’C 融化） 。分辨力好于普通琼脂糖， 但不及聚丙烯酰胺。在冷库中跑电泳以防止琼脂糖凝胶的融解。低熔点琼脂糖很有用，因为有很多种方法从低熔点琼脂糖中回收DNA。

采用合适的琼脂糖浓度。见表2

表2 DNA 电泳所采用的胶浓度

种类成分分离范围

A琼脂糖（％）线性DNA 分子的有效分离范围(kb)

 0. 360~5

 0 .620 ~1

 0.710~0.8

 0 .97 ~0.5

 1.26~ 0.4

 1.54~ 0.2

 2 .03~ 0.1

B丙烯酰胺（％ ）有效分离范围（ 核昔酸对）

 3. 5100 ~ 1000

 5.080 ~ 500

 8 .060 ~ 400

 12 .040 ~ 200

 20.010 ~ 100

A 选择般能分开你要分析的D N A 大小的琼脂糖浓度。

B 如果你感兴趣的DNA 小于1kb, 可用聚丙烯酰胺凝胶。

缓冲液

制胶和实际电泳采用同种缓冲液。

如果用水代替缓冲液来配胶（这是最常犯的错误之一），胶上几乎没有电导， DNA就会移动得很慢或者根本不移动。这时候需要重新配胶。

最常用于DNA 的缓冲液是TAE (Tris－醋酸－ EDTA) 与TBE (Tris硼酸－EDTA),有时候也用TPE 。

用不同缓冲液来制胶、跑胶，结果有所不同。例如，双链线性DNA 片段在TAE 中比TBE 或者TPE 中迁移大约快15% ，而超螺旋DNA 的分辨率在TAE 中较好。

推荐使用TBE 。它具有最强的缓冲容量。

如果忘记在胶中加溴化乙锭，可以加到电泳缓冲液中。

表3 常用电泳缓冲液

缓冲液工作溶液高浓度贮液（每升）

Tris－乙酸(TAE)l X: 0.04 mol/L Tris- 乙酸

0.001 mol/L EDTA

50 X : 242 g Tris 碱

57.1 ml 冰乙酸

100 ml 0. 5 mol/L EDTA (pH 8.0)

Tris – 磷酸(TPE)1 x : 0. 09 mol/L Tris- 磷酸

0.002 mol/L EDTA

10 X : 108 g Tris 碱

15 .5 ml 85 ％磷酸(1.679 g/ ml)

40 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8 .0)

Tris－硐酸a(TBE)0.5X: 0.045 mol/L Tris －绷酸

0.001 mol/L EDTA

5 X: 54 g Tris 碱

27 .5 g 硐酸

20 ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)

碱b1 X : 50 mN NaOH

1 mmol/L EDTA

1 x: 5 ml 10 N NaOH

2 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)

a 高浓度TBE 长时间储存会产生沉淀。为避免产生沉淀，储存5 X 溶液于玻璃瓶，室温， 丢弃任何有沉淀的批次。TBE 的琼脂糖凝胶电泳最初采用1 X 的工作强度（即1：5 稀释高浓度贮液），但是0.5 x 的工作溶液能提供足够的缓冲能力。现在几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1:10 稀释贮液来进行。TBE 的聚丙稀酰胺凝胶电泳是用1 X 工作强度进行的，是通常琼脂糖凝胶电泳强度的两倍。用于聚丙稀酰胺电泳垂直槽的缓冲液的贮备液很小，而穿过其中的电流量很大。需要1 X TBE 来提供足够的缓冲能力。

