哈茨木霉（T.harzianum）

本书作者团队利用鸟枪法对两株生防木霉菌T.harzianum和T.gamsii的基因组进行了测序，并分析了有关基因结构。

其中，T.harzianum测序深度为132倍，共得到28336787个reads，利用velvet和bow-tie等软件将这些数据组装成1346个contig和99个scaffold，大小约为42.8Mb，GC含量为48.5%。采用RepeatScout软件对基因组进行分析，共从中发现101个重复单元，最小的为50 bp，最大的为859 bp。使用Genemark软件预测基因，共挑选出13781个基因，预测基因的GC含量为50.3%，平均长度为1474 bp。将13781个预测基因的编码蛋白，通过BLASTP，分别与NR、UNIPORT和KEGG 3个数据库进行比对，条件设为E value ＜1 e-3，分别有13407、10990和4451个蛋白能找到匹配信息。利用SignalP和TMHMM等软件，对所有编码蛋白进行亚细胞定位预测，结果表明，在基因组中共编码890个胞外蛋白、2648个跨膜蛋白和10243个胞内蛋白。

T.gamsii测序深度为132倍，共得到24570069个reads，利用velvet和bowtie等软件将这些数据组装成 949个 contig和1346个 scaffold，大小约为37.1Mb，GC 含量为49.7%。采用RepeatScout软件对基因组进行分析，共从中发现72个重复单元，最小为3336 bp，最大为859 bp。使用Genemark软件预测基因，共挑选出11025个基因，预测基因的GC 含量为55.7%，平均长度为1525 bp。将11025个预测基因的编码蛋白，通过BLASTP，分别与NR，UNIPORT和KEGG 这3个数据库进行比对，条件设为E value ＜1 e-3，分别有10755，7413和3263个蛋白能找到匹配信息。利用SignalP和TMHMM等软件，对所有编码蛋白进行亚细胞定位预测，结果表明，在基因组中共编码793个胞外蛋白、2034个跨膜蛋白和8198个胞内蛋白。

木霉中蛋白质是细胞壁的主要组分之一，共220种细胞壁相关蛋白被分别从里氏木霉（T.reesei）合成并分泌蛋白的菌丝体和蛋白分泌水平低的菌丝体中提取并分离（Lim et al.，2001）。并发现在这两种菌丝体中最丰富的蛋白为HEX1，是丝状真菌特异结构伏鲁宁体（Woronin Body）的特异蛋白。其他分离的蛋白还包括液泡蛋白酶A、烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、转醛醇酶、蛋白质二硫键异构酶、线粒体外膜孔蛋白、二磷酸激酶和翻译延伸因子β等（Lim et al.，2001）。

木霉是一种土传丝状真菌，具有生物防治特性。哈茨木霉（T.harzianum）可以防止多种作物的病原菌生长，可以替代目前市场上的化学试剂作为生物杀菌剂。目前蛋白质组学已被用于木霉中生物防治相关蛋白质的分离和鉴定（Grinyer et al.，2004a）。Grinyer等（2004b）开发了在酸性条件下提取蛋白质的方法，这种方法增加了碱性蛋白质的溶解性，消除了微生物的酸性细胞壁假象。这种方法结合蛋白酶抑制剂制备的哈茨木霉（T.harzianum）样品，数百蛋白被提取并通过双向电泳被分离。同时，利用蛋白质组方法分离并鉴定了哈茨木霉（T.harzianum）对细胞功能至关重要的线粒体中的蛋白质。

不同木霉菌株蛋白含量和种类存在差异，Adav等（2013）对在四种（葡萄糖、纤维素、淀粉、淀粉和纤维素混合物）不同碳源中生长的里氏木霉（T.reesei）QM6a和Rut-C30突变株共8个样本的蛋白丰度利用复样本（PAMUS）的蛋白质丰度测定方法进行了测定，结果显示，Rut-C30内纤维素水解酶含量较高，具有很高的纤维素水解能力。基于色谱方法和双向电泳的方法，对里氏木霉（T.reesei）中蛋白颗粒进行了鉴定，通过双向电泳（2DE）分离的102个点利用跨物种识别（CSI）质谱或来自里氏木霉（T.reesei）测序项目的蛋白数据库的分析发现其中有30个为20S颗粒，8个为19S的粒子。另外，对蛋白酶体相互作用的蛋白质，以及一些非蛋白酶相关蛋白进行了鉴定（Grinyer et al.，2007；Kautto et al.，2009）。

