六种苯酚类化合物的高效液相色谱法测定

1、滤光片波长精度检查及其峰值测定

方法及其衡量的标准：用高精度紫外可见分光光度计（波长精度±0.3nm）对不同波长的滤光片进行光谱扫描，检测值与标定值之差即为滤光片波长精度，其差值越接近于零且峰值越大表示滤光片的质量越好，波长精度越高。理论基础：酶标仪的滤光片质量好坏，直接影响仪器的灵敏度高低，而滤光片的质量又是以其波长精度及其峰值指标来衡量的，因此滤光片波长精度及峰值是衡量酶标仪的重要参数之一，这在厂家的仪器说明书中虽未曾提及，但在仪器的实际使用过程中，我们发现对滤光片波长精度和峰值进行检查是重要的也是必要的，通过检查可以发现滤光片的波长标定值与实测值的符合程度，可以发现滤光片的质量是否符合要求。

2、灵敏度和准确度的监测方法：

①灵敏度：精确配制6ug/ml重铬酸钾（干燥）溶液（0.05mo1／L硫酸溶解），加入200ul重铬酸钾溶液于小孔杯中，以0.05mo1／L硫酸溶液作空白，于450nm（参比波长650nm）测定，其吸光度应≥0.01A。

②准确度：准确配制：1mmo/L对硝基苯酚（提纯品）水溶液，然后以10mmo1／L氢氧化钠溶液25倍稀释之，加入200ul稀释液于小孔杯中，以10mmo1／LNaOH溶液作空白，于405nm（参比波长650nm）检测，其吸光度应在0.4A（0.395～0.408A）左右。说明：仪器的灵敏度和准确度主要受两个因素影响：一是滤光片波长的精度，二是检测器的质量。通常情况下，滤光片原因导致仪器的灵敏度和准确度下降比较容易检查；而检测器质量差异则不易被发现，因此我们采用上述两种标准物质溶液对仪器检测器的质量进行定期监测，从而保证了仪器检测结果的可靠性。对于仪器准确性的测定，我们采用了文献报道的方法，经过多次在不同型号仪器间进行反复测定，结果发现该标准物溶液在450nm波长处有一较为恒定的测定值，由于酶标仪与其它分光光度计的光学原理不完全相同，故是否可以作为评价酶标仪准确性的参考方法还有待同行进一步研究考证。

3、通道差与孔间差检测方法及其表达方式：

①通道差检测：

取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑、透明、无划痕、无污染）以酶标板架作载体，分别加入三种不同浓度的甲基橙溶液200ul先后置于8个通道的相应位置，蒸馏水调零，采用双波长（测定波长490nm，参比波长630或650nm，以下均相同）连续测三次，观察其不同通道之间测量结果的一致性可用极差值来表示其通道差。

②孔间差的测量：

选择同一厂家、同一批号酶标板条（8条共96孔）分别加入200ul甲基橙溶液（吸光度调至0.065～0.070A）先后置于同一通道，蒸馏水调零，采用双波长检测，其误差大小用±1.96s衡量。理论解释：为了提高酶标仪的检测速度，根据96孔酶标板的规格特点，目前大多数厂家的中、高档酶标仪均采用8通道的检测器（部分中、低档酶标仪目前仍采用单通道）．因而它们每个通道的检测能力是不尽相同的，它是仪器内部的固有误差，与所测溶液浓度成正相关（不同检测器对不同浓度溶液的响应能力不同），所以通道差是衡量酶标仪性能良好与否的重要指标之一；其衡量指标用极差表示，这与厂家推荐的指标是一致的；极差值越接近于零，通道差越小，说明同一样品于不同通道检测结果的一致性越好。由于不同厂家、不同批号酶标板之间的质量差异，导致孔与孔之间的检测结果也不完全一致，这与水平光路光度计的比色皿质量是否符合要求一样，因此我们认为孔间差是仪器外部的固有误差，只有准确测知孔间差，并对结果作出相应的校正，才能使检验结果更符合实际情况、更准确可靠；采用的评价指标（士1.96s）也是有利于结果校正的。另外，在设计孔间差测量的操作方法上，我们将200ul甲基橙溶液吸光度调至0.065～0.070A，是充分考虑到加样器的误差（上海求精公司，200ul，士2％CV），其目的是使加样误差控制在仪器的分辨率（0.01A）以下，这样也就避免了孔间差结果不因加样误差而导致假性增高。

