巯基乙醇为什么会变黄变质

外观：无色透明液体。

香气：具有少许硫醇气味。

熔点(℃)： -100

沸点(℃)： 157~158

相对密度(水=1)： 1.1143

相对蒸气密度(空气=1)： 2.69

饱和蒸气压(kPa)： 0.133(20 °C)

闪点(°C)： 73

pKa：Value: 9.64±0.10 (25 °C)

溶解性：易溶于水，乙醇和乙醚等有机溶剂，与苯可以任意比例混溶。

水中溶解度：1 mg/mL 敏感性：对空气敏感，易吸潮 用途用于合成树脂及用作杀霉菌剂、杀虫剂、增塑剂、水溶性还原剂等。 聚合级高纯巯基乙醇可用作氯乙烯、丙烯腈等的调取剂，以及聚合催化剂、聚合物交联剂、固化剂。该品得到美国食品药物管理局的批准，可用作丙烯腈、苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯三元树脂制食品包装用吹塑容器时的添加剂。 生物学应用2-巯基乙醇可以打开蛋白质中存在的二硫键：cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH → 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OH

二硫键被打开后可以使蛋白质的四级或三级结构被破坏。[2]由于2-巯基乙醇能够打开蛋白质的结构，它常常被用于蛋白质分析。而2-巯基乙醇也常常被用于保护蛋白质中自由的半胱氨酸巯基之间不会错误形成二硫键。

作为还原剂，2-巯基乙醇常常可以与二硫苏糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）互换使用。

2-巯基乙醇是少数几种被发现可以延长小鼠寿命的化合物。[3]在微克量级水平上，2-巯基乙醇被观察到对实验鼠的生命具有多种可能的正面效应。 制备早期采用氯乙醇与硫氢化钠反应制得。环氧乙烷与硫化氢按摩尔比1：3.5配合，以强碱性阴离子交换树脂为催化剂，在42℃左右反应。所得粗品含量约52%，还含少量硫二甘醇（沸点282℃），较易分离获得2-巯基乙醇。2-巯基乙醇可以通过环氧乙烷和硫化氢反应来生成。 危害毒性分级：高毒

急性毒性：口服-大鼠 LD50: 244 毫克/公斤；口服-小鼠 LD50: 190 毫克/公斤

刺激：皮肤-兔子，10毫克/24小时，重度；眼睛-兔子，2毫克，重度

健康危害： 吸入 、摄入或经皮肤吸收后会中毒。中毒表现有紫绀、呕吐、震颤、头痛、惊厥、昏迷，甚至死亡。对眼、皮肤有强烈刺激性。可引起角膜混浊。

环境危害： 对环境有危害，对水体可造成污染。

燃爆危险： 本品可燃，有毒。

危险特性： 遇高热、明火或与氧化剂接触, 有引起燃烧的危险。受高热分解放出有毒的气体。 操作处置与储存安全操作的注意事项：避免接触皮肤和眼睛。 避免吸入蒸气或雾滴。切勿靠近火源。严禁烟火。采取措施防止静电积聚。

安全储存条件： 使容器保持密闭，储存在阴凉、干燥通风处。打开了的容器必须仔细重新封口并保持竖放位置以防止泄漏。建议贮存温度 2- 8 oC。 其他2-巯基乙醇可以与醛或酮反应，生成相应的氧硫杂环化合物，这使得2-巯基乙醇可以作为羰基的保护基。

DTT和2-ME（2-mercaptoethanol的简称，下同）都属于巯基试剂。

也就是说DTT和2-ME的作用是一样的：可以防止蛋白质或酶等分子中的巯基氧化成二硫键，维持体系的还原性环境。

β-巯基乙醇和DTT都是还原剂，防止蛋白质被氧化，β-巯基乙醇常用浓度为5-20MMOL/L，DTT为0.5-1MMOL/L。因为β-巯基乙醇加入缓冲液后24小时易被氧化，其后加速蛋白质的失活，而DTT氧化后形成稳定的分子内二硫健，并不危及蛋白的巯基，所以在蛋白制备中常用β-巯基乙醇，而长期储存用DTT。还有其上提到的试剂浓度均指终浓度。

至于使用浓度，DTT和2-ME的工作浓度一般为1-5mM，如果2-ME的浓度是1mM，由于DTT的氧化能力强于2-ME，DTT的浓度用0.5-1mM就可以了。

过硫酸钾溶液保质期： 一周。抗坏血酸溶液保质期： 两周。

因为过硫酸钾具有强氧化性，不稳定，易分解，放出氧变为焦硫酸钾。100℃时完全分解。其溶液长期贮存浓度会改变，要保证分析的准确度，所以要一周一配。

抗坏血酸，由于有很强的还原性，在空气中就能被空气中的氧气逐渐氧化。最好是新配制溶液，长期存放难免会被氧化变质。不能长期存放，要现配现用。

扩展资料：

过硫酸钾、抗坏血酸的相关要求规定：

1、过硫酸钾用作乙酸乙烯酯、丙烯酸酯类、丙烯腈、苯乙烯、氯乙烯等单体乳液聚合的引发剂（使用温度60～85℃），以及合成树脂聚合促进剂；用作油井压裂液的破胶剂。在合成树脂、合成橡胶工业中作为乳液聚合的引发剂，用于丁二烯苯乙烯橡胶的合成。

2、过硫酸钾操作注意事项：密闭操作，加强通风。操作人员必须经过专门培训，严格遵守操作规程。建议操作人员佩戴头罩型电动送风过滤式防尘呼吸器，穿聚乙烯防毒服，戴橡胶手套。

3、抗坏血酸即为维生素C。维生素C为抗体及胶原形成，组织修补，苯丙氨酸、酪氨酸、叶酸的代谢，铁、碳水化合物的利用，脂肪、蛋白质的合成，维持免疫功能，羟化5-羟色胺，保持血管的完整，促进非血红素铁吸收等所必需。

参考资料来源：百度百科-过硫酸钾

参考资料来源：百度百科-抗坏血酸

1、通过颜色、浑浊度判断抗坏血酸溶液是否变质，变质后该溶液颜色发黑、有悬浮固体出现。

2、检测该溶液的pH值，若超出一定范围，可判断已变质。

3、维生素C（抗坏血酸）测定—氧化还原滴定法，测定其中抗坏血酸的含量，原理如下：

应用范围该方法采用滴定法测定维生素C的含量，该方法适用于维生素C。

方法原理供试品加新沸过的冷水与稀醋酸使溶解，加淀粉指示液，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色并在30秒内不褪，读出碘滴定液使用量，计算维生素C的含量。