木霉菌还具有复杂的胞外蛋白水解系统，可以分泌大量胞外蛋白酶，是细胞壁降解酶的重要组分。胞外蛋白酶通过营养竞争，协同降解植物病原菌细胞壁和根结线虫体壁，参与木霉的生物防治（陈蕾蕾等，2010）。目前，分析哈茨木霉（T.harzianum）、黄绿木霉（T.aureoviride）、绿色木霉（T.viride）的胞外蛋白酶谱，发现这3种木霉都可以分泌胰蛋白酶类似蛋白酶和胰凝乳蛋白酶类似蛋白酶。

木霉还可以分泌一些作为毒素或信号分子的蛋白质。三种木霉——里氏木霉（T.reesei）、绿木霉（T.virens）、深绿木霉（T.atroviride）的基因组和蛋白质序列已由美国能源部联合基因协会（DOE JGI）联合基因组研究所测序并进行标注（Grigoriev et al.，2011）。木霉蛋白质的分泌组学也通过硅片工具的蛋白序列分析进行了预测（例如，Petersen et al.，2011；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），通过N-末端含有向内质网转移的用于翻译后加工和分泌的信号序列筛选分泌蛋白。预测的木霉分泌蛋白包括含有信号肽的蛋白、胞外蛋白、糖基水解酶、蛋白酶、氧化酶、小的富含半胱氨酸分泌蛋白和一些功能未知蛋白及其他蛋白等，通过DOE JGI测序的木霉基因组中分析获得的里氏木霉（T.reesei）、绿木霉（T.virens）、深绿木霉（T.atroviride）三种木霉的分泌蛋白相关的基因如表5.1所示（Druzhinina et al.，2012）。

木霉不能降解木质素，因此，在生长环境中其主要降解底物为多糖。基于此，糖基水解酶占木霉分泌组比例大约为15%，包括了200个预测的碳水化合物活性酶（CAZymes）中的122个（Martinez et al.，2008）。

木霉中的蛋白酶是真菌中最大蛋白组之一（Rawlings et al.，2012）。预测里氏木霉（T.reesei）中总的蛋白酶数目为383，占所有预测蛋白质编码基因的4.2%；深绿木霉（T.atroviride）中数目为445，占所有预测蛋白质编码基因的3.75%；绿木霉（T.virens）中数目为479，占所有预测蛋白质编码基因的3.85%。而且20%的预测蛋白酶具有信号肽并因此进入分泌途径。主要包括天冬酰胺蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、枯草溶菌素类蛋白酶、二肽和三肽基肽酶（表5.2）（Druzhinina et al.，2012）。

表5.1 木霉中预测的分泌组的组成

（Druzhinina et al.，2012）

表5.2 木霉分泌组中蛋白水解酶

木霉分泌组中还包含了大量的细胞色素P450蛋白。它们是一类序列相关的血红素加氧酶，这类酶在很多生物中被发现，其功能涉及从原核生物、低等真核生物和植物的碳源降解和代谢产物描述到昆虫、哺乳动物包括人的外源性化合物解毒（Kelly et al.，2006；Singh et al.，2011）。然而，它们最重要的作用是有害物质的细胞外失活（Roelofs et al.，2012；Syed et al.，2012）。

最后，木霉分泌蛋白还含有一类小的富含半胱氨酸分泌蛋白（SSCPs），是最大分泌蛋白家族之一。它们被分离的标准为氨基酸残基不多于300个并且含有4个或更多的半胱氨酸残基（Martin et al.，2008；Kubicek et al.，2011）。序列相似性搜索工具和系统进化分析将这一家族蛋白分为四组：①疏水和疏水类似蛋白；②诱导子类似蛋白；③类MR-SP1（MAP激酶抑制分泌蛋白1）蛋白，该蛋白分子量为16-kDa，在绿木霉（T.virens）Δtmk1（MAPK）突变体中强烈高表达并且具有保守的四-半胱氨酸基序C-X29-C［P/G］C-X31-C；④没有归属于任何功能类别的SSCPs（Kubicek et al.，2011）。

