苯酚是固体如何萃取dna

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS（十二烷基磺酸钠）将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。

DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。

离心后有机溶剂在试管底层（有机相），DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚–氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

1、冰箱取出重蒸酚，室温放置-68度水浴溶化，切勿立即放入68度的水浴中，以防玻璃炸裂

2、加8－羟基喹啉至0.1％和β－巯基乙醇至0.2％，（原液14. 4MOL/ML），混匀，溶液呈现黄色，倒入分液漏斗中（也可在烧杯中进行）

3、加入等溶剂的1MOL/ML的Tris(PH8.0),反复混匀后，静至分层；放出下层黄色酚液，弃上层

4、加固体Tris约1g/100ml酚，摇匀，去水相

5、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)平衡数次，至PH为8.0

6、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)于棕色瓶中4度保存

7、如黄色消失或呈粉红色，则不能使用

原理：

1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：

1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。5min

2．溶解DNA：

3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢

4．过滤：取黏稠物

5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3min

6．过滤：取滤液。

7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5min

8．DNA的鉴定：沸水浴5min

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DNA提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。

将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

2.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法②化学试剂法：用SDS处理细胞③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

3.DNA提取的几种方法

(1).浓盐法

A.利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.

B.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA

（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态

（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.

2.只能是TE，一般用ph8，TAE和TBE是跑胶用的buffer，含有大量的盐

现在都是直接混合抽两次了，你的文献太老了吧

1、萃取需要先检查分液漏斗是否漏水.

2、加入混合溶液和萃取剂苯.

3、震荡后将分液漏斗放在铁架台的铁圈上静置.

4、打开分液漏斗活塞，再打开旋塞，使下层液体从分液漏斗下端放出，待油水界面与旋塞上口相切即可关闭旋塞.

5、把上层液体从分液漏斗上口倒出。由于苯密度比水小，故分液漏斗下段液体才是苯和苯酚混合液，后进行蒸馏提纯即可得到纯净苯酚。

快速微量提取法

a.取1.5ml菌体培养物于一灭菌ep管中，12000rpm离心1min,

丢去上清夜，收集菌体。

b.加入400ul裂解液（40mmtris-醋酸，20mm醋酸钠,1mmedta,1%sds,ph7.8）混匀,置于37oc水浴1hr。

c.然后加入200ul5mol/l的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。

d.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

e.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3m

,ph8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulte溶液中，置4oc保存备用。

2

蛋白酶/sds法制备

先用10ml含适当抗生素的gbm过夜培养delftia

sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用washing

te（50mmol/ltris-hcl

ph8.0,10mmol/ledta

ph8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml

1×te缓冲液中，先后加入0.5ml

5mg/l的蛋白酶、0.5ml

10%

sds，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀dna，用自动移液器吸管头将絮状dna沉淀块吸附到ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×te或ddh2o中。

3

1)

细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。

2)

细菌收集：取1ml培养物于1.5ml

ep管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml

te（ph8.0）中（用ddh2o也行)。

3)

菌体裂解：加入6μl

50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/lnacl50μl，10%sds

110μl，20mg/ml的蛋白酶k

3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）

4)

抽提：菌液均分到两个1.5ml

ep管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）

5)

沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1

2000rpm离心10min。

6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。

7)

抽（凉）干后，溶于50μl

ddh2o中，取2-5μl电泳。作pcr模板用。