二、由于抗坏血酸溶液易被氧化，通常加抗氧化剂如PVP,巯基乙醇等能维持稳定；

抗坏血酸溶液喜酸怕碱，高温和强光下会被氧化，所以尽量低温使用不透光的瓶子保存；

通常冷藏避光条件下，存放时间不宜超过半年。

在细胞的研究和利用过程中，最主要的是要为细胞提供最适的生长条件，保持细胞培养开始时的群体状态。这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规，而且细胞培养，试剂昂贵，费时、费力，不是随随便便就可以进行的。

细胞只有在最适生长条件下，才会保持正常的核型及功能。如果培养条件上打折扣，就意味着会出现带有染色体重排或突变变异株细胞。某些营养成分或生长因子用量不足或细胞高密度培养时间过长，都不是最适生长条件。

二、平衡盐溶液

平衡盐溶液具有维持渗透压、调节酸碱平衡的作用，同时可以供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。最常用于洗涤组织或细胞、配制培养用液的基础溶液是Hanks 溶液和磷酸缓冲盐溶液（简称PBS) 。

三、血清

血清中含有丰富的营养成分，包括多种生长因子及许多未知成分。动物细胞的生长都依赖血清。血清的种类很多，包括胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等。

选择一批最适于细胞的血清是很重要的，而且如有可能的话，应要求购买来源公司保留足量，以供应实验使用。这样可避免反复试用以选择最适血清所产生的费用。血清的质量可以通过检测细胞的克隆形成率来衡量。取对数生长期的细胞彻底消化后，以低密度（直径6mm 的平皿中加入约103个细胞）接种5~6 个平皿， 其中一个平皿中加入含30％血清的培养液，以测定高浓度血清的细胞毒作用。7~ 10d 后，出现肉眼可见的克隆时，倒掉培养液， 2％亚甲蓝染色2~5min,观察克隆形态、计算克隆形成率。克隆形成率一般为5%~ 10%。

四、抗生素

一般细胞培养时，抗生素不是必需添加成分。但一些特殊情况下培养液内需加入适量的抗生素，如怀疑有污染、原代培养时、新手操作不够熟练。常用的抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素。青霉素常用剂量为100U/ml ,链霉素常用剂量为100μg/ml。常配制成100 倍或200 倍， 分装为小包装， 于－20℃条件下保存。一次用一个小包装， 避免反复冻融 。

五、特殊的添加因子

特殊的添加因子可以使细胞培养的条件得到优化。原代培养细胞接种密度需适当提高，应尽可能用营养丰富的培养液，如使用胎牛血清。这些都属于一般优化条件。细胞培养条件优化的原则是：根据细胞类型， 模拟体内环境， 添加不同的细胞生长因子及有利于细胞生存、增殖的添加剂。表1 是常用的细胞培养添加成分。

表 1 常用的细胞培养添加成分

一种细胞生长因子常常是多种细胞的丝裂原，如碱性FGF, 不仅是成纤维细胞的丝裂原，还是内皮细胞、角质细胞、黑素瘤细胞的丝裂原。EGF 可促进上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞及平滑肌细胞等多种细胞的增殖。

培养干细胞时，常添加白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF ) ，又称分化抑制因子( DIA )， 是一种分泌型多肽，可抑制小鼠干细胞的自然分化。一般，可用纯化的LIF 直接加到培养液中，或使用用LIF表达载体转染过的饲养层细胞。正常的STO 细胞也可分泌。STO 细胞还分泌其他一些促干细胞生长的因子。目前，多数实验室仍使用饲养层细胞。重组的LIF 来源方便，与STO 细胞一起使用时，常用浓度为1000U/ml 。与小鼠胚胎成纤维细胞一起使用时，常用浓度为500U/ml 。

体外培养正常细胞需要使用不同生长因子的选择性组合。通常在已有的经典培养液配方基础上，添加不同因子而成。现在已有多种特定细胞培养液，且有商品供应，如血管内皮细胞培养液、神经干细胞培养液、骨髓干细胞培养液、间充质干细胞培养液、小鼠心肌细胞培养液(Claycomo Medium) 等。

六、消化液

细胞生长至一定密度时，需进行传代。消化液可使细胞脱离生长表面，离散成单个细胞。常用的消化液是0.25%、0.125％的胰蛋白酶和0.02％的二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 溶液，以无钙镁的PBS 或Hanks溶液配制。它们可单独使用，也可按一定比例混合后使用。大部分细胞的消化可使用终浓度为0.05%胰蛋白／0.02%EDTA混合液。有些上皮细胞贴壁力强，需较高浓度的胰蛋白酶(0.25%）或延长消化时间，甚至需要37°C温育。如果温育较长时间（超过20min)细胞仍不能脱壁，则应采取分步消化的措施，即将已脱壁细胞移出至离心管，加完全培养液中和胰蛋白酶的作用，对未脱壁的细胞再添加新胰蛋白酶再次消化。

七、细胞培养用的其他液体

细胞培养时，还会用到其他一些液体，如谷氨酰胺、HEPES 、丙酮酸钠、各种细胞生长因子、各种组织或细胞条件培养液，以及调整pH 使用的5.6%NaHCO3等。

谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，会导致细胞因生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故要适时添加。可配制200倍液体－20℃ 冰箱中保存，在使用前加入培养液内，终浓度为2mmoVL 。

HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH 7.2~7.4 范围内具有较好的缓冲能力，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠( 0.34g/L)共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。安全浓度范围10~25mmol/L。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。一些生长缓慢的细胞加入，可明显改善细胞状态。通常配制200倍液，-20℃ 冰箱保存，在使用前加入培养液内终浓度为1mmol/L。

另外， 2－巯基乙醇(2-Mercaptoethanol, 2-Me) 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清， 有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA) 对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术。也开始用于一些难以培养的细胞。常用终浓度为5×10-5mol/L。常配制成0.1mol/L 的储存液，用时每升培养液加0.5ml 。

一、植物组织蛋白质提取方法(summer)

1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。

3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清夜，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml

1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml

2、甘油(Glycerol)75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

二、

植物组织蛋白质提取方法 (summer)

三氯醋酸—丙酮沉淀法

1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1 小时)，然后真空

干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小

时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

药品：

提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮

裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M 的

DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

三、

组织：肠黏膜 (newinbio)

目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达

应用TRIPURE 提取蛋白质步骤：

含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

倒转混匀，置室温10min

离心：12000 g，10min，4度，弃上清

加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE 用量)

振荡，置室温20min

离心： 7500g，5 min，4 度，弃上清

重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次

沉淀中加入100％乙醇 2ml

充分振荡混匀，置室温20 min

离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

1％SDS溶解沉淀

离心：10000g，10min，4度

取上清-20 度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)

存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测

浓度，含量才1mg/ml左右。

解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。

四、

lysis solution:(yog)

Protein extraction buffer (Camiolo buffer):

100 ml= (0.075M Potassium Acetate) 0.736g

(0.3M) NaCl 1.753g

(0.1M) L-arginine basic salt 1.742g

(0.01M) EDTA-HCl 0.292g

(0.25%) Triton X-100 250. ul

up to 100 ml with dH20. pH 7.4. Then 0.2 um filter.

