甲醇和冰乙酸3:1配置固定液作用的原理

用于一般植物组织和细胞的固定，组织切片的固定，对人体有害，不可食用，危害大。

Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。Giemsa染液Giemsa原液配制：称Giemsa粉末0.5g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。56℃中保温90～120min。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。使用时按要求用PBS稀释，一般稀释10倍。

a) 用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。

b) 用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。 c) 摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。

d) 然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中，密封保存备用。 2.2：配制20XSSC溶液：

取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g，加入1000ml双蒸水中，用磁力搅拌棒搅拌，使其完全溶解，用滤纸过滤，调pH为5.3，封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。 2.3：配制2XSSC溶液：

用20×SSC和双蒸水，按1:9的比例稀释，调pH为7.0, 封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。

2.4：2×SSC/0.1%NP-40配制 50ml 20×SSC(pH 5.3) 0.5mlNP-40 449.5ml双蒸水 500ml

调pH为7.0 ,封口膜封好，室温保存备用，有效期6个月。 2.5：系列酒精的配制

取无水乙醇28ml和34ml，分别与12ml和6ml双蒸水混合，配成70%和85%的酒精，与无水乙醇共同组成70%，85%，100%的系列酒精，封口膜封好，室温保存备用；另配制一上述系列酒精，封口膜封好，-20℃室温保存备用。 2.6：PBS缓冲液： PBS 1L配方（pH7.4）： 磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，

加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。

2.7：0.075M Kcl低渗液：

钾5.59g加入1000ml去离子水中溶解（或Kcl 2.794g溶入500ml去离子水中），备用，4摄氏度低温保存。 2.8：固定液：

按甲醇（AR）：冰乙酸(AR)=3:1的比例配制细胞固定液，细胞固定液现配现用。 2.9:1M Hcl：

取.9ml浓Hcl加去离子到100ml混匀，4℃保存备用。保存1个月。

2.10：0.08mg/ml胃蛋白酶工作液：

A：取40mg胃蛋白酶，放入1.5MLEP管中，加1ml去离子水溶解，分装到10个200ul离心管中。

B：次使用时，在考普林瓶中加50ml去离子水，加入500ul1M Hcl，加入一管分装的胃蛋白酶溶液（100ul）。 2.11:200ug/mlPK工作液：a PK储存液（20mg/ml）：称取0.1g蛋白酶K干粉溶于2XSSC（PH=7.0）溶液中，轻轻摇动，直至PK完全溶解，不要漩涡混匀。-20℃保存。b 蛋白酶K工作液（200ug/ml）：取0.4mlPK储存液溶于40ml2XSSC（PH7.0）溶液中。

是最常用的细胞学固定液，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋沉淀后，能溶于水，因此，经95%酒精固定的涂片，染色前没有必要经过水洗。此固定液适用于苏木素-伊红染色和巴氏染色。固定时间根据标本的不同，时间也不尽相同，一般标本固定时间为15-30分钟，痰标本需要更长一些时间。经过95%酒精固定的标本，细胞核保存较好，结构清晰，颜色鲜艳。如果在95%酒精液内加入聚乙二醇更佳，可以保护细胞免受空气干燥后的人工假象。

2、乙醚酒精液（1：1）：

其效果与95%酒精相似，但由于乙醚有很强的吸水性和特有的刺激性气味，容易挥发，长期低浓度吸入，有头痛、头晕、疲倦、嗜睡、蛋白尿、红细胞增多等不良反应。长期皮肤接触，可发生皮肤干燥、皲裂。所以现在已经逐渐被95%酒精所代替。

3、甲醇：

　固定时间快，细胞收缩小，细胞核保存较好，结构清晰，染色鲜艳。常作为穿刺细胞涂片的固定液。对抗原保存较好，可作为细胞涂片免疫组化的固定液。缺点是具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对中枢神经有一定的伤害。甲醇的毒性与其代谢产物甲醛和甲酸的蓄积有关。以前认为毒性作用主要为甲醛所致, 甲醛能抑制视网膜的氧化磷酸化过程,使膜内不能合成ATP,细胞发生变性,最后引起视神经萎缩。近年研究表明,甲醛很快代谢成甲酸,急性中毒引起的代谢性酸中毒和眼部损害，主要与甲酸含量相关。

4、冰醋酸：5%水溶液可作固定用。不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白。渗透性强，固定快，能使红细胞膨胀而破碎，常与其它液体配合使用。

4、无水酒精：

　对糖原保存较好，容易使细胞收缩，其性能与95%酒精相似，很少单独使用，一般只用于糖原的固定。

5、丙酮：

　为易挥发的无色液体，有刺激性气体。可使蛋白质沉淀，渗透性强，细胞收缩严重，对核的固定差。很少用于常规细胞学的固定。广泛用于酶组织化学中的各种酶的固定，也有人用于抗原的保存，作为细胞涂片免疫组化的固定液。丙酮具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对肝、肾及中枢神经有一定的伤害。

6、Carnoy 固定液

配方：无水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。

Carnoy液能固定胞浆和胞核，尤其适宜于染色体等。常用于糖原及尼氏体的固定，由于冰醋酸能溶解红细胞并可防止细胞由酒精引起的过渡收缩，对固定有血的标本和显示DNA、RNA效果很好。缺点是每次固定后固定液内有大量的红细胞碎片和细胞脱落，必须及时过滤，否则容易造成污染。其次，氯仿具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对肝、肾及中枢神经有一定的伤害。

7、10%中性缓冲甲醛液：

固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。

固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）4g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）13g。

10%中性缓冲甲醛液对大多数抗原保存较好，是免疫组织化学最常用的固定液，组织穿透性好，组织收缩较小。但此液体不适合固定湿固定的涂片，可作为干固定涂片和细胞蜡块的固定液。甲醛也具有挥发性和毒性。大量吸入会出现呼吸道的严重刺激和水肿、眼刺痛、头痛，也可发生支气管哮喘。经常吸入少量甲醛，能引起慢性中毒，出现粘膜充血、皮肤刺激症、过敏性皮炎、指甲角化和脆弱、甲床指端疼痛等。全身症状有头痛、乏力、胃纳差、心悸、失眠、体重减轻以及植物神经紊乱等。