4、零点飘移方法：

取八只小孔杯，分别置于八个通道的相应位置，均加入200ul蒸馏水并调零，采用双波长或单波长（490nm）每隔30min测定一次，观察8个通道4h内的吸光度变化。其与零点的差值即为零点飘移。测量原理：酶标仪的零点飘移通常是很小的，这是由于仪器在读数之前，先要做8个通道的本底测量（Io）．然后再读取样品板的各孔测定值（I），根据Beer'slaw光吸收值=1ogl0（Io／I），每次读数经过如此的自动校正，使得读数误差大大降低，这样的测读方式无疑是非常正确的的；另外有的仪器是应用"DRLDYE"检测试条来进行绝对吸光度的校准的，因此在采用单波长测量时，会导致吸光度的假性增高，这种仪器可采取两种方法进行校正，一是选择一合适的参比滤光片进行双波长测定，二是引入修正参数，即在吸光度模式下单波长读取1个空白孔，其测试值和预测值之差值即为修正参数。所以零点飘移是评价仪器在一定时间内零点吸光度的变化趋势，与波长无关，它间接地反映了仪器内部检测系统在单位时间内处于工作状态下的稳定性及仪器的机械性能情况（连续进板、检测、退出），故它是评估仪器内部电路系统、光学系统（检测器）及机械系统良好与否的指标。

5、精密度评价方法及评价指标：

每个通道三只小杯，分别加入200ul高、中、低三种不同浓度的甲基橙溶液，蒸馏水调零，采用双波长作双份平行测定，每日测定两次，连续测定20天。分别计算其批内精密度、日内批间精密度、日间精密度和总精密度及相应的CV值。理论依据：1984年美国临床实验室标准委员会发表了EP5一T文件并于1992年进行了第二次修订：临床化学仪器精密度性能的用户评价。该评价方案在生化分析仪、血细胞计数仪等仪器和试剂的评价中得到了广泛的应用，使评价仪器的方法得到了统一；而该法应用于酶标仪的评价在国内外则尚未见有类似的报道，我们采用该法对酶标仪进行系统评价，结果是比较满意的。各指标的意义为：批内精密度系由20d中每天两批，每批两次之差（即"批内"）经统计学处理后所得的结果；日内批间精密度系由20d中每天两批测定结果均值之差（即"批间"）经统计学处理后所得的结果；日间精密度表示20d中每天所测均值的标准差即标准误，反映了每日均值的离散度；总精密度则是对批内、批间和日间精密度进行加权统计的结果。其中以批内精密度和总精密度的应用最为广泛，与传统的批内精密度的计算方法（即对同一标本在同一天内同时重复测定多次）相比，前者更符合实验室的实际情况，更有代表性，也更加合理；而总精密度则客观地全面地反映了实验室的总体变异情况。

6、线性测定方法：

精确称取甲基橙配制5个系列浓度的溶液，采用双波长平行检测8次求其均值。计算回归方程、相关系数r及标准估计误差Sy,x，并用±1.96Sy,x表示样品的95％测量范围。评价指标解释：线性测定也是评价仪器的重要手段之一，因为它是仪器开展定量工作的基础和前提，某些厂家用标准估计误差s来衡量线性，这与实验室通常所采用的相关系数r是一致的，因此在进行线性评估时，我们同时报告r和Sy,x，目的是为了增强用户与厂家之间的可比性。