1. Freeze tissue in liquid nitrogen.

2. Rinse in PBS then mince.

3. Add 1 ml Camiolo extraction buffer per 100 mg of tissue.

4. Homogenize for 1 minute at 4\\'C.

5. Spin at 3,000. rpm/15 minutes/4\\'C.

6. Remove supernatant and save in another tube.

7. If necessary, dialize the supernatant against PBS with

50mM/L Tris-HCl pH 7.4.

五、

植物材料：水稻苗，叶鞘，根(ynibcas)

1、200 毫克样品置于冰上磨碎

2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min 取上清

3、重复离心5min

lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

六、

蛋白质样品制备(sigma)

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等(1986)的方法进行。

100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三

氯乙酸(丙酮配制，含10mM 即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min离心15

min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1 小时，同上离心弃上清，

(有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，

2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅

动几次，28度 (温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点

越好！上清即可上样电泳。或者-70 度保存

七、

植物根中蛋白质的抽取(phenol)

(1) sample, 液氮研磨

(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube

(3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul

(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite

(5) 取上层液，蛋白质就在里面

八、

SDS extraction followed by acetone precipitation – simple extraction protocol that does not require phenol.

Recommended start protocol for whole tissue extractions.(hgp)

1. Grind 1 g of fresh tissue to a powder with liquid nitrogen in a mortar and pestle.

2. Add 5 mL of extraction media (0.175 M Tris-HCl, pH 8.8, 5% SDS, 15% glycerol, 0.3 M DTT) directly to

mortar and continue grinding for an additional 30 sec.

3. Filter homogenate through two layers of miracloth into a 50 mL Falcon tube at room temperature.

4. Immediately add 4 volumes of ice cold 100% acetone to filtered homogenate, mix by vortexing and place at -20

C for at least one hour to precipitate proteins.

5. Centrifuge at 5000 g for 15 min to collect precipitated protein, decant supernatant.

6. Gently blot residual acetone from container with Kimwipe and then wash pellet in 15-20 mL of cold 80%

acetone. Be sure to thoroughly break-up pellet by pipetting, vortexing or sonication.

7. Repeat steps 5 and 6.

8. Collect final protein precipitate by centrifugation at 5000 g for 15 min and dry pellet by inverting on Kimwipe

for 15 min at 37 C.

9. Resuspend final pellet in 0.5-1 mL of IEF extraction solution (8 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 2% Triton

X-100, 50 mM DTT, 0.2% pH 3-10 ampholytes) by pipetting and vortexing at 25-30 C. Incubate sample for 1 h at

room temperature with agitation. Do not heat sample under any circumstances as this will lead to carbamylation of

proteins.

10. Centrifuge for 10 min at 12000 g and use supernatant to rehydrate IPG strips.

11. If protein quantitation is necessary, precipitate protein sample with TCA or acetone prior to performing

Bradford or Lowry assay as detergents and reducing agents interfere with these assays.

Phenol extraction followed by methanolic ammonium acetate precipitation – an effective protocol for sample

preparation from protein-poor, recalcitrant tissues such as plants (see Hurkman and Tanaka, 1986, Plant

Physiology 81:802-80

九、

材料：细菌蛋白(puc18)

用甲醇提取的，冻干后用缓冲液溶解的。样品缓冲液是一般的。其中含又2%的SDS，20mmol 的2-巯基乙

醇。

十、

线粒体蛋白的提取 (bioon)

Isolation for Mitochondria

Modification by Bioon

Materials and reagents:

homogenizing buffer:

100 mM mannitol

10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)

5 mM MgCl2

关 于 蛋 白 质

1 mM EGTA

1 mM DTT

leupeptin (0.1 ug/ml)

0.1M Na2CO3

Methods:

- 10*6 Cells were washed with ice-cold PBS and lysed by homogenizing in 1 ml buffer (ice-cold) containing 100

mM mannitol, 10 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, leupeptin (0.1 ug/ml)

- Subjected to Polytron homogenization for three-four bursts of 3-10 s each at a setting of 6.5.

- Intact cells and nuclei were separated by centrifugation at 120 g for 5 min at 4℃

- Supernatants were centrifuged at 10,000 g for 10 min to collect the heavy (mitochondrial) membrane pellet.

- Cytoplasmic fractions were obtained by centrifuging supernatants at 100,000 g for 30 min.

- Resuspended pellet to 0.25mg/ml in fresh preparation of 0.1M Na2CO3 (pH 11.5)

- Incubated on ice for 30 min.

- Ultracentrifugation at 100000g for 1h at 4℃ to precipitate the mitochondria membrane protein. And the

supernatants are mitochondrial matrix. 0.5mg of proteins in mitochondria can get 100ug of proteins (the

alkali-resistant fractions)

Ref.: PNAS, 2002，99：12825–12830

本方法只适用于提大鼠细胞线粒体蛋白，而不适用于线粒体功能检测

在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。

一、标本的采集种类和要求

1、推荐采集的呼吸道标本种类

疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）

2、拭子的选择

标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）

3、临床标本储存要求

保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。

4、标本的分装处理

标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。

5、标本的运输

疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。

二、核酸检测

基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。

1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：

4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。

2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：

目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。

三、病毒分离鉴定

可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。

四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全

（一）实验室级别及个人防护

1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。

2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。

（二）健康监测

1、所有人员均应自测发热及其他症状。

2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。

3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。

五、附表和附件

附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单

附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单

附件3： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（中文）

附件4： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（英文）

附件5： RT-PCR方法检测甲型流感病毒

附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法

附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法

附表1

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡。

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

采集人员： 采集单位（盖章）：

附表2

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量*

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。

填表人员： 送样时间： 单位（盖章）：

附件3

real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程

中文翻译版（请同时参考英文原版）

请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。

美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)

本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。

一、概 述

（一）前提

本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。

（二）实验原理

实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan&reg探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。

（三）使用条件

一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。

（四）生物安全要求

样本处理应在相应的生物安全实验室完成。

（五）样本要求

1、呼吸道样本

支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。

2、排除标准

1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本

2）以上未列的其它不当样本

（六）核酸提取

RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp&reg病毒RNA提取试剂盒，RNeasy&reg小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。

（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。

二、实验材料

（一）试剂

1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；

2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；

3、正反向引物 (40μM)；

4、双重标记探针(10μM)；

5、阳性对照。

（二）供给

1、实验室标记笔；

2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；

3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；

4、0.2ml PCR 反应管盘；

5、光学反应盖板；

6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；

7、一次性无粉手套。

（三）仪器设备

1. 微量离心机；

2. 漩涡振荡器；

3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。

三、操作程序

（一）准备工作

1. 避免样品污染

由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：

1）实验准备与核酸提取使用独立区域；

2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；

3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；

4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；

5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。

2、仪器准备

工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzap”或者“RNase AWAY&reg”来减小核酸交叉污染的风险。

