二甲苯脱蜡温度

1.取材：用锋利的刀片切取材料。

2.固定：将已切好的材料放入10%的福尔马林溶液(即10%甲醛或者4%PFA in 1xPBS)中固定12-24小时。固定剂一般为组织块体积的10-15倍。

3.放入全封闭式脱水机中（由于是皮肤组织不用洗涤直接放入脱水机中）。脱水机可以进行酒精脱水，透明和透蜡这三步。

酒精脱水：一般经50%、70%、85%、95%直至纯酒精。每级停留约30分钟至1小时。如需过夜，应停留在70%酒精中。

透明：材料先在纯酒精和二甲苯各半的混合液浸15—30分钟，再转入纯二甲苯中透明（至透明为止），一般15—30分钟。

透蜡：材料自二甲苯中取出后,先移入二甲苯和石蜡等量的混合液中约30分钟，然后进入纯石蜡中约40—60分钟，再换纯石蜡一次约40—60分钟。

4.自动包埋机中包埋样本。

5.切片并贴片。(切5um)

6.染色的一般方法

由于要染的切片包在石蜡之中，而所用的染色剂又常常为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水，石蜡切片在二甲苯中溶去石蜡，经过各级酒精，下降至水，经染色后需再脱水，上升到二甲苯透明然后封藏。

脱蜡至水

7.二甲苯脱蜡5-10min（建议10min）。

8.二甲苯与纯酒精等量混液5min。

9.纯酒精，95%、85%、70%、50%酒精各2min。

10.蒸馏水5min(置于摇床上)，2次。

（此步骤直接HE的苏木精染色及后面步骤，具体见HE染色方案，或者接下面的免疫染色）

抗原修复

11.二甲苯中浸泡2次，每次20min.

12.分别在100%，95%，80%，60%的乙醇中浸泡，每种5min。

13.ddH2O中浸泡3次，每次1min.

14.浸入抗原修复液中（Tris-EDTA,PH9）,微波炉中中火10min.室温自然冷却35min。抗原修复液不可交叉使用。抗原修复液种类根据要验证的蛋白类型来选择。膜蛋白和胞质蛋白所推荐修复液不一样。

15.1XTBS 洗三次，每次5min。

16.封闭液（5% goat serum in 1xPBS，封闭血清不能与二抗来源一致）室温封闭1h.

17.一抗(用1xTBS稀释)室温2h(要放在湿盒中防止干掉)或者4℃过夜。抗体现配现用，且不要反复冻融。

抗原修复也可以采用这个方法：这是我从一个有长期石蜡切片免疫染色经验的实验室的师姐那里求来的。她说他们一直用这个方法，挺好用的，可以一试。

柠檬酸：Citric acid 品牌：sigma anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested Catalog #: C2404-100G

柠檬酸钠：二水合柠檬酸三钠Sodium citrate tribasic dihydrate ACS reagent, >= 99.0% 品牌：sigma Catalog #: S4641-500G

柠檬酸（100mM）：500 ml ddH2O + 9.6 g 柠檬酸

柠檬酸钠（100mM）：500 ml ddH2O + 14.7g 柠檬酸钠

柠檬酸钠修复液（200ml）：3.8 ml 柠檬酸（100mM）+ 16.2 ml 柠檬酸钠（100mM）+ 180 ml ddH2O

配制柠檬酸钠修复液（200ml）：3.8 ml 柠檬酸（100mM）+ 16.2 ml 柠檬酸钠（100mM）加ddH2O定量至200 ml。

抗原修复：柠檬酸钠修复液浸泡，置于58℃烘箱内过夜（12-16h）。

1、1蜡，脱蜡二甲苯I、水，百分之百，百分之九十，百分之八十，百分之七十酒精各5分钟，自来水冲洗十五分钟。

2、苏木精染色5分钟根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。

3、百分之五乙酸分化1分钟，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜色变浅了一些，成为蓝色。

4、返蓝，返蓝液，实验室没有，也可不用。

5、伊红染色1分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。

6、脱水:，百分之七十、百分之八十、百分之九十、百分之百酒精各10秒，二甲苯1分钟，放在通风橱自然晾干再封片，约5分钟左右。

7、滴上中性树胶，封片，用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，压片后要将组织全部覆盖完避免中间有气泡。

石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.