b 碱性电泳缓冲液应该新鲜配制。

电源

电压的使用。随着电压的增大，琼脂糖凝胶的分辨有效范围减小。为获得大于2kb的DNA 片段的最佳分辨率，以5V/cm

或者更低的电压进行电泳（两个电极之间的距离，cm) 。5-10 V/cm 可适用于大多数的胶。对一些缓冲液来说， 100 V 大约是50 mA 。

如果电泳过夜，总电压可以是20-25 V 。可以在第二天早上调高电压。

采用稳功率而不是稳压或者稳流可以防止大的电压峰或者产生过热。

以比普通胶慢得多的速度电泳低熔点胶，避免产热。

染色

胶融化之后加入溴化乙锭。每10 ml 琼脂糖溶液加1 μI 10 mg/ml 的溴化乙锭。

并不一定要往缓冲液中加溴化乙锭，可以在电泳后染色，胶体中的溴化乙锭已足够看到大多数条带。

分析

胶中的DNA 可以通过紫外透视灯观察。

戴手套，把胶平放在塑料薄膜上。可以用一个托架或者盘子来移取胶／塑料薄膜，但是托盘将会吸收过多的紫外线，可能看不到染色较浅的条带。

没有经RNA 酶处理的DNA 胶经常可以看到在胶的底部类似扩散条带的tRNA 。

为什么会有这么多的DNA 条带？即未被酶切的质粒DNA 可能在胶上呈现不止一条。

因为超螺旋环形（未被酶切） 、带切口环形（部分酶切）以及线性（完全酶切） DN在胶上以不同速度迁移，因此一个未完全酶切的DNA 可能显示三条不同的条带。

很难预测哪一条带是哪一个DNA, 因为琼脂糖浓度、电流强度与缓冲液类型都有一定影响，但是一般来讲，超螺旋DNA 像一颗致密子弹一样穿过凝胶，跑得最快，线性及切口DNA 紧随其后。

制胶

琼脂糖凝胶

DNA 胶现配现用。事先配制的胶可以储存在电泳缓冲液中或者包在塑料薄膜中， 置于冰箱过夜。

利用稀释后的10X 贮液和琼脂糖来制胶。在三角烧瓶中配制所需的量，或者在玻璃瓶中配制足以制成几块的胶。琼脂糖会固化，但是可以在微波炉中重新融化。储存琼脂糖／缓冲液＂溶液＂于室温。

琼脂糖有几个级别。越纯（越昂贵）污染的蛋白质越少，盐类与其他多糖等污染物也越少。也有适于分离不同大小核昔酸的琼脂糖。如果需要回收DNA, 使用你能承受的最贵的琼脂糖，因为污染物可能抑制酶活性，成为成功克隆的主要障碍。

微波炉加热

把盖子松松地放在瓶子上，必须能让空气流出，否则瓶子有可能爆炸。如用的是烧瓶，用大一点的，减少暴沸的可能。你可以让口开着或者用塑料膜松松地扎在开口上，不要用铝箔！

把微波炉调到高温。新鲜配制的琼脂糖比固化的琼脂糖需要更长的加热时间。100 ml 可能需要3~5mm，更多的话大约6-l0min 。

1 min 后，停掉微波炉，戴着手套抓住瓶子，摇转瓶子及其内容物。混合均匀的东西加热得更快更平稳。

把瓶子放回微波炉中再加热。1 min 后停止，摇匀。

再把瓶子放回微波炉加热，直到即将沸腾。

用夹子或者耐热手套取出瓶子。

待琼脂糖冷却，直到能用手触摸。倒胶之前摇匀。如果发现部分琼脂糖已经开始固化，用微波炉稍稍加热一下。

如PCR、Southern杂交这一类实验基本保证所需片段的完整，而二代测序实验为了获得全面的序列信息对DNA的完整性要求更高。

去除对下游实验中酶分子有抑制作用的有机溶剂和高浓度金属离子

将蛋白质、多糖、多酚等生物大分子的污染降到最低

去除其他核酸（如RNA对后续实验的影响）

血液、动物组织、培养细胞、鼠尾等

特点：细胞数量较多、样本成分相对单一

血清、血浆、鼻咽拭子、痰液、支气管/肺泡灌洗液、腹水、病毒、粪便、FFPE样本等

特点：细胞数量少、样本成分复杂

普通植物：拟南芥、小麦、玉米、水稻等

特点：存在细胞壁这样的保护结构、细胞内部还有液泡、叶绿体等细胞器成分相对复杂

多糖多酚类植物：水果果肉、植物种子等

特点：多糖与核酸理化性质一致、多酚氧化后易于核酸结合，影响DNA的提取

细菌:革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌等）、革兰氏阴性菌（大肠杆菌等）

特点：有细胞壁，有的细菌还有鞭毛和荚膜

真菌：酵母、真菌菌丝等

特点：存在以多糖为主要成分的细胞壁、细胞内部成分相对复杂

新鲜样本中受到内源性核酸酶影响相对最小，得到DNA质量相对更好。

投入过多样本，后续样本裂解不充分从而影响DNA提取情况，还会引入过多杂质及内源性核酸酶。

对于含有多糖多酚等次生代谢产物的衰老叶片可在4℃黑暗环境下饥饿1-2天；进行低温或冷冻保存可以避免内源性DNA酶对样本中的DNA进行一个降解。

-20℃短期保存（1-3个月），-70℃长期保存；福尔马林固定时间8-24h内为宜，样本存放时间不宜超过1年；FFPE样本保存温度4℃，建议不超过3年。

长时间使用福尔马林进行固定，里面有效成分甲醛会引起生物大分子之间形成广泛的亚甲基交联桥使DNA分子脆性增加，在剪切力的作用下，DNA分子容易断裂，同时DNA与蛋白质之间经广泛交联之后，可形成牢固的复合物，这样也阻止蛋白酶对组织的消化，从而影响DNA的提取。