3、试剂准备

注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。

1）引物和探针

（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；

（2）涡旋振荡引物和探针；

（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。

2）Real time RT-PCR的试剂

（1）将Master Mix和酶置于冰架上；

（2）融化2×的Reaction Mix；

（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；

（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。

4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测

1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。

2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。

3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。

5、建立反应

反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。

1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；

2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

3）Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：

* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。

5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；

6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；

7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：

实验建立举例：

实验样本举例：

注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。

8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。

9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。

10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。

11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；

12）将提取的核酸样本置于冰架上；

13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操作。

14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；

15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；

16）对剩下的样本，重复步骤13-15；

17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。

18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。

19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。

6、RT-PCR扩增条件

反应体系为25ul，反应条件如下：

注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。

* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

7、解释说明/检验

1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。

2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：

（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；

（2）没有足够的人类细胞以备检测；

（3）方法建立和实施不当；

（4）试剂和仪器原因。

3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：

（1）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。

（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。

（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。

（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。

（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。

8、限制规定

1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。

2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。

3）如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来重复试验。

9、备注

引物和探针参见英文版P7。

附件4

real-time RT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感操作规程

（英文版）

附件5

基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

一、目的

对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。

二、引物 NIC引物 引物名称 碱基组成 目的片段大小 备注 FluA FluA-M-F30 TTCTAACCGAGGTCGAAACG 235bp 甲型流感病毒M基因通用检测引物 FluA-M-R264 ACAAAGCGTCTACGCTGCAG H1HA H1 F1147 AAGAGCACACATAATGCCAT 527bp H1N1亚型检测通用引物 H1 R1673 CCATTRGARCACATCCAG HuH1HA H1HA F768 ACTACTGGACTCTGCTGGAAC 327bp 人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物 H1HA R1094 CAATGAAACCGGCAATGGCTCC SWH1HA-1 SW-H1 F786 AATAACATTAGAAGCAACTGG 153bp 此次甲型H1N1亚型流感病毒引物 SW-H1 R920 AGGCTGGTGTTTATRGCACC RnaseP RnaseP F AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 约80bp 与real-time PCR中RnaseP引物一致 RnaseP R GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 三、材料及仪器

1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）

2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）

3、70%乙醇

4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）

5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）

6、检测引物

7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C

8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C

9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头

10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器

11、可调转速14K离心机：

12、旋涡混合器：

13、生物安全柜：二级生物安全柜

14、PCR仪：

15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685

16、核酸染料：

17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718．电泳槽、电泳仪

四、实验步骤

（一）RNA提取

1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。

2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。

3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。

4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。

5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。

6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。

7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。

8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。

9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。

10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。

注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。

（二）反应体系配制

1、实验设计：

检测标本RNA

质控参数：

阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）

阳性对照：已知病毒RNA

2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）

1）按下表加入试剂：

PCR反应体系 组 分 体 积（μL） RNase Free Water

5×RT-PCR Buffer 11.9×n

5×n 10mM dNTP Mixture 1×n Enzyme Mix 1×n RNase Inhibitor 0.1×n 上游引物 0.5×n 下游引物 0.5×n Total 20×n 对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。

3）加RNA模板（在核酸提取区）

将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。

3、RT-PCR反应

将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR

扩增，反应程序如下： 温度 (C) 时间 循环数 60℃ 1min 1 42℃ 10min 50℃ 30min 95℃ 15min 94℃ 30s 35 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 7min 1 4℃ 保存 4、RT-PCR产物检测

1）2.0%琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。

2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。

3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。

4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。

5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。

5、结果判断

在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下： PCR引物 待检样品1 待检样品2 待检样品3 待检样品4 待检样品5 待检样品6 FluA _ + + + + +/- H1HA _ _ + + + +/- HuH1HA _ _ + _ _ +/- SWH1HA-1 _ _ _ + _ +/- RnaseP + + + + + _ 结果判断 非甲型流感病毒 甲型流感病毒

非H1N1亚型 人季节性H1N1亚型流感病毒 猪H1N1亚型流感病毒

送国家流感中心复核 送国家流感中心检测 标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题

乙脑于1935年在日本发现，故又称为日本乙型脑炎。在我国1940年从脑炎死亡病人的脑组织中分离出乙脑病毒，证实本病存在。

[病原学]

乙脑病毒属披膜病毒科黄病毒属，呈球型，直径20～30nm，核心含单股RNA，有衣壳。在脂蛋白囊膜表面有血凝素刺突，能凝集鸡、鹅、羊等动物红细胞。抗原性稳定，但近年有报告以具有中和作用的单克隆抗体（McAb）检测15株国内的乙脑病毒时，可将其分为4个抗原组。人和动物感染本病毒后，均产生补体结合抗体，中和抗体和血凝抑制抗体。

本病毒在外界环境中抵抗力不强，56℃30分钟或100℃2分钟即可灭活。但对低温和干燥的抵抗力很强，用冰冻干燥法在4℃冰箱中可保存数年。

[流行病学]

①传染源：动物和人均可作为传染源，其中猪与马是重要的传染源。

②传播途径：主要通过蚊子（三带稀库蚊等）叮咬传播，台湾螺线也可传播本病。

3人群普遍易感，以隐性感染多见，反复多次隐性感染或病后有较高免疫力。

④流行特征：本病流行于东南亚及太平洋地区一些国家，80%～90%病例集中于7、8、9月份。老少均可发病，10岁以下儿童占发病总数的80%以上。

（一）传染源及储存宿主 主要传染者是家畜、家禽。人被感染后仅发生短期病毒血症且血中病毒数量较少，故患者及隐性感染者作为传染源的意义不大。

猪是我国数量最多的家畜，由于它对乙脑病毒的自然感染率高，而且每年因屠宰而种群更新快。因此，自然界总保持着大量的易感猪，构成猪→蚊→猪的传播环节。在流行期间，猪的感染率100%，马90%以上，为本病重要动物传染源。

蚊虫感染后，病毒在蚊体内增殖，可终身带毒，甚至随蚊越冬或经卵传代，因此除作为传播媒介外，也是病毒的储存宿主。此外蝙蝠也可作为储存宿主。

（二）传播途径 本病系经过蚊虫叮蛟而传播。能传播本病的蚊虫很多。现已被证实者为库蚊、伊蚊、按蚊的某些种。国内的主要传播媒介为三带喙库蚊。此外，从福建、广东的蠛蠓中，云南和四川的中，已分离到乙脑病毒，故也可能成为本病的传播媒介。