疏水蛋白是SSCPs家族中被研究最多的蛋白，其特点是含有8个位点保守的半胱氨酸残基，其中4个成对存在。它们存在于菌丝和分生孢子的细胞壁外表面，介导真菌和环境的相互作用。由于疏水蛋白可以改变表面属性，而且既无细胞毒性也无强免疫原性，可以用于果蔬保鲜（Wosten，2001），可促进土壤中污染物的降解，还可应用在石油泄漏后回收石油的过程中（Scholtmeijer et al.，2001），可以作为蛋白和细胞固定化的媒介，将特定分子固定在膜的特定面（Palomo et al.，2003）。木霉中已被发现不止一种疏水蛋白，比如里氏木霉（T.reesei）的 HFB系列包括HFBI和HFBII（Nakari-Setälä et al.，1997；Linder et al.，2001；Askolin et al.，2001，2005）（详见第16章）。根据其在溶剂中的溶解度不同和保守半胱氨酸之间的疏水性分布和间距，疏水蛋白可被分为两类（Ⅰ类和Ⅱ类）。木霉中含有最丰富的Ⅱ类疏水蛋白（Kubicek et al.，2008a）。深绿木霉（T.atroviride）和绿木霉（T.virens）中也存在Ⅰ类疏水蛋白，但里氏木霉（T.reesei）中不存在，但这两种木霉中的Ⅰ类疏水蛋白与其他真菌中的Ⅰ类疏水蛋白在许多方面存在差异，并在子囊菌系统发育分析中形成独立的分支（Seidl-Seiboth et al.，2011）。

第二类SSCPs家族蛋白为新兴的诱导子类似蛋白。其中，绿木霉（T.virens）中与深绿木霉（T.atroviride）EPL1（Seidl et al.，2006）同源的基因Sm1已被详细研究，它可以诱导棉花的系统性抗病反应，并通过茉莉酸途径诱导玉米的系统抗病性（Djonovic et al.，2007a）。因此，这类SSCPs蛋白有助于木霉和植物的相互作用。事实上，SSCPs的这一作用在一些植物病原真菌中已有报道（Rep，2005）。

木霉中最大的也是木霉特有的一组SSCPs——第四类SSCPs的功能目前还未知。然而有趣的是，这一组的一些成员包含CFEM域或糖基化保守序列（GPI锚定位点）这些基因中的保守性表明它们可能编码在与其他生物的相互作用中起重要的作用的细胞表面蛋白（Pérez et al.，2011）。

另一方面，木霉菌也被用来生产小线形抗菌肽段，称抗菌肽（Rebuffat et al.，1995）。由绿木霉（T.virens）产生的抗菌肽段丙甲菌素（Cafiso，1994；Leitgeb et al.，2007），是疏水性的，长20个残基，含有丰富的a-氨基异丁酸（Meyer et al.，1967）。它的疏水性，使其能够被插入生物膜形成非特异的跨膜离子通道，并且对周围膜脂没有干扰（Bertelsen et al.，2012）。插入后，细胞渗漏，并最终裂解（Jen et al.，1987）。大多数抗菌肽为11氨基酸，目前，在绿木霉（T.virens）、里氏木霉（T.reesei）和深绿木霉（T.atroviride）中发现14-氨基酸残基的抗菌肽，并发现了抗菌肽合成酶（非核糖体肽合成酶）（Mukher-jee et al.，2011；Degenkolb et al.，2012）。丝裂原活化蛋白（MAP）激酶调节的形态和遗传过程，确定细胞的命运。绿木霉（T.virens）中编码MAP激酶的基因为tvk1，通过液体培养的野生型和Dtvk1 间cDNA消减杂交间，5个编码疏水类似蛋白的基因（Tv-hfb1，Tv-srh1，Tv-cfth1，Tv-qid3和Tv-ccg14/TvSm1）和两个编码细胞壁蛋白的基因（Tv-qid74和Tv-hfb3）被分离鉴定（Mendoza-Mendoza et al.，2007）。