石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.

取材

用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定.

取材的注意事项如下:

(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织取病理材料时,应设置对照材料.

(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm小段叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.

(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.

(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行)对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.

(二)固定

将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.

良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.

常用固定液:

简单固定液 以一种化学药品配制的固定液.

⑴ 乙醇 为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.

⑵ 甲醛 为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.

⑶ 醋酸 为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.

2. 混合固定液:

由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:① 优缺点互补② 膨胀与收缩相互平衡③ 强氧化剂与还原剂应分别配置.

常用混合固定液有下列几种:

⑴ FAA 固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇) 广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24 h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.

⑵ 纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存主要用于显示分裂相.

(三)抽气

植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.

一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.

(四)洗涤

固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24 h.

(五)脱水

材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.

脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料.

(六)透明

透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.

二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..

(七)浸蜡

是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.

浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.

每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.

(八)包埋

材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.

操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.

(九)切片

即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.

(十)贴片

是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.

常用的粘片剂有下列二种:

(1) 明胶黏片剂

(2) 蛋清黏片剂

(十一) 染色

即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.

染色方法可分为下列几类:

① 单染 只用一种染料染色.

② 双重染色 两种染料染色,如番红--固绿苏木精---曙红.

③ 多重染色 多种染料染色,如番红—固绿—桔红G酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.

(十二) 封藏

封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.

方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.

冷冻切片法：

冷冻切片的制作方法

（1）低温恒冷箱冷冻切片制作法

1．本室现有Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。

冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。

2．操作方法及步骤：

①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。

⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。

3．冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

4．冰冻切片的快速染色法

冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分钟。

② 水洗。

③ 染苏木素3－5分钟。

④分化。

⑤ 于碱水中返蓝20秒。

⑥ 伊红染色10－20秒。

⑦脱水，透明，中性树胶封固。

冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。

冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。

免疫组化对标本处理最后的脱水透明需要采用由低至高的梯度酒精脱水，是避免直接将组织投入高浓度酒精中而造成组织过度收缩。脱蜡和水化的目的和原理不一样，但都是利用酒精既溶于水又溶于有机溶剂的特性。

组织脱水的目的是通过酒精的媒介让有机溶剂渗透入组织，再让石蜡置换有机溶剂，从而使组织包埋在石蜡中。而水化是组织切片经二甲苯脱蜡后，用酒精洗去二甲苯，所以必须从高浓度酒精开始，让后再利用酒精的媒介入水。

PV－9000是2001年投入美国市场的，它是将二抗抗体分子的单价Fab段与酶聚合在一起，与一抗结合后，直接用底物进行显色的方法。此方法由于简单、快速、敏感性强且避免了内源性生物素所造成的背景染色，以有逐渐取代其他免疫酶组织化学检测方法的趋势。

PV法操作流程

1石蜡切片脱蜡至PBS。

2 0.3％H2O2甲醇液或3％H2O2室温孵育20min。

3 抗原修复。

4滴加适当稀释的一抗370C 60min或40C过夜。

5 PBS洗涤。

6 酶标记二抗370C 30min或室温60min。

7 DAB(0.04%)显色（镜检控制），水洗、复染、封片

二·sp法是一抗＋生物素化二抗＋HRP标记的链霉卵白素（HRP标记的亲和素）

一般的sp法步骤啊,具体如下：

1.烤片，68℃，20分钟,

2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min

3.阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；

4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。

5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.

6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；

滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min

7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min

8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，

苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

三·检测试剂盒

灵敏度高而极易控制背景的检测系统试剂盒是最为理想也是免疫组化染色优劣的关键，根据免疫组化技术发展至今PV系列及SP试剂盒更优于其它试剂盒。检测系统应与一抗来源相匹配，否则检不出目的物。如一抗是鼠单或多抗的，二抗就应该是羊或兔抗鼠的。

四·建议选SP，亦可根据实验室习惯及在组织中的表达情况来定