如何防止提取过程中RNA的降解-建材号

RNA提取般步骤总结

^ 2 ^ G＃N1 EWRNA萃取原理：

/ |＃K0 K. @ 9 W |破碎细胞或组织RNA氯仿等机溶剂萃取并再经沉淀洗涤干燥溶解变性剂由于RNA酶处随能RNA降解所需要注意实验稍疏忽前功尽弃

0 T3 Z（F＆_D6 C％^Y A6 _RNA H6提取般步骤

- O：Y + X $ P＃S8 U4 M9所RNA提取程五关键点即：效破碎细胞或组织本效使核蛋白复合物变性内源性RNA酶效抑制效RNA提取DNA蛋白质混合??物参与效除糖杂质糖含量高品关键抑制RNA RNA提取阶段两种式使用：提取总RNA核酸沉淀氯化锂直接酸性条件酸性条件DNA蛋白质提取RNA留水相机相第提取导致量RNA损失种使用电流频率已经非低（O（克^ + K）F + I＆]％P

实验步骤：

* L＆D6 S5 E（Q1 F（G2 | J ^ 0坏组织RNA→沉淀→离RNA→洗涤→保存RNA→解冻RNARNA6 D8} QYg * X

甲破碎组织RNA酶失同进行使用盐酸胍异硫氰酸胍NP-40SDS蛋白酶K等粉碎组织加入β-ME抑制RNA性

S（％）F`0 [1 D *米] 0 e2RNA离般用苯酚氯仿等机溶剂通加入少量异戊醇并步骤离离RNA般布层蛋白质层离

＆X. P）I）YU / L＃[3般用乙醇3M醋酸钠（pH值5.2）或异丙醇沉淀RNA 2 @ 0 D＆Z7 + IG1 @

4用70％乙醇洗涤洗涤RNA避免RNA洗掉步骤省略洗涤干燥或干燥乙醇能太干否则难溶解

3 @％VO9 V + I1 J2 O9 KZ5融化RNA通用于TE

L5 F N6}（S1吨％Z＆J6保存RNA应低温防止痕量RNase污染离RNA富RNase品（胰脏肝脏）需要要存储甲醛期存储高品质RNA存储特别鼠肝脏RNA水存储星期鼠脾脏提取基本降解RNA提取仍存储水3稳定外度比跟踪RNase降解于4KB誊转录呈现更敏增加RNA品存储稳定性RNA溶解离甲酰胺并存储-70℃保存RNA甲酰胺必须包含自胰腺RNA碎片RNA降解甲酰胺至少节省使用面准备使用RNA：加入醋酸钠0.3 M12000×g离5钟沉淀RNA

P3 [7米* ^ $ U $ _

：F徐* N（（I氯化锂提取总RNA：

U}'IR'^'^＆升尿素变性蛋白高浓度本发明并抑制RNA酶RNA选择性用氯化锂沉淀特别适合于少量组织RNA提取量品具快速简洁处少量污染DNARNA产量高损失RNA片段缺陷＃?* S：} 9`* R4 Z3 P

检测试剂：

D $ R6 Q_ I8 Q1氯化锂/尿素溶液氯化锂126克（3M）尿素360克（6M）加水至1L通滤灭菌]

7 _8 W1吨O9'QI4 Z2悬浮液[10mMTris-HCl（pH值7.6）1mMEDTA（pH8 0）0.5％SDS]

M8第4季R＆Y：B＃`7测试程：7 [ $`*}O7 _ Z'{

1进行量组织或细胞每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂 - 尿素溶液匀浆器件速度匀浆2钟于数量细胞（107细胞/毫升）每克组织或细胞加入0.5毫升氯化锂 - 尿素溶液手匀浆并转移Eppendof管＆Y）B：EQL / ^ Q：\ $号

图2所示匀浆液放置0-4℃412000克离30钟 X-C6 D-N / N0 K表 T2 A

3颗粒加入1/2体积原始匀浆液体氯化锂 - 尿素溶液重复步骤2

）YX）S0 K9 Y6 Je4用1/2体积原匀浆液氯化锂 - 尿素溶液重构沉淀加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇室温15-30钟摇组合4000克离5钟