7、双波长评价

方法：在运用酶标仪检测样品时，由于溶液中的小气泡、杯底的水纹印及划痕、小孔杯之间透明度的差异等等，这些都是仪器测定过程中最常见的干扰因素，而标本中的干扰组份（如溶血、黄道）因洗涤而对测定结果影响则较小，因此我们将文献中的双被长评价方法改为：取同一厂、同一批号酶标板条（每个通道2条共24孔）每孔加入200ul甲基橙溶液（吸光度调至0.065～0.070A）先后于8个通道分别采用单波长（490nm）和双波长（测定波长490nm、参比波长630／650nm）进行检测，计算单波长和双波长测定结果的均值、离散度，比较各组之间是否具有统计学差异以考察双波长清除干扰因素的效果。

说明：双波长测定过程中，由于标本中干扰组份的存在以及小孔杯本身质量等原因，常常导致测定结果的假性增高，而酶标仪提供的双波长测定功能则可以消除干扰组份或因素对测定结果的影响．对于标本中干扰组份的清除，在选择参比波长时，我们应对于扰组份的光谱进行研究，以正确选择参比波长；而对于小孔杯本身质量问题等干扰因素的消除，只要选择远离测定波长的参比波长即可以了、这对保证测定结果的准确性是非常重要的。

1、目前，国内外有关酶标仪性能评价与鉴定方法的报道尚不多见，由于酶标仪在临床实验室中的应用越来越普及，因而，建立一套完善的酶标仪性能评价方法并对仪器进行全面的较为系统的综合评价乃是临床实验室工作人员的当务之急，这对进一步增强仪器之间的可比性和保证ELA法的工作质量是至关重要的，同时将其评价指标引入到检测结果的校正工作中，合理地作出各个定性试验项目的可信限与界值，对正确判读结果和开展定量检测工作具有一定的指导意义。

2、在对酶标仪进行评估时，还应对仪器的自动化程度及售后服务有一个比较全面的了解。自动化程度如仪器的分辨率（一般为0.001A）、报告的方式（通常提供4～6种以上的格式）、可提供滤光片的最大数目（有些厂家可根据用户要求订做）、是否提供用户自编程序及外接微机的功能和软件等等。

3、售后服务也是仪器使用顺利与否的根本保证，用户应当与信誉较好、服务周到、维修方便的代理商进行恰谈，以免仪器一旦出现故障，而不致于影响工作或使仪器处于瘫痪状态不能发挥应有的社会效益和经济效益。

4、另外需要强调的是：由于酶标仪的种类、型号繁多，每个仪器的测量原理也不尽相同，为了保证不同仪器之间测定结果的一致性，我们认为在测定时应采用双波长法，而且必须采用双波长，这样既能消除干扰组份和干扰因素的影响，又能避免因仪器测量原理不同而造成仪器之间结果的不一一致性。答案来自

微量水分测定仪原理：

试剂溶液是由占优势的碘和充有二氧化硫的吡啶、甲醇等混合而成。卡尔--菲休试剂同水的反应原理是：基于有水时，碘被二氧化硫还原，在吡啶和甲醇存在的情况下，生成氢碘酸吡啶和甲基硫酸氢吡啶。反应式为：

H20+I2+SO2+3C5H5N → 2C5H5N·HI+C5H5N·SO3 …………(1)

C5H5N·SO3+CH3OH  → C5H5N·HSO4CH3  …………………(2)

在电解过程中,电极反应如下：

阳极：2I- - 2e → I2  …………………………………(3)

阴极：2H+ + 2e → H2↑…………………………………(4)

阳极产生的碘又与水反应生成氢碘酸，直至全部水分反应完毕为止，反应终点用一对铂电极所组成的检测单元指示。依据法拉第电解定律可知, 参加反应的碘的分子数等于水的分子数，同电荷量成正比例关系。水量与电荷量有如下等式成立：

W=Q/10.722  ……………………………………………（5）

式中：W -- 样品中水分含量        单位：微克

Q -- 电解电量              单位：毫库仑

微量水分测定仪应用行业：

用于食品、生物、制药、化工、纺织、造纸、包装、环保、气体等行业中

对硝基苯酚钾（potassium para�nitrophenate）

理化性质：红色、黄色晶体混合物，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂，常温下稳定，有酚芳香味。