可使用不同抗凝剂的抗凝管进行采集和保存；避免反复冻融，4℃短期保存3-4天，-20℃下可最多保存2年，-70℃下长期保存：全血、白细胞、血凝块、血清或血浆。

液氮研磨或匀浆

液氮研磨（最推荐）

研磨充分又保证样本处于低温条件下避免DNA降解

DNA存在于含有细胞核的白细胞中，而大量存在的红细胞会引入更多杂质和核酸酶，所以需要提前使用红细胞裂解液对红细胞进行去除。

贴壁细胞胰酶消化处理再做收集

悬浮细胞只要离心弃上清

溶菌酶破壁处理

如金黄色葡萄球菌加入一定量的溶菌酶在37℃条件下孵育30min就可完成破壁的处理

酶解破壁或液氮冻融或超声裂解法

脱蜡处理（二甲苯或矿物油类的物质进行脱蜡处理）

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可以溶解细胞膜，与核酸结合形成在高盐环境下可溶的复合物。

1.Tris-Hcl (PH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏

2.EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性

3.Nacl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相中

4.CTAB裂解细胞，与核酸结合形成在高盐环境下可溶的复合物

SDS法（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去垢剂，高温（55-60℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析，在高盐环境下或降低温度后蛋白、多糖等结合形成的复合物沉淀，释放核酸。

在氢氧化钠（PH12-12.6碱性环境）和去污剂SDS的作用下细胞破裂，细菌蛋白质和染色体DNA变性，双链DNA氢键断裂，DNA变性。加入酸性高盐缓冲液后PH恢复中性，共价闭合环状质粒DNA复性速度快于线性的染色体DNA。细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物被SDS包盖。之后复合物沉淀下来，质粒DNA留在上清中。

含有Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中加热至100℃使细菌裂解。通过加热破坏细菌外壁的同时有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。温度下降后，闭环DNA形成超螺旋分子，离心时留在上清中。