（三）易感人群 人群对乙脑病毒普遍易感，但感染后出现典型乙脑症状的只占少数，多数人通过临床上难以辨别的轻型感染获得免疫力。成人多因隐性感染而免疫。通常流行区以10岁以下的儿童发病较多，但因儿童计划免疫的实施，近来报道发病年龄有增高趋势。病后免疫力强而持久，罕有二次发病者。

[流行特征]

乙脑仅分布在亚洲。在我国疫区分布在兰州---长春连线以南的广大的地区内，仅东北北部、青海、新疆及西藏等地未见本病报告。本病有严格的季节性80～90%的病例都集中在7、8、9三个月内。但随地理环境的不同，流行季节略有上下，华南地区的流行高峰在6～7月，华北地区为7～8月，而东北地区则为8～9月，均与蚊虫密度曲线相一致。气温和雨量与本病的流行也有密切关系。

乙脑呈高度散发性，同一家庭同时有两个患者罕见。

[发病原理与病理变化]

当人体被带病毒的蚊虫叮蛟后，病毒即进入血循环中。发病与否，一方面取决于病毒的毒力与数量，另一方面取决于机体的反应性及防御机能。当人体抗体病能力强时，病毒即被消灭。如人体抵抗力降低，而感染病毒量大，毒力强时，病毒经血循环可突破血脑屏障侵入中枢神经系统，并在神经细胞内复制增殖，导致中枢神经系统广泛病变。不同的神经细胞对病毒感受不同，以及脑组织在高度炎症时引起的缺氧、缺血、营养障碍等，造成中枢病变部位不平衡，如脑膜病变较轻，脑实质病变较重；间脑、中脑病变重，脊髓病变轻。注射百日咳菌苗或患脑囊虫病者乙脑发病率明显高，可能系血脑屏障被破坏之故。

病变广泛存在于大脑及脊髓，但主要位于脑部，且一般以间脑、中脑等处病变为著。肉眼观察可见软脑膜大小血管高度扩张与充血，脑的切面上可见灰质与白质中的血管高度充血、水肿，有时见粟粒或米粒大小的软化坏死灶。显微镜下可见:

血管病变 脑内血管扩张、充血、小血管内皮细胞肿胀、坏死、脱落。血管周围环状出血，重者有小动脉血栓形成及纤维蛋白沉着。血管周围有淋巴细胞和单核细胞浸润，可形成“血管套”。

神经细胞变性、肿胀与坏死 神经细胞变性，胞核溶解，细胞浆虎斑消失，重者呈大小不等点、片状神经细胞溶解坏死形成软化灶。坏死细胞周围常有小胶质细胞围绕并有中性粒细胞浸润形成噬神经细胞现象（neuronophagia）。脑实质肿胀。软化灶形成后可发生钙化或形成空洞。

胶质细胞增生 主要是小胶质细胞增生，呈弥漫性或灶性分存在血管旁或坏死崩解的神经细胞附近。

由于以上病变的程度及分布各不相同，故在临床上神经症状表现极不一致。

[临床表现]

潜伏期为4～21天，一般10左右。整个病程分为三期：

①初期：病程第1～3天，有高热、呕吐、头痛、嗜睡；

②极期：病程第4～10天，头痛加剧，自好睡、昏睡至昏迷，惊厥或抽痉，肢体瘫痪或假直，有脑膜刺激征及颅内压增高表现，深度皆迷病人可发生呼吸衰竭。颅内病变部位不同还可出现相应神经系统症状和体征，此期持续10天左右；

③恢复期：多数病人体温下降，神志逐渐清醒，语言功能及神经反射逐渐恢复，少数人留有失语、瘫痪、智力障碍等，经治疗在半年内恢复，半年后仍遗留上述症状称之为后遗症。

潜伏期4～21天，一般为10～14天。病毒初在单核巨噬细胞内繁殖，再释放入血，多数人在感染后并不出现症状，但血液中抗体可升高 ，称之隐性感染。部分人出现轻度的呼吸道症状；极少数患者，病毒通过血脑屏障造成中枢神经系统病变，出现脑炎症状。典型患者的病程可分四个阶段：

（一）初热期 病程第1～3天，体温在1～2日内升高到38～39℃，伴头痛、神情倦怠和嗜睡、恶心、呕吐。小儿可有呼吸道症状或腹泻。

（二）极期 病程第4～10天，进入极期后，突出表现为全身毒血症状及脑部损害症状。

1．高热 是乙脑必有的表现。体温高达39～40℃以上。轻者持续3～5天，一般7～10天，重者可达数周。热度越高，热程越长则病情越重。

2．意识障碍 大多数人在起病后1～3天出现不同程度的意识障碍，如嗜睡、昏迷。嗜睡常为乙脑早期特异性的表现。一般在7～10天左右恢复正常，重者持续1月以上。

3．惊厥或抽搐 是乙脑严重症状之一。由于脑部病变部位与程度不同，可表现轻度的手、足、面部抽搐或惊厥，也可为全身性阵发性抽搐或全身强直性痉挛，持续数分钟至数十分钟不等。

4．呼吸衰竭 是乙脑最为严重的症状，也是重要的死亡原因。主要是中枢性的呼吸衰竭，可由呼吸中枢损害、脑水肿、脑疝、低钠性脑病等原因引起。表现为呼吸表浅，节律不整、双吸气、叹息样呼吸、呼吸暂停、潮氏呼吸以至呼吸停止。

中枢性呼吸衰竭可与外周性呼吸衰竭同时存在。外周性呼吸衰竭主要表现为呼吸困难、呼吸频率改变、呼吸动度减弱、发绀，但节律始终整齐。

高热、抽搐及呼吸衰竭是乙脑急性期的三联症，常互为因果，相互影响，加重病情。

5．脑膜刺激征 较大儿童及成人均有不同程度的脑膜刺激征。婴儿多无此表现，但常有前囱隆起。

6．其他神经系统症状和体征 若锥体束受损，常出现肢体痉挛性瘫痪、肌张力增强，巴彬斯基征阳性。少数人可呈软瘫。小脑及动眼神经受累时，可发生眼球震颤、瞳孔扩或可缩小，不等大，对光反应迟钝等；植物神经受损常有尿潴留、大小便失禁；浅反身减弱或消失，深反射亢进或消失。

7．其他 部分乙脑患者可发生循环衰竭，表现为血压下降，脉博细速。偶有消化道出血。

多数病人在本期末体温下降，病情改善，进入恢复期。少数病人因严重并发症或脑部损害重而死于本期。

（三）恢复期 极期过后体温在2～5天降至正常，昏迷转为清醒，有的患者有一短期精神“呆滞阶段”，以后言语、表情、运动及神经反射逐渐恢复正常。部分病人恢复较慢，需1～3个月以上。个别重症病人表现为低热、多汗、失语、瘫痪等。但经积极治疗，常可在6个月内恢复。