检测方法：高效液相色谱法，C18柱，水+甲醇为流动相。

用 途：植物生长调节剂，动物生长调节剂，杀菌剂、肥料增效剂。

这个要看你的固定相和流动相究竟用的是什么材料，而且正相色谱和反相色谱的保留时间完全不一样。

一般做测试的时候都会做一个基准实验。就是拿色谱级的纯样品进样，测定保留时间和图谱，然后再进你的测试样，和之前的基准做对比。如果保留时间接近且峰形较好，可以判定是这个峰。

看到你的补充了……DB5没有用过……

一般做法是购买色谱级别的对硝基苯酚样品少量，进样做一个标准峰，这个保留时间肯定对头，再和你的实际样品的谱图做对比，酱紫。另外，现在除了做教学实验，工业和科研上很少有单纯用的气相色谱吧，不实用。现在都是气相色谱-质谱（GC-MS）联用了。如果你手头没有GC-MS联用的仪器的话送样出去做也很便宜的。

看到你的补充了，单标峰太宽绝对是因为进样量太大，尝试减到5微升以下。另外就是如果不行可以考虑换溶剂。

再补充一点，你大概用GC-MS用得不多吧，GC只是用来做分离的，没有人回去计较GC的保留时间，分析峰是什么成分主要靠的是MS。MS都有标准图谱的，直接对比就ok，就可以有结果了。

对硝基酚（英文名称p-nitrophenol）又名4-硝基苯酚（4-nitrophenol），硝基酚共有三个同分异构体，及邻-、间-、对-硝基酚。对硝基酚常温下为无色或淡黄色结晶，能溶于热水、乙醇、乙醚，易溶于苛性碱，在碱金属的碳酸盐溶液中呈黄色。空气中易氧化颜色变深。高温下不稳定，当加热至273℃时开始分解。对硝基酚易燃、有毒，经皮肤吸收，能引起过敏。对人的毒性作用还不完全清楚。动物实验结果：对中枢神经和迷走神经末梢有 *** 作用及抑制作用，还出现高铁血色素症和呼吸困难。硝基苯酚的毒性强度顺序：对位体>间位体>邻位体。