3 D2 VI1??（?* D5水清液添加1/10倍体积3M乙酸钠（pH5.2）2倍体积乙醇??-20℃进行15000克离

L4Q4 U L：* K％Z $ （E670％乙醇沉淀洗涤并真空干燥3}R0 [/ Q'G9 Q

RNARNA溶解液溶解沉淀物装保存于-70℃

0 F X％R（H％B7?

Y7 J5 U $ C'|）[％? J3e：Q蛋白酶 - 热酚|^ 0 B *）P3 S * C4 B4 H4升

本发明适合病毒RNA提取

* I（I + B＃RK测试试剂：

$ 4 [7 H9`）蛋白酶K（终浓度50ug/ml）J1J5 P L6 V / T7 [/ I

22×缓冲液：1％SDS20mM Tris-HCl（pH值7.6） 0.2MnaCL9 HP] Y + \ $ Z）O

测试程序：＃W3 [$] 5 Y V8 G1

1纯化病毒溶液加入等体积缓冲液蛋白酶K37℃40-50钟

- K0 - P / E'Q-Z7?G0 M＃{＃D2加入等体积65°?预热酚溶液轻徭薄赋光5钟65℃徭培养

W `W（E：酷睿i3 ^ 3离取清液氯仿萃取间（Z0 DJ2 7米+ D2 Q＆X?

4取层水相加1/10倍体积3M乙酸钠（pH5.2）2倍体积乙醇??-20℃进行1离离5000克（万克10钟）

7 [/瓦特氢气D6 U $ k570％乙醇洗涤沉淀物真空干燥

％A5 Y{（W％3 * Y O E）P6 RNA溶解液溶解沉淀RNA装保存于-70℃策植物RNA提取程难

策植物RNA提取程难

）O5 B7 D / Q3 _酚类化合物干扰及策：

A9 D * Z3 K 7 W许植物组织特别水（苹樱桃李葡萄等）植物树木植物含丰富酚类化合物酚与植物增加含量更容易轻植物材料RNA提取外针叶树植物落叶植物叶织针酚含量要高氧化匀浆焦黄加深植物材料匀浆酚类物质释放氧化程度增加种现象称褐变影响（BROWNING效）酚类化合物（例醌类）与RNA稳定结合氧化影响RNA离纯化纽伯与酚类总量材料没发现RNA提取难易程度间相关性并非所酚类化合物影响RNA提取般认所谓缩合单宁聚合物羟基黄酮醇类物质（原花青素物质）影响RNA提取类化合物除酚类化合物般初始阶段提取防止氧化离RNA 9 B0 S} 0 U6 | 9 K / L VV G1?/ @

防止氧化酚化合物：

V yA4 K7 N /原Z1：般提取缓冲液加入（ - 巯基乙醇二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸防止酚类氧化提取溶液（ - 巯基乙醇浓度高2％（ - 巯基乙醇等断便苏由酚氧化酶失二硫化物即添加沉淀RNA夜（ - 巯基乙醇（终浓度1％）防止氧化程硼氢化钠（硼氢化钠）酚类化合物原醌原剂用提取缓冲液处理棕色消减醌化合物原酚化合物

＆H Z P +?＆T％T5 G＆G1 M-P / Q U2螯合剂：螯合剂聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）CO-N =基团包括酚化合物强结合能力结合能力与酚化合物芳香环数目增加羟基加强原花青素物质包含许芳香环羟基基团其形稳定复合物与PVP或溶性PVPP使原花青素物质能酚氧化酶酶底物氧化并且提取步骤除随着PVP除酚pH值重要影响素结合酚PVP pH值8.0更迅速降低[11]原花青素单独使用更质量PVPP除所化合物需要与其结合使用

p％N0瓦特/ t7r3Tris-硼酸盐：提取缓冲液含Tris-硼酸盐（pH7.5）其特征于所述硼酸根据带*氢与酚类化合物形复合物抑制酚类氧化与RNA结合种非效所提取缓冲液溶液加入Lбpez-Gбmez再其原剂Tris-硼酸浓度高（>0.2M）影响RNA收率