（四）后遗症期 虽经积极治疗，部分患者在发病6个月后仍留有神经、精神症状，称为后遗症。发生率约5～20%。以失语、瘫痪及精神失常最为多见。如继续积极治疗，仍可望有一定程度的恢复。

根据病情轻重，乙脑可分为4型：

1．轻型 患者神志始终清晰，有不同程度嗜睡，一般无抽搐，脑膜刺激不明显。体温通常在38～39℃之间，多在一周内恢复，无恢复期症状。

2．中型 有意识障碍如昏睡或浅昏迷。腹壁反射和提睾反射消失。偶有抽搐。体温常在40℃左右，病程约为10天，多无恢复期症状。

3．重型 神志昏迷，体温在40℃以上，有反射或持续性抽搐。深反射先消失后亢进，浅反射消失，病理反射强阳性，常有定位病变。可出现呼吸衰竭。病程多在2周以上，恢复期常有不同程度的精神异常及瘫痪表现，部分病人可有后遗症。

4．暴发型 少见。起病急骤，有高热或超高热，1～2天后迅速出现深昏迷并有反复强烈抽搐。如不积极抢救，可在短期内因中枢性呼吸衰竭而死亡。幸存者也常有严重后遗症。

乙脑临床症状以轻型和普通型居多，约占总病例数的三分之二。流行初期重型多见，流行后期轻型多见。

[诊断]

（一）流行病学资料 乙脑有明显的季节性，主要在7～9三个月内。起病前1～3周内，在流行地区有蚊虫叮咬史。患者多为儿童及青少年。大多近期内无乙脑疫苗接种史。

（二）临床特点 突然发热、头痛、呕吐、意识障碍，且在2～3天内逐渐加重；早期常无明显体征，2～3天后常见脑膜刺激征，幼儿出现前囱膨隆；查体腹壁反射、提睾反射消失；病理反射巴彬斯基征阳性；四肢肌张力增高等。重症病人可迅速出现昏迷、抽搐、吞咽困难及呼吸衰竭等表现；小儿常见凝视与惊厥。

（三）实验室检查

1．血象 白细胞计数一般在10～30×109/L，中粒细胞增至80%以上，核左移，嗜酸粒细胞可减少。

2．脑脊液检查 外观澄清或微混，白细胞计数增加，多数在0.05～0.5×109/L之间，个别病人可达1×109/L以上，或始终正常；在病初以中性粒细胞占多数，以后逐渐以淋巴细胞为多。蛋白稍增加，糖定量正常或偏高，氯化物正常。脑脊液中免疫球蛋白的测定对鉴别诊断有帮助。化脓性脑膜炎患者脑脊液中的IgM明显升高，结核性脑膜炎患者则IgA、IgG升高显著，而病毒性脑膜炎患者在后期时IgG可有升高。

3．血清学检查

（1）血凝抑制试验 可测定IgM抗体及IgG抗体，敏感性高，方法简便快速，但试验要求严格，偶见假阳性反应。双份血清效价增长4倍以上可确诊，单份血清抗体效价1:100为可疑，1:320可作诊断、1:640可确诊。

（2）二巯基乙醇（2ME）耐性试验 检测IgM抗体，患者血清标本在2ME处理前、后分别作血凝抑制试验，如处理后血凝抑制抗体效价下降1/2～3/4，表示特异性IgM已被2ME裂解，即为试验阳性。本法可在起病第4～8天即呈阳性，且由于单份血清即有辅助价值，故可对乙脑进行早期诊断。

（3）补体结合试验 特异性较高，但其阳性大都出现在第4～7周，双份血清抗体效价有4倍或以上的增长即可诊断。若仅单份血清，1:2为可疑，1:4以上有助诊断。

（4）中和试验 病后一周血中出现中和抗体，效价增长4倍以上可确诊。早期为IgM，后期为IgG。此法特异性及敏感性均较高，抗体持续终生。一般用于流行病学调查。

（5）免疫荧光试验 发病初1～2天的血液或发热第2～4天的脑脊液及发热全程的脑室内的脑脊液，均可采用本法检测乙脑病毒抗原，方法快速，阳性率高，有早期诊断价值。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：一般用于测定血清中的乙脑抗体，比较灵敏、特异。

4．病毒分离 病初可取血清或脑脊液接种乳鼠以分离病毒，但阳性率较低。通常仅于死后尸检或以延髓穿刺取脑组织制成悬液，离心后取上清液接种乳鼠脑内，传代后作鉴定，可作回顾性诊断。

[鉴别诊断]

（一）中毒型菌痢 本病亦多见于夏秋季，儿童多发，病初胃肠症状出现前即可有高热及神经症状（昏迷、惊厥），故易与乙脑混淆。但本病早期即有休克，一般无脑膜刺激征，脑脊液无改变，大便或灌肠液可查见红细胞，脓细胞及吞噬细胞，培养有痢疾杆菌生长，可与乙脑相区别。

（二）化脓性脑膜炎 症状类似乙脑，但冬春季节多见，病情发展较速，重者病后1～2天内即可进入昏迷。流脑早期即可见瘀点。肺炎双球菌脑膜炎、链球菌脑膜炎以及其他化脓性脑膜炎多见于幼儿，常先有或同时伴有肺炎，中耳炎，乳突炎，鼻窦炎或皮肤化脓病灶，而乙脑则无原发病灶。必要时可查脑脊液鉴别。

（三）结核性脑膜炎 少数结核性脑膜炎患者发病急，早期脑脊液含量可不低，在乙脑流行季节易误诊，但结脑病程长，有结核病灶或结核病接触史，结核菌素试验大多阳性。结脑脑脊液外观呈毛玻璃样，白细胞分类以淋巴细胞为主，糖及氯化物含量减低，蛋白可增加；放置后脑脊液出现薄膜，涂片可找到结核杆菌。

（四）流行性腮腺炎、脊髓灰质炎、柯萨奇及埃可病毒等所致中枢神经系统感染 这类病人脑脊液白细胞可在0.05～0.5×109/L之间，但分类以淋巴细胞为主。部分流行性腮腺炎患者可先出现脑膜脑炎的症状，以后发生腮腺肿胀，鉴别时应注意询问流腮接触史。少数乙脑病人可有弛缓性瘫痪，易误诊为脊髓灰质炎，但后者并无意识障碍。柯萨奇病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒、水痘病毒等也可引起类似症状。应根据流行病学资料，临床特征及血清学检查加以区别。