对硝基苯酚分子式为C6H5NO3。

基本介绍中文名 ：对硝基酚 英文名 ：p-Nitrophenol 别称 ：4-硝基苯酚,对硝基苯酚 化学式 ：C6H5NO3 分子量 ：139.11 CAS登录号 ：100-02-7 EINECS登录号 ：202-811-7 熔点 ：112℃ 沸点 ：279℃ 水溶性 ：1.6g/100mL (25℃) 密度 ：1.27g/cm3 外观 ：淡黄色晶体 闪点 ：169℃ 套用 ：染料、医药及农药的中间体，酸碱指示剂 安全性描述 ：S28-28A-45-36/37-16-7 危险性符号 ：Xn,T,F 危险性描述 ：R20/21/22-33-39/23/24/25-23/24/25-11 危险品运输编号 ：UN 1663 6.1/PG 3基本信息,物理性质,制备方法,用途,配置标准,储存条件,应急处置,泄漏应急处理,防护措施,急救措施,风险术语,毒性,环境影响, 基本信息 中文名称：对硝基酚 对硝基酚 中文别名：对硝基苯酚4-硝基苯酚4-硝基-1-羟基苯分子式：C 6 H 5 NO 3 英文别名：p-NitrophenolPhenol,4-nitro-4-Nitrophenol4-Hydroxynitrobenzene CAS号：100-02-7 EINECS 登录号：202-811-7 物理性质 纯品为浅黄色结晶。无味。熔点114-116℃，沸点279℃，闪点169℃，相对密度1.479（20/4℃）。常温下微溶于水（1.6%，25℃），不易随蒸汽挥发。易溶於乙醇、氯仿及乙醚。溶于酸液时，淡黄色逐渐退去，pH3-4之间，几乎无色。溶于碱液时，颜色加深。能升华。 制备方法 由对硝基氯苯经水解、酸化而得。将浓度为137-140g/L的氢氧化钠溶液2320-2370L加入水解锅中，再加入600kg熔融的对硝基氯苯。加热至152℃，锅内压力为0.4MPa，然后停止加热，水解反应放热使温度和压力自然上升至165℃、约0.6MPa。保持3h后取样检查反应终点，反应结束后将水解物冷至120℃。将600L水和50L浓硫酸加到结晶锅中，压入上述水解物，并冷却到50℃左右，加入浓硫酸使刚果红试纸呈紫色，继续冷至30℃，抽滤，离心甩水，得含量90%以上的对硝基酚约500kg，收率92%。另一种制备法是将对硝基氯苯与氢氧化钾在氨中于75℃加热3h，反应后用盐酸酸化，即得对硝基酚。 用途 用作农药、医药、染料等精细化学品的中间体。用于制造非那西丁、扑热息痛、农药1605、显影剂米妥尔、硫化草绿GN、硫化还原黑CL、硫化还原黑CLB、硫化还原蓝RNX、硫化红棕B3R。也用作皮革防霉剂以及酸值指示剂。 对硝基酚 用作染料中间体、医药及农药的原料用作酸碱指示剂和分析试剂，也用于有机合成用作染料、医药及农药的中间体，也用作酸碱指示剂用作皮革防腐剂。对硝基苯酚是一种重要的有机合成原料，可作为有机磷杀虫剂对硫磷、甲基对硫磷的中间体，也可用于合成氟铃脲的中间体 2，6-二氯-4-硝基酚和杀铃脲的中间体 4-三氟甲氧基硝基苯。此外，它还是医药工业和染料工业的重要中间体。用作农药、医药、染料等精细化学品的中间体。用于制造非那西丁、扑热息痛、农药1605、显影剂米妥尔、硫化草绿GN、硫化还原黑CL、硫化还原黑CLB、硫化还原蓝RNX、硫化红棕B3R。也用作皮革防霉剂以及酸值指示剂。酸碱指示剂，pH5.6(无色)-7.6(黄色)，有机合成。用于染料制造，药物制造及用作试剂。校准仪器和装置；评价方法；工作标准；质量保证/质量控制；其他。用于染料制造，药物制造及用作试剂。用于ICP-AES、AAS、AFS、ICP-MS、离子色谱等。滴定分析用标准溶液。 配置标准 对硝基酚指示剂(对硝基苯乙醇溶液)：称取0.50g对硝基酚，溶於乙醇，用乙醇稀释至100mL 储存条件 用塑胶袋或牛皮纸内衬，外用全开口铁桶密封包装，存储与干燥、通风、阴凉场所。采用防爆型照明、通风设施。远离火种热源，禁止使用易产生火花的机械设备和工具。