＃P8] 0 ^ 8 K3 a4牛血清白蛋白（BSA）（）：物质BSA原花色素产类似溶性或溶性复合物形间抗原 - 抗体相互作用降低材料RNA结合原花色素机提高产率RNA BSAPVPP合并提取液效更由于RNA酶往往含BSA要加入使用肝素抑制核糖核酸酶性 ?＃H / Y（P7 Q）J4）G * W1 G8升

5星丙酮：Schneiderbauer冻结云杉松树山毛榉等-70℃丙酮萃取植物材料与抛光效离高品质植物材料酚醛化合物丰富RNA @ + - X / V9 Z8 T8 H：B3?白c

除酚类化合物：

＆Z＃H）G0 H＆$ I1 N F L9 N李+Ca2 +沉淀RNA未氧化酚类化合物清除PVP溶性PVPP或BSA结合酚类物质直接通离离除或曼宁使用高浓度2 - 丁氧基乙醇（50％）沉淀RNA除苯酚氯仿萃取酚溶解2 - 丁氧基乙醇除含50％2 - 丁氧基乙醇缓冲液洗涤RNA沉淀认甚至酚氧化其氧化产物仍溶解高浓度2 - 丁氧基乙醇溶液除残留酚删除外没必要再使用硼氢化钠处理 C6 Y8 A1 SV：2

糖干扰及策：6 I-B3 R4?$ T＆O

糖污染提取植物RNA经遇另棘手问题植物组织往往富含糖许物理化性质RNA糖非相似难除糖RNA裹着移植性路程导致RNA产量减少RNA沉淀产糖凝胶状沉淀物例含糖类RNA沉淀溶于水或溶解粘稠溶液由于糖抑制许酶性污染糖RNA品能用于进步物研究传统通SDS-盐酸胍处理部除些糖氯仿萃取移除些糖由苯酚存高浓度Na +或K +离条件?? LiCl沉淀RNA糖部留清液即使通些步骤仍发现相数量糖RNA混合起所需要使用更效式解决污染问题植物RNA离纯化糖

7 ['X / Ed8×（沸点（| 9 C＆n与低浓度乙醇沉淀除糖糖种更提取RNA或溶液缓慢加入水乙醇至终浓度10％至30％并且使沉淀糖RNA保持溶液乙醇溶液加入通植物材料匀浆Lewinsohn RNA萃取裸植物木质茎统乙醇浆料清液加入终浓度10％情况沉淀糖Tesniere葡萄浆组织提取RNA通CsCl超离乙醇沉淀RNA溶液加入终浓度30％乙醇沉淀糖进步纯化RNA品

I5 B5米* Z9八集团M4? - N / D另用醋酸钾沉淀糖加入1/3量5 M醋酸钾（pH4.8）解决案巴赫卢勒云杉组织匀浆提取RNA沉淀糖安斯沃思鲁梅克斯植物花卉组织RNA提取加入1/5体积5 M钾乙酸乙酯（pH4.8）溶液 Hughes等棉叶花粉RNA提取添加1/3体积8.5M醋酸钾（pH值6.5）溶液匀浆除糖等杂质植物材料RNA提取物述两种组合使用种Lбpez-GбmezRNA提取芒皮匀浆液加入0.25体积水乙醇0.11倍体积5M醋酸钾溶液除糖杂质 Su等除糖藻酸盐单独使用乙醇或醋酸钾效并使用结组合

6 C9 | 5 Q1 B9 ??[5 L1 S + N缓冲液含高浓度NaCl助于除糖 Chang等提取松树核糖核酸NaCl浓度2.0M1.0M缓冲溶液氯仿萃取乙醇沉淀RNA与糖离RNA曼宁萝卜种其材料苯酚提取清液稀释Na +离浓度调节至80毫米加入0.4体积2 - 丁氧基乙醇沉淀除糖 3 B1 H＃M'{+ {0 U％UK2 @V

蛋白质杂质影响策：$ _at_ - G5 O（F1 S9 _2 V * G2 N / ^

蛋白RNA品污染重要素核糖核酸酶酚氧化酶蛋白质获完整高质量RNA必须效除蛋白杂质传统抑制冷冻条件性RNase等磨碎植物材料提取缓冲液含蛋白质变性剂苯酚胍十二烷基硫酸钠十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）使匀浆蛋白质变性聚集些蛋白酶K降解蛋白质杂质五月进步除蛋白质用苯酚氯仿萃取 T7五（F1 J9 @ + E