（五）钩端螺旋体病 本病的脑膜炎型易与乙脑混淆，但多有疫水接触史，乏力、腓肠肌痛、结膜充血、腋下或腹股沟淋巴结肿大，脑脊液变化轻微。可用血清学试验加以证实。

（六）脑型疟疾 发病季节、地区及临床表现均与乙脑相似。但脑型疟疾热型较不规则。病初先有发冷、发热及出汗然后出现脑症状。还可有脾肿大及贫血。血片查找疟原虫可确诊。

（七）其他 新型隐球菌性脑膜炎、中暑、脑血管意外、蛛网膜下腔出血、急性脑型血吸虫病、斑疹伤寒及败血症等所致脑病，亦应根据发病地区、临床表现以及实验室检查，加以鉴别。

[治疗]

乙脑病情重，变化快，高热、抽搐、呼吸衰竭是本病的三个重要症状，可互相因果，形成恶性循环，因此必须及时发现，抓住主要矛盾，尽快采用中西医结合措施，促使矛盾转化。以利康复。

（一）一般治疗 病室应安静，对病人要尽量避免不必要的刺激。注意口腔及皮肤的清洁，防止发生褥疮。注意精神、意识、体温、呼吸、脉搏、血压以及瞳孔的变化。给足够的营养及维生素。

（二）对症治疗

1．隆温 使室温控制在30℃以下，可采用室内放冰块、电风扇、空调等。

物理降温可用30%酒精擦浴，在腹股沟、腋下、颈部放置冰袋；也可用降温床或冷褥。

消炎痛12.5～25mg，每4～6小时一次。也可用牛黄清心丸、柴胡注射液等中药。

上述方法效果不显时，可采用亚冬眠疗法，肌肉注射氯丙嗪及异丙嗪各0.5～1mg/kg/次，每4～6小时一次，同时加用物理降温，使体温降至38℃左右。

2．惊厥或抽搐 应根据惊厥、抽搐原因采取针对性的措施。（1）多数抽搐者，降温后即可止惊。（2）呼吸道分泌物阻塞所致缺氧者，应及时吸痰、保持呼吸道通畅。（3）脑水肿或脑疝者，应立即采用脱水剂治疗。一般可用20%甘露醇1～1.5g/kg静脉注射或快速静滴。必要时作气管切开。（4）脑实质炎症引起的抽风可用中药、新针治疗。给予镇静剂或亚冬眠疗法。频繁的抽风可同时加用氢化考的松治疗。（5）低血钙引起的抽搐应及时补充钙剂。（6）由脑性低血钠引起的抽风可用3%盐水滴注。

镇静剂应用原则：（1）宜早用，在有抽搐先兆、高热、烦燥，惊厥及肌张力增加时，即与应用：（2）肌肉松弛后即停；（3）掌握剂量，注意给药时间。常用药物如下：

（1）安定 成人10～20mg/次，小儿0.1～03mg/kg/次，肌注，必要时静脉缓注，但不超过10mg。

（2）水合氯醛 成人1.5～2g/次，小儿50mg/kg/次（每次不大于1g）,鼻饲或保留灌肠。

（3）异戊巴比妥钠（阿米妥钠）成人0.2～0.5g/次，小儿5～10mg/kg/次，稀释后静脉缓注（1ml/分），至惊厥缓解即停注。用时注意观察呼吸，如减慢则立即停止注射。

（4）苯妥英钠：成人0.1g，每6～8小时肌注一次。有积蓄作用，不宜长时间应用。

（5）苯巴比妥钠、副醛、冬非合剂等可酌情选用。

3．呼吸衰竭的治疗

（1）保持呼吸道畅通 定时翻身拍背、吸痰、给予雾化吸入以稀释分泌物。

（2）给氧 一般用鼻导管低流量给氧。

（3）气管切开 凡有昏迷、反复抽搐、呼吸道分泌物堵塞而致发绀，肺部呼吸音减弱或消失，反复吸痰无效者，应及早气管切开。

（4）应用呼吸兴奋剂 在自主呼吸未完全停止时使用效果较佳。可用洛贝林、可拉明、利他林等。

（5）应用血管扩张剂 近年报道认为用东莨菪碱、山莨菪碱有一定效果。前者成人0.3～0.5mg/次，小儿0.02～0.03mg/kg/次，稀释后静注，20～30分钟1次；后者成人20mg/次，小儿0.5～1mg/kg/次，稀释后静注，15～30分钟1次。

（6）应用脱水剂 脑水肿所致颅内高压是乙脑常见的征象，亦为昏迷，抽搐及中枢性呼吸衰竭的原因，并可形成脑疝，故应及时处理。其具体方法：20%甘露醇或25%山梨醇，1～2g/kg次，15～30分钟推完，每4～6小时一次。有脑疝者可用2～3g/kg。应用脱水疗法注意水与电解质平衡。

（7）必要时应用人工呼吸机。

4．皮质激素 多用于中、重型病人，有抗炎、减轻脑水肿、解毒、退热等作用。氢化考的松5～10mg/kg/日或地塞米松10～20mg/日，儿童酌减。

5．能量合剂 细胞色素C、辅酶A、三磷酸腺甙等药物有助脑组织代谢，可酌情应用。

6．应用免疫增强剂

乙脑患者细胞免疫功能低下，近年虽有使用转移因子、免疫核糖核酸、乙脑疫苗、胸腺素等治疗者，但疗效尚不能肯定。干扰素亦可试用。

7．恢复期及后遗症的处理

（1）药物治疗 ①28.75%谷氨酸钠注射液、谷氨酸片、烟酸等促进血管神经功能恢复。②兴奋不安者可用安定、利眠宁或氯丙嗪。③有震颤或肌张力高者，可用安坦，东莨菪碱或左旋多巴，亦可使用盐酸金刚烷胺。④肌张力低者，可用新斯的明。

（2）新针疗法 ①神志不清、抽搐、燥动不安者取穴大椎、安眠、人中、合谷、足三里。②上肢瘫痪者取穴安眠、曲池透少海，合谷透劳宫；下肢瘫痪者取穴大椎、环跳、阳陵泉透阴陵泉。③失语取穴大椎、哑门、增音。④震颤取穴大椎、手三里、间使、合谷、阳陵泉。

（3）超声波疗法 应用超声波机每天治疗15～20分钟，双侧交替，疗程2周，休息3天，可反复数疗程，据报道亦有一定疗效。

（4）功能锻炼。

[预后]

[预防]

乙脑的预防主要采取两个方面的措施，即灭蚊防蚊和预防接种。

（一）灭蚊 三带喙库蚊是一种野生蚊种，主要孳生于稻田和其它浅地面积水中。成蚊活动范围较广，在野外栖息，偏嗜畜血。因此，灭蚊时应根据三带喙库蚊的生态学特点采取相应的措施。如：结合农业生产，可采取稻田养鱼或洒药等措施，重点控制稻田蚊虫孽生；在畜圈内喷洒杀虫剂等。