与氧化剂、还原剂、碱类、食品分开存放，严禁混装混运，储区应备有合适的材料收容泄漏物。按危险品管理运输。 应急处置 泄漏应急处理 隔离泄漏污染区，周围设警告标志，建议应急处理人员戴好防毒面具，穿化学防护服。不要直接接触泄漏物，用沙土、干燥石灰或苏打灰混合，用清洁的铲子收集于干燥净洁有盖的容器中，运至废物处理场所。也可以用大量水冲洗，经稀释的洗水放入废水系统。如大量泄漏，收集回收或无害处理后废弃。 ⑴水体被污染的情况主要有：水体沿岸上游污染源的事故排放；陆地事故(如交通运输过程中的翻车事故)发生后经土壤流入水体，也有槽罐直接翻入路边水体的情况。可按以下方法处理： ①查明水体沿岸排放废水的污染源，阻止其继续向水体排污。 ②如果是液体4-硝基(苯)酚的槽车发生交通事故，应设法堵住裂缝，或迅速筑一道土堤拦住液流；如果是在平地，应围绕泄漏地区筑隔离堤；如果泄漏发生在斜坡上，则可沿污染物流动路线，在斜坡的下方筑拦液堤。在某些情况下，在液体流动的下方迅速挖一个坑也可以达到阻载泄漏的污染物的同样效果。 ③在拦液堤或拦液坑内收集到的液体须尽快移到安全密封的容器内操作时采取必要的安全保护措施。 ④已进入水体中的液体或固体4-硝基(苯)酚处理较困难，通常采用适当措施将被污染水体与其它水体隔离之手段，如可在较小的河流上筑坝将其拦住，将被污染的水抽排到其它水体或污水处理厂。 ⑵土壤污染的主要情况有各种高浓度废水(包括液体4-硝基(苯)酚)直接污染土壤，固体4-硝基(苯)酚由于事故倾洒在土壤中。 ①固体4-硝基(苯)酚污染土壤的处理方法较为简单，使用简单工具将其收集至容器中，视情况决定是否要将表层土剥离作焚烧处理。 ②液体4-硝基(苯)酚污染土壤时，应迅速设法制止其流动，包括筑堤、挖坑等措施，以防止污染面扩大或进一步污染水体。 ③最为广泛套用的方法是使用机械清除被污染土壤并在安全区进行处置，如焚烧。 ④如环境不允许大量挖掘和清除土壤时，可使用物理、化学和生物方法消除污染。如对地表乾封闭处理；地下水位高的地方采用注水法使水位上升，收集从地表溢出的水；让土壤保持休闲或通过翻耕以促进苯酚蒸发的自然降解法等等。 废弃物处置方法：用控制焚烧法。要保证充分燃烧，焚烧大量的废料时，焚烧炉排出的氮氧化物要通过洗涤器除去。从废水中回收硝基酚。 防护措施 呼吸系统防护：空气中浓度较高时，佩带防毒面具。紧急事态抢救或逃生时，应该佩带自给式呼吸器。 眼睛防护：戴安全防护眼镜。 防护服：穿紧袖工作服，长统胶鞋。 手防护：戴橡皮手套。 其它：工作现场禁止吸菸、进食和饮水。及时换洗工作服。工作前后不饮酒，用温水洗澡，进行就业前和定期体检。 急救措施 皮肤接触：立即脱去污染的衣着，用肥皂水及清水彻底冲洗。 眼睛接触：立即提起眼睑，用大量流动清水或生理盐水冲洗。 吸入：迅速脱 离现场至空气新鲜处。必要时进行人工呼吸。就医。 食入：患者清醒时立即给饮植物油15～30ml。催吐，尽快彻底洗胃。就医。 灭火方法：雾状水、泡沫、二氧化碳、二粉、砂土。 风险术语 1.吸入、皮肤接触及吞食有害。 2.有累积效应的危险品。 R20吸入有害。 R21与皮肤接触有害。 R23吸入有毒。 R24与皮肤接触有毒。 毒性 对硝基苯酚有毒具有强烈 *** 作用，经皮肤吸收，能引起过敏。急性毒性：小鼠经口LD 50 467mg/kg。大鼠经口LD 50 616 mg/kg。对人的毒性作用还不完全清楚。动物实验结果：对中枢神经和迷走神经末梢有 *** 作用及抑制作用，还出现高铁血色素症和呼吸困难。 环境影响 联合国、国际海事组织和美国等规定为有毒污染物，做出了大气、地面水、水排放、废弃物、食品包装、海洋运输等方面的管理要求与容许限值。德国规定硝基苯酚三种异构体的空气排放标准为20mg/m 3 （一级），150mg/m 3 （二级），300 mg/m 3 （三级）。前苏联规定大气初步安全水平为3μg/ m 3 ，地面水最高容许浓度为0.02mg/L。此外其生产过程中的废弃物对环境的危害不容忽视。