Wilcockson同溶解度使用高氯酸钠溶液蛋白质RNA离 70％高氯酸钠溶液于该蛋白质溶解度RNA溶解度数蛋白质沉淀随通离离清液加入两倍体积水乙醇RNA安顿并溶解70％高氯酸钠溶液残余蛋白保持清液除部蛋白质

3 QE / \ * IA＆@代谢产物影响及策:: N3）N F K＃NP F6 H0 J2 A0 {

另困难植物组织许高等植物组织尤其熟组织产些水溶性级代谢产物提取RNA质量些级代谢产物容易与RNA结合RNA提取满阻碍离物性RNA些级产品能确定具体物质没特别式解决问题贝克休斯等选择性沉淀Chirgwin氯化铯梯度离离纯化松树种熟松树针叶植物组织RNA艾弗森RNA恢复（M S5 O％FH-Q * \（`（}

难易其物材料植物组织特别高等植物细胞内外复杂性组合物使植物组织RNA提取阶段通实践发现即使同种植物同组织RNA提取同同植物材料包含某种干扰素同RNA提取能适用即使同种植物相同组织材料同基型植物RNA提取能相同于工厂或组织其相应RNA提取必须经探索实践建立＃S0＃G7 L3 S＆A

随着植物物研究领域扩我肯定说现新困难RNA提取植物材料程作其研究基础断探索经验积累科家快解决些困难并植物物发展铺平道路些特殊植物RNA提取

些特殊植物RNA提取

$ E * [U（E％H'酚植物RNA提取：JD2 V（R! B＆?

苹棉花酚植物RNA提取采用TRIZOL般没验证效所提取RNA纯度没特别高作北足够 6 J＆D2 U（\ 6 W8 _＆O4 E1 X1吨

试剂：

＃S7 S8? R＃W1 Y＃克提取缓冲区200毫升：氯化钠1.1688克100毫米Tris2.4228克10毫米（Tris-HCl4.0）EDTA5.8450克10mMSDS2.0000克1％NaOH溶液调节至8.0并设置200毫升再加200ulDEPC解冻 * J）T2 @）T4 W'F

测试步骤：

?A0 I * C（W5 S * A'W11.5毫升管冷冻液态N2吼加入0.1克品加入500UL苯酚 - 氯仿加入500UL提取缓冲液剧烈振摇1钟放置冰5钟 F3 S0 V5 @ 0 S7 I1?

24 12000rpm进离15min清液转移新试管添加氯仿异戊醇提取间）H'L7 D＃DY8 @

3取600ul异丙醇-20℃沉淀20钟

＆W：M2 R：I4 \ L＃J412000转离10min

IY \ 8 b7A5沉淀物用乙醇（70度）

K T. D1 [0 w +）_0 D5 68000RPM 5钟

AY＃}'F（`5} 6我+ NX7沉淀干燥溶解30ulDEPC水^ 0 QR +`5 J（N'['M9号

＃M / R3 O2? T6 Z $`1 M＆E ^

银杏等木本裸植物RNA提取：A I＆V H0` ?

银杏香其木本裸植物代谢物糖离纯化RNA干扰RNA提取质量产量严重影响酚含量物实验展带阻碍目前RNA提取许传统Trizol试剂盒SDS其提取银杏RNA蜀郡张等（1993）CTAB提取RNA质量较差退化非严重改善其提取步骤获更高质量银杏RNA品 / S4我* V K8 S）x

检测试剂：M（Q＃E7 N3吨`＃I M（[

11M三：12.11克?斯溶解60米L水用浓盐酸PH8 0.0体积LOO毫升菌DEPC水溶解使用

`4 C9 {）P2 \ 4 T2 M EDTA500米：18.61克?DTAH 2O80米升水搅拌至溶解用NaOH pH值调至8.0定容至100mlV＃X G4 M＃Q3 C5 P * JH4 Y

310摩尔/ LLiCL：42.4 gLiCL 100毫升水溶解即 9 I）@'\＆W + C P * G

图4所示提取缓冲液（DEPC处理）：2％CTAB（蛋白质变性剂）0.2％PVPK 30（除酚）100米摩尔Tris-HCL（pH8.0）25米M EDTA（金属螯合剂混合物）2.0M氯化钠（除糖CTAB）与：10 mL1 mol / L三PVP2克2克CTAB5ML 500毫米EDTA11.7gNaCL音量设置100毫升）O + \ 5 E XO＃A（M + P8 H * K9 N0 q