（二）人群免疫 目前国际上主要使用的乙脑疫苗有两种，即日本的鼠脑提纯灭活疫苗和中国的地鼠肾细胞灭活疫苗。

减毒活疫苗我国正在试用中，该疫苗系选用60年代SA14株经地鼠肾细胞连续传代，紫外线照射等措施后获得的三个减毒活疫苗株，远较国外的减毒株毒力低。而免疫原性好。

疫苗注射的对象主要为流行区6个月以上10岁以下的儿童。在流行前1个月开始，首次皮下注射，（6～12个月每次0.25ml，1～6岁每次0.5ml，7～15岁每次1ml，16岁以上每次2ml）间隔7～10天复种1次，以后每年加强注射一次。预防接种后2～3周体内产生保护性抗体，一般能维持4～6个月。

参考资料：

流行性乙型脑炎，根据神经系统受损的轻重不同，分为四种类型：

（1）轻型。神经系统受损不重，表现为一般发热（39℃以下），全身不适、头痛、呕吐、轻度嗜睡，多在一周内恢复。

（2）普通型。突然发热39℃～40℃，头痛、呕吐、嗜睡、浅昏迷，偶尔有抽风、颈部硬直，病程一至二周，经治疗大部分患者能恢复。

（3）重型。突然高热40℃左右，神志昏迷、反复抽风、高热不退、颈部强直、肢体紧张，病程可达二至四周以上，部分患者留有后遗症，少数死亡。

（4）极重型（暴发型）。高热40℃以上，反复抽风，深度昏迷，常死于呼吸衰竭。存活者多留有后遗症。

蚊子是流行性乙型脑炎主要传播媒介。

乙脑病毒存在于病人和受病毒感染后的动物（猪、马、驴、牛、羊、狗、鸭、鹅等）的血液中，当蚊子吸了这些动物的血液后，再去叮咬健康人时，病毒就经皮肤进入毛细血管，在血液中繁殖。

病毒最后到达中枢神经系统，而引起大脑发炎，出现头痛、呕吐、血压升高，严重的还会抽风，昏迷以至呼吸衰竭。如果不及时抢救，往往危及生命。

怎样知道小儿是患了乙型脑炎？ 在蚊子孳生的季节（七至九月），遇突然有高热、头痛、呕吐、精神差、嗜睡、昏迷、抽风、脖子发硬以及肢体瘫痪等症状，年龄在十岁以下，尤其是三至六岁的小儿，就应该警惕。需经脑脊液检查证实，如蛋白稍高，糖及氯化物正常，就可诊断乙型脑炎。

“乙脑”和“流脑”不是一个病。“乙脑”就是我们常说的大脑炎，是经蚊子传染的、夏秋季流行的一种急性传染病，病源是乙型脑炎病毒。

流脑是冬春季常见的急性传染病，由脑膜炎双球菌所引起的，多见于儿童。病菌经呼吸道进入体后，部分进入血液形成败血症，最终局限于脑部形成脑膜炎。

因为致病原因不同，表现症状及治疗方法也不同。

小儿患了乙脑有什么危险？

由于乙脑病毒主要侵犯中枢神经系统，引起从大脑到脊髓的广泛病变，使人体维持生命的重要中枢受到威胁。因此，孩子得病后，病情常十分凶险，病孩会很快陷入昏迷，伴失语、吞咽困难，甚至出现肢体瘫痪等。一旦抢救不及时，病孩常因呼吸、循环衰竭而死亡。

虽然大部分病孩经抢救治疗后，大约1～3个月后逐渐恢复正常，但有少数孩子在得病6个月后，仍留有意识障碍、痴呆、失语、瘫痪等严重后遗症，以致造成终身残疾。

乙型脑炎有哪些后遗症？

患乙型脑炎后六个月以上，还残留有神经、精神症状的叫乙型脑炎后遗症。最常见的后遗症有失语、吞咽困难、肢体瘫痪、神志不清、智力障碍、大小便失禁、精神失常及癫痫等。儿童以失语和肢体瘫痪为主。

治疗乙脑有特效药吗？

治疗乙脑并没有什么特效药，但是可以采用中西医结合的综合治疗，如能正确辨证，合理用药，及时处理，大多病儿可以转危为安。

常用的中药是以清热解毒为主，西药则以对症治疗和支持治疗为主，即在高热时可用退热药或放冰袋等降温，抽筋时可用止惊药，痰多时要吸痰，循环不好时可用强心利尿和维持血压的药物，病儿不能进食可用静脉补液维持营养，呼吸障碍时可根据引起呼吸障碍的原因选用不同药物或使用人工呼吸器。总之，通过种种方法，尽量争取渡过危险期。在恢复的过程中，如有后遗症，还需要根据后遗症的不同情况，采取针灸、理疗、按摩或用中西药物治疗等措施，力争早日康复。

怎样隔离乙脑病儿？

乙脑病毒是通过蚊子作媒介而在禽畜和人类中相互传播的，所以乙脑病人也应隔离起来，不过隔离方法与通过呼吸道或消化道传染的疾病不一样，只要把乙脑病人放在没有蚊子的房间里，或者用蚊帐罩起来，不让蚊子叮咬，那末病人身体内的病毒就不会传染给别人。

怎样治疗乙型脑炎后遗症？

乙型脑炎治疗方法包括中医中药辩证论治、针刺、耳针、电针、推拿、按摩、理疗、功能锻炼、手术治疗等。患儿只要在医生的指导下，有选择地进行治疗，坚持治疗一至二年就有可能恢复健康。

流行性乙型脑炎（简称乙脑）是由乙脑病毒引起的，经蚊子叮咬传播的，以脑实质炎症为主要病变的中枢神经系统的急性传染病。临床表现为高热，意识障碍，抽搐，病理反射及脑膜刺激征，重症出现中枢性呼吸衰竭。死亡率高，可有后遗症，儿童疫苗接种后发病率大幅下降。

流行性乙型脑炎简称”乙脑”，是由流行性乙型脑炎病毒引起的中枢神经系统总控传染病．蚊子是传播本病的主要媒九本病有很明显的季节性，多见于7－9月份，这与气温和蚊子的繁殖有关．3～6岁的小儿最易得病，近年来由于普遍接种预防疫苗，无免疫力的幼儿和成人，尤其是老年人也能得病。 被带有病毒的蚊子叮咬后，大多数人仅产生病毒血症，而不出现神经系统症状．医学上称为隐性感染，绝大多数成人都因此而获得免疫力．少数人经蚊子叮咬后，约10一15天后发病．症状较重不一．一般起病急，突然发热、恶心、呕吐、嗜睡，头痛．2～8天后病情明显加重，常出现昏迷、躁动不安、抽痉、说胡话、呼吸不规则、颈项发硬等表现．极重的病例可因高烧、抽控不止，脑水肿、呼吸式循环衰竭而死亡．也有一部分病孩症状很轻，只有头痛和低烧，几天内就完全恢复正?/div>