酚/氯仿抽提去除蛋白质，之后使用乙醇或异丙醇沉淀DNA

通过离心柱上的吸附膜，特异性吸附DNA

通过磁珠表面修饰（硅基质）从而特异性吸附核酸

检测原理：核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，最大吸收波长是260nm。

优点：操作简便、迅速

缺点：无法区分DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其他杂质，易得到浓度虚高值

常见仪器：Nanodrop、Onedrop

检测原理：采用荧光染料与特异的靶分子结合后发出荧光，仪器接收荧光值转化为浓度数据。

优点：灵敏度较高，操作简便

缺点：成本高，价格较贵；无法直接区分降解核酸

OD260：核酸的吸光度

OD280：蛋白质的吸光度

OD260/OD280 =1.7-1.9 说明纯度很好

OD260/OD280 <1.7 表明可能有蛋白质残留

OD260/OD280 >1.9 表明DNA可能存在部分降解，建议进行完整度检测或存在RNA残留

判断有无RNA、蛋白残留。1%-2%琼脂糖，上样1-3ul

判断DNA有无降解。1%-2%琼脂糖，上样1-3ul

通过胶图中DNA条带情况来判断

完整的基因组DNA条带单一且明亮，无任何拖尾或弥散。

出现不同程度的降解，胶图中可看到不同程度的拖尾或弥散。降解越严重弥散越亮，片段大小会越小。

保存形式：建议分装保存，避免DNA反复冻融，影响DNA的完整性。

保存液：

短期保存：对下游实验中离子浓度要求比较高的——PH为弱碱性的无菌水。

对离子浓度要求不高的——TE缓冲液（Tris、EDTA）。

长期保存：乙醇。

保存温度：-20℃/-80℃下可长期保存，4℃下保存时间最好不超过14天。

1.尽可能选择新鲜的样本，减少内源酶的作用

2.样本起始投入量不要超过所用方法的起始量标准

3.样本保存时尽可能的避免反复冻融

4.选择合适的处理方式并进行充分的样本前处理

5.前处理结束后在样本解冻前添加裂解液

6.需对样本进行充分裂解

7.正确添加所需试剂种类及使用量，样本量增加时裂解液也需成倍增加

8.对得到的DNA产物进行分装保存，避免反复冻融且保存时间不易太久

1.事先了解好提取样本中DNA含量水平

2.样本中发生DNA的降解，产量也会有所下降

3.选择合适的前处理及裂解方式（如延长裂解和沉淀DNA的时间等），并尽可能的将样本中的DNA完全释放出来

4.使用柱式试剂盒对DNA产物洗脱的时候，要尽可能的覆盖整个吸附膜；进行二次洗脱也可增加产量

5.使用沉淀法提取DNA时，可以在沉淀之前加入1/10体积的醋酸钠（PH5.2）有助于DNA沉淀

1.样本投入量不要太多，投入太多杂质也多以及后续裂解也不完全

2.样本应进行充分裂解，特别是对于一些比较复杂、含有较多杂质（多糖、多酚等）的样本需进行特殊处理

3.RNA残留：使用RNase对RNA进行处理，处理时间不宜太短（5min左右）

4.蛋白残留：使用蛋白变性剂或蛋白酶K

沉淀法分层吸取上清(DNA)时注意不要吸到下层沉淀蛋白

1.抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇，抗坏血酸，半胱氨酸，二硫苏糖醇等

2.加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合

1.高盐法：用高浓度的Na+、K+改变多糖的溶解特性，使其脱离水相进入有机相，然后用酚仿抽提去除

2.低浓度乙醇和醋酸钾溶液可以共同沉淀多糖

3.PVP/PVPP类物质对多糖的去除也有一定作用

1.质粒拷贝数

低拷贝质粒：pBR322、pACYC及其衍生载体、pSC101及其衍生载体、SuperCos、pWE15等

高拷贝质粒：pTZ、pUC、pBS、pGM-T等

低拷贝质粒适当增加样本投入量

2.菌种问题：保存时间、抗性筛选

如保存时间过久，提取质粒之前，这个质粒已经丢失，这种情况可选择活化，涂布平板培养后，重新挑选新的菌落来进行液体培养

3.选择合适的前处理及裂解方式，并尽可能的将样本中的DNA完全释放出来

4.使用柱式试剂盒对DNA产物洗脱的时候，要尽可能的覆盖整个吸附膜；进行二次洗脱也可增加产量

1.菌种收集时间

对于老旧菌种所含有的开环质粒的量明显高于属于对数生长期的菌种的。根据使用菌种生长情况找到对数生长期。一般来说对数生长期是生长速率常数最大，细胞分裂所用的代时最短的时候就是对数生长期。

2.胞内酶含量很高的宿主菌

先去除胞内酶，再提取质粒

3.变性裂解的时间不宜过长，也会对质粒完整性造成影响

4.碱裂解法加入中和液后操作应该轻柔(裂解时间不宜超过5min）

杂质有3种

1.RNA残留

使用RNase对RNA进行消化处理

2.基因组DNA残留

温和操作

在裂解或中和过程中，操作过于剧烈而导致基因组DNA的断裂

3.蛋白残留

使用蛋白变性剂或蛋白酶K进行消化

碱裂解法将中和后的体系置于4℃一段时间，使蛋白质残留沉淀下来更少

中和均匀彻底，将蛋白与试剂充分融合

加预冷的乙醇：冷的乙醇沉淀能力更强。乙醇沉淀DNA的机理是，DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

SDS：SDS只是阳离子表活性剂，是蛋白质，特别是膜蛋白的变性剂。在基因组DNA提取中，SDS只是起破碎细胞游离核酸的作用，无法使DNA与蛋白质分离的。只有在碱裂解法提取质粒DNA，通过高盐（醋酸钾或醋酸钠）及低pH（4.5左右）中和下，SDS会沉淀，SDS沉淀过程中使得变性的DNA共沉淀，而经过中和复性的质粒DNA则不会沉淀，再通过离心即可把质粒DNA与基因组DNA及蛋白质分离。

RNase是RNA酶，能特定消化RNA，而不是蛋白质。

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0, 若DNA高于1.8,则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。

现在试剂盒是很普及的，使用试剂盒基本上不再需要酚，氯仿等有机溶剂。国内很多厂家都有产，本人使用过广州捷倍斯生物产的感觉就很不错。

1、DNA不溶于乙醇，

2、乙醇可以吸附水分子（极性相同）,使得溶液中相对的水分子减少,增大了DNA在水中的相对浓度，

3、乙醇沉淀DNA需要盐离子,用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷,降低DNA分子间的斥力,才能沉淀完全。