5亚精胺（提取液加少量）（RNA酶抑制剂）

＃J9 G6 O / H（U'D64％稀疏乙醇（添加）提取（除酚）'D ED（J. K $ ZO9 f

7氯仿异戊醇（24：1）（萃蛋白质））U）A +] 4 \＃Q

810 MLiCL（沉淀物RNA）

7 M +）G4 J4 m5C0f-\ 9SSTE（溶解RNA）1.0M氯化钠01m10米MTrisHCL（pH8）：氯化钠2.9克0.25毫摩尔EDTA（pH8.0）5％SDS克SDS0.5毫升1三L 500毫米100 U EDTApH值8.0定容至50 mL M5 Z + J3 X0 V＆\ 6 E7?＃R

测试准备：_5 Z9}F％Q6吨

灰浆玻璃器皿包裹铝箔烘焙温度200℃或至少2或180 * C高温烘烤4信息 X7 N3 WW2} 9 M

2塑料制品（提示管）新裹报纸121'C高压灭菌器消毒40钟或两121'C高压釜每灭菌20钟烤箱烤千

X * F +?V7} A3所溶液制备加DEPC水DEPC UJ浓度0.1％37℃培养夜1211C高压蒸汽灭菌40钟液（Tris没用DEPC所Tris DEPC-处理水溶液制备灭菌处理）

）X＆B {％E ^＆F：S0 q检验程序：Y6 U +`C * \ X2＃R

[据文献（蜀郡张1993）CTAB改进】

F ^ + E9 I＃H / Q7 M * A *] 14毫升提取物加入lOmL离离机加热管C卜650C水域 $ D + 4 W7 \ 3 J：WM

2研钵用液氮冷却研钵抗氧化剂PVP加入少量采取1克低温冰箱银杏迅速放置研钵加入液氮研磨程防止叶片熔体充研磨紧接添加预热提取缓冲液并混合与手功能 C4我+ L / Z * C5?）V

365℃1钟冷却至室温水

（N2 _at_）U：S{9 ME8 F4通添加量（4毫升）氯仿：异戊X17（2 = L：1）混合10,000 rpm40C10钟

（H6 P O1 Y8 P＃5星仔细清液加入等体积（4毫升）仿：异戊醇（24：1）并混合10,000 rpm40C离10钟{＃K / Z5? ：X：V1 x

6取清液加入1/4体积IOMLiCL混合4℃沉淀夜10000RPM离20钟

7×P4 O6 Z1 D [8} 7干燥溶解沉淀500U?SSTE 1.5M号离管放炮等体积氯仿：异戊醇混合1万转40C离10钟

H2 b7C1e* [6 R4c8离拉伸清液加两倍体积水乙醇-70℃沉淀至少30钟或20℃沉淀物2 W * C'Y1 P-T5 K表）^`

912000rpm进40C离20钟用70％乙醇洗涤两干燥沉淀 1×S * X0 VY6 F /升

1040 U LDEPC处理水溶解沉淀物RNA品 8 F2 C-S4 R3 O9 R4 T E＆{

11除电泳紫外检测RNA-70℃冰箱备用

Q0 O7 V.] 9 x{1我：__

U * X1 M5 G9（W％U改进克拉普提取：

1 R）R＃S3? Q1诉W测试试剂：

C7 Z1 ^）J5 A＆F＆W（K D1RNA提取掖：母液：4mol异硫氰酸胍20毫摩尔EDTA 20毫摩尔MES pH值7.0工作液：取400毫升母液加入1.7毫升2-ME贮存4 ℃储备/ I $ E. RS％Z

2RNA重新悬浮液：氯化锂10毫摩尔乙酸钠2mol调整终体积250mlpH5.2灭菌存储4℃条件使用 2 U J1 S9 V8 ?