木霉能合成一些裂解酶，包括甘露糖酶、脂肪酶、磷酸酶等（Elad et al.，1983；Labudova et al.，1988）。

β-D-1，4-甘露聚糖酶是一类能够水解含有β-D-1，4-糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖的内切水解酶。它属于半纤维素酶类，在造纸工业、食品工业和农业中有广泛的应用。里氏木霉Rut C-30所产生的甘露聚糖酶蛋白有5种，其中活性最高的两种酶已经获得纯化（Arisan-Atac et al.，1993；Stalbrand et al.，1993）。后来又发现，这两种甘露聚糖酶同属于基因man1的产物，该酶具有纤维素结合域，属于糖苷水解酶第五家族（Stalbrand et al.，1995）。里氏木霉的甘露聚糖酶基因在酿酒酵母中得到表达，但酶活力非常低，例如酿酒酵母表达里氏木霉man1，活力仅为1.3×10-2IU/mL（Aparicio et al.，2002）。韦跃华等（2005）利用毕赤酵母成功表达木霉甘露聚糖酶基因man1，获得了较高分泌表达的甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株Gpmf25，发酵120h，重组甘露聚糖酶活力可达12.5IU/mL，比酿酒酵母表达的里氏木霉甘露聚糖酶的活力高出近 1000倍。Agrawal等（2011）将里氏木霉β-甘露聚糖酶的基因转入烟草中，促进了木质素生物质的水解。

脂肪酶（Lipase）是分解脂肪的酶，是最早研究的酶类之一。它可将甘油三酯分解成脂肪酸和甘油或进行其逆反应（张树政，1984）。微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的主要来源。Götz等（1985）完成了猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中脂肪酶基因的克隆和序列测定，此后不同来源的脂肪酶的基因序列和蛋白质一级结构也被逐步阐明。随着基因工程和蛋白质工程的发展，脂肪酶的基因表达调控、蛋白质分子的改造也有了新的进展。1990年真菌脂肪酶Rhizomucor miehei li-pase（RML）和人胰脂肪酶两种不同脂肪酶的X-射线衍射晶体结构的报道，让脂肪酶研究进入结构和功能研究的新阶段。细菌、酵母、霉菌均筛选到较高酶活的菌株（彭立凤，1999）。隋聪颖等（2008）筛选到4株产脂肪酶的木霉菌株，编号为：153-1，13-2，30425，西1-1，根据菌株的菌落形态、显微镜观察和ITSrDNA 序列测定，鉴定该4菌株分别为哈茨木霉（T.harzianum）、长枝木霉（T.longibrachiatum）、哈茨木霉（T.harzianum）、长枝木霉（T.longibrachiatum），其酶活分别为4.79U/mL，2.41U/mL，5.32U/mL，3.30U/mL。Kashmiri等（2006）筛选了一株产脂肪酶的绿色木霉，在培养48h后，其产生的胞外脂肪酶活力为7.3U/mL，胞内脂肪酶活力则达到了320U/g菌丝体。Ulker等（2011）在哈茨木霉IDM14D中分离并鉴定了脂肪酶的活性。该脂肪酶在pH为8.0～10.0的范围内能保持稳定，Ca2+和Mn2+能够增强它的活性，但是其他矿物离子对他的活性没有明显影响。

磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。蛋白磷酸酶与蛋白激酶共同调控着细胞内蛋白质可逆磷酸化过程，参与调控多种细胞生物学事件，包括细胞分化、信号转导等（Stefan et al.，1999）。随着哈茨木霉菌丝体时期的cDNA文库的完成，功能基因的验证成为首要任务。经过测序获得3298条成功EST序列（Liu et al.，2007）。刘燕等（2008）从哈茨木霉cDNA文库中克隆到丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的全长cDNA序列（PP2A），并成功构建到原核表达载体，在大肠杆菌BL21 中高效表达可溶性蛋白。Aseri等（2009）对曲霉属、青霉属、木霉属和假散囊菌属的四种产磷酸酶菌株进行了分析和比较，发现与其他菌株相比，哈茨木霉产的磷酸酶的活性和裂解能力最强。Leitao等（2010）从哈茨木霉中分离纯化一种酸性磷酸酶，分子量为57.8kDa，最适温度和最适 pH 分别为55