测试步骤：

）O / O型L＃q构-D8 V）U1取新鲜植物材料0.5?1g冻干必要添加至0.2g砂磨起拌匀加入10ml RNA提取掖 7 N Q：BS N9 BJ $ü

24℃8000RPM离10min条件层水相转移干净离管并加入等体积苯酚/氯仿萃取除皱离10钟4℃条件8000RPM

1N：K +] 3 R A7`3清液转移干净离管清液1（添加调匀10毫升氯仿洗涤10ml氯仿4℃条件8000RPM离10min ）

$ P + YP / ^ - W / EGK0 Y：[4清液转移另干净试管加入1/10体积3摩尔乙酸钠2倍体积冷乙醇-80℃降水两条件：T＆M8 C-W5O1 O

54℃8500rpm离30钟条件弃清液沉淀再悬浮RNA再悬浮并4℃放置1条件 9 B7 Z＃K4 V（同期L8 Q0 A8?）I％|

64℃条件8500rpm离10min丢弃清液DEOC沉淀物溶解适体积处理水测试包装保存-70℃条件

不要多想这样的提问没有意义

很多烦恼都是我们自己找的

巯基乙酸钙

开放分类：化学

巯基乙酸钙

简介：

别名：硫代乙醇酸钙

分子式：–SCH2COOCa+ ·3H2O

分子量：184.23

性能：

类白色结晶性粉末，溶于水，微溶于醇，有巯基化合物的特殊气味，遇铁、铜等金属离子显红色。密闭，避光保存。

用途：

○ 制药、日用品类重要原料。

○ 毛发脱除药剂。

○ 化学分析上可用做金属离子监测试剂。

粘贴一部分英文版的MSDS 有关毒害部分和防护部分内容：

Main hazards: Harmful if swallowed. Irritating to respiratory system. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitisation by skin contact.

Other hazards: May corrode metals

Skin contact: There may be irritation and redness at the site of contact. May give delayed skin sensitisation May be absorbed through skin.

Eye contact: There may be irritation and redness. The eyes may water profusely.

Ingestion: There may be soreness and redness of the mouth and throat. Nausea and stomach pain may occur. There may be vomiting.

Inhalation: There may be irritation of the throat with a feeling of tightness in the chest. Exposure may cause coughing or wheezing.

俺给大致翻译下吧：

主要危害:吞入危害；对呼吸系统有刺激；对眼睛会有严重损伤；可有皮肤敏感。

其它危害：

腐蚀金属；

皮肤接触：

接触部位痒且会引起红肿；可通过皮肤吸收，可导致皮肤麻木。

眼接触：

引起痒和红，流泪；

消化：口腔和咽喉不适和红肿，会引起恶心和肚子疼，或有呕吐。

洗入危害：

喉咙发痒，胸闷，会引发咳嗽或气喘。

以上摘自百度贴吧，脱毛膏等多添加此成分，所以慎用。。

通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。0T3z(F&_,D6c%^"h6YA6_RNA提取的一般步骤-O:Y+x$p#s8U4M9S所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。(O(g^+K)f+i&]%P实验步骤：*l&d6s5e(q1F(g2|j,^0s破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。6D8}.QY,g*X1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。"s%f,`0[1d*m!]0e2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。&X.P)i)YL#u/[3、沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇。2@0d&z7?+i,g1@4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。3@%V"o9v+I1J2o9k"z5、融解RNA一般使用TE。L5f.n6}(S1t%Z&J6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。&P3[7m*^$U$_"?:F"xu*N(?(I氯化锂法提取总RNA："u}'I!r'^'^&l本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。#~*S:}9`*r4Z3P试验试剂："d$r6Q+_.I8Q1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L，过滤灭菌】7_8w1t"o9a'q!i4Z2、悬浮液【10mM?Tris-HCL(pH7.6),1mM?EDTA(pH8,0),0.5%SDS】!m8Q4R,]&y:b#`7d试验步骤：7[6?$`*}o7_Z'{1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。&Y)b:E,Q"l/^Q:\$s2、匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。x-C6D-N/N0K!t2a3、取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。)y-x)S0K9y6j,e4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。3d2v'i1~(~*D5、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。L4a'Q4u"l:a*K%Z$?(e6、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。3}r0[/Q'G9q7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。0f.X%R(H%B7g!y7j5u$C'|)[%~!J3D:Q蛋白酶－热酚法6|"^0b*[)P3S*c4b4H4l本方法适合于病毒RNA的提取*I(i+b#r!K试验试剂：$?4[7H9`)J1、蛋白酶K（终浓度50ug/ml）,J5pl6V/t7[/I2、2×缓冲液：1%SDS?20mMTris-HCL(pH7.6)?0.2MnaCL9h,p]y+\$Z)O试验步骤：#W3v8G1[$]5y1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。-K0p/E'G0M#Q-z7n,{#d2、加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。w!`W(~,E:i3^3、离心，取上清，氯仿抽提一次。,|(Z0dj2@7m+d2Q&xH4、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。7[/w,h2d6U$k5、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。%A5Y{(w%]3a*y,Oe)P6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。植物RNA提取过程中难点的相应对策植物RNA提取过程中难点的相应对策)o5B7d/Q3_酚类化合物的干扰及对策：a9D*Z3K?7W许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browningeffect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。9b0S!}0U6|9k/l!v"vg1~/@防止酚类化合物被氧化的方法："vy,a4k7n/Z1、还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。&H.z.p+~&t%t5G&G1M-P/q!u2、螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低〔11〕。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。p%N0w/t7r3、Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率。#p8]0^8K3a4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。)~#H/y(P7Q)j4G*w1G8l5、丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。@+?-X/V9z8T8H:B3C!W'C酚类化合物的去除：&z#h)G0H&]$I1N"f.l9N通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。5C6Y8a1SV:`2~多糖的干扰及对策：6I-b3R4~$T&O多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。7['X/e,d8x(B-p(|9C&n用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品。!i5b5m*z9G8M4~-N/D另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳。6c9|5q1b9[5l1s+nFang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。3B1h#M'{+{0U%U,K2@,v蛋白杂质的影响及对策：$@-G5o(f1s9_2V*G2n/^蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。'T7v(F1J9@+EWilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。3qe/\*I"A&@次级代谢产物的影响及对策：:N3|)NfK#np'f6h0J2A0{从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。(Ms5O%f!H-Q*\(m"`(}由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。#S0a#G7L3S&A随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法植物RNA提取中的一些特殊方法$e*[2U(E%h'[多酚类植物的RNA提取：!j!d,]2V(R!B&o苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。这个方法是验证过有效的,提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern足够。6j&d2u(\6W8_&o4E1X1t实验试剂：#s7s8H!R#W1y#g提取buffer200ml：NaCl1.1688g100mMTris2.4228g10mM(tris-HCl8.0)EDTA5.8450g10mMSDS2.0000g1%NaOH调至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.*j)st2@)t4W'F试验步骤：!Ta0I*C(w5S"E*A'W1、1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min。"F3S0V5@0s7i1T2、4度12000rpm离心15min,上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次。)H'L7d#d"y8@3、取600ul异丙醇,-20度沉淀20min.&w:m2r:I4\4l#J4、12000rpm离心10min。!I.Y.\8b7A5、沉淀用70度乙醇洗。k!T.D1[0w+?)_0D5?6、8000rpm5min。"Ay#}'F(`5}6I+N!x7、沉淀晾干,溶于30ulDEPC水。^0Q-R+`5j(n'['m9M#m/r3o2O!T6z$`1m&e.^银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：&Ai&V!H0`?6R银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏RNA，而ShujunChang等(1993)的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤进行改进，得到质量较高的银杏RNA样品。/s4i*Vk8S)x试验试剂：!]!M(q#E7N3t`#i.m([1、1Mtris:12.11gTris，溶于60mL水中，用浓盐酸调至Ph8.0，定容至lOOmL.用灭菌的DEPC水溶解。`4c9{)p2\4t2、500mMEDTA:18.61gEDTA"H2O加入80mL水中，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至100mL。V#x*j!H4y!G4M#q3c5P3、10mol/LLiCL:42.4gLiCL,100mL水溶解即可。9i)@a'\&w+cp*g4、提取缓冲液(DEPC水处理):2%CTAB（蛋白质变性剂）.2%PVPK30（去除多酚类物质）100mMTris-HCL(Ph8.0)25mMEDTA（金属鳌合剂）2.0MNaCL（去除多糖和CTAB）配法:2gCTAB,2gPVP,10mL1mol/Ltris,5mL500mMEDTA,11.7gNaCL,定容到100mL。)o+\5E!XO#A(M+P8H*K9n0q5、亚精胺(提取时加少量)（RNA酶抑制剂）#J9g6O/h(u'd6、4%0一疏基乙醇(提取时加)（去除多酚类物质）'De,d(J.K$z!O9f7、氯仿异戊醇(24:1)（抽提蛋白质）)U)A+]4\#Q8、10MLiCL（沉淀大分子RNA）7M+b)g4J4m5C0f-\9、SSTE（溶解RNA）1.0MNaCL0.5%SDS1mMEDTA(PH8.0)10mMTrisHCL(pH8）配法:2.9gNaCL,0.25gSDS,0.5mL1Mtris,100uL500mMEDTA,pH8.0,定容至50mL。.m5z+J3X0V&\6e7Y#R试验准备：_5z9}"f%q6t1、研钵和玻璃器皿用锡纸包好，200℃以上向温烘烤2小时以上，或180*C高温烘烤4小时。X7n3w,W2}9M2、塑料制品(枪头和离心管)最好用新的，并且用报纸包好，121'C高压灭菌，灭菌40min，或连续两次121'C高压灭菌，每次灭菌20min，然后用烘箱烘千。X*f+~,v7}.a3、所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPCuJ浓度为0.1%,37℃过夜，1211C高压灭菌40min.(其中Tris因为不能用DEPC处理，所以Tris用DEPC处理的水溶液灭菌后配制。))x&B,{%e"^&F:s0q试验步骤："Y6U+`2C*\4X2a#r【根据文献(ShujunChang,1993)CTAB法，稍作改进。】F^+e9I#h/Q7m*A*]1、将4mL提取液加入到lOmL离心管c卜650C水域加热。$D+?4w7\3J:w,M2、用液氮冷却研钵，在研钵中加入少量的抗氧化剂PVP，取1g低温冷冻的银杏叶片，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，用手摇功混匀。6C4i+L/Z*C5G)v3、65℃，水域1min后冷却至室温。(N2@)U:S,{9M"e8f4、加入等体积(4mL)的氯仿:异戊X17(2=L:1)，混匀，10000rpm,40C，离心10min。(H6Po1y8p#?5、小心吸取上清液，加入等体积(4mL)的仿:异戊醇(24:1),混匀，10000rpm,40C,离心10min。.{#k/z5r:x:v1x6、吸取上清液，加1/4体积的IOMLiCL,混合，4℃沉淀过夜，然后10000rpm离心20min。7xP4o6z1D![8}7、用枪吸干，用500uLSSTE溶解沉淀，转到1.5mL离心管.加等体积氯仿:异戊醇混匀，10000rpm,40C，离心10min。,H2b7C1d*[6r4c8、离心吸取取上清液，加两倍体积的无水乙醉，-70℃沉淀至少30min，或一200C下沉淀2h。"W*c'Y1P-t5K)^,`9、12000rpm,40C,离心20min，去上请用70%的乙醇洗两次，吹干沉淀。1x,S*X0V"y6F/l10、用40uLDEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。8f2C-S4R3O9R4Te&{11、除用于电泳和紫外检测外，其余RNA-70℃冰箱保存备用。Q0o7V.]9x,{1i:__!U*X1m5G9A(W%U改良Krapp提取法：1r)r#s3~|.q1v.w试验试剂：'C7Z1^)J5A&f&W(Kd1、RNA抽提掖：母液：4mol异硫氰酸胍20mmolEDTA20mmolMESpH7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml2-ME贮存在4℃条件下备用。/a.I$E.RS%z2、RNA重悬液：2molLiCl10mmolNaAc调整终体积为250ml，pH5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。2uJ1S9V8a.j试验步骤：)O/o,L#q-D8v)U1、取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入10mlRNA抽提掖充分混匀。7nQ:B"SN9B!J$u2、4℃条件下8000rpm离心10min，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min。1N:K+]3R"a7`3、上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。$p+y,P/^-w/E'g"k0y:[4、小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10vol3molNaAc和2vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。:t&M8O1O!C-w5a5、在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。9b7Z#K4v(y%l8Q0a8N)I%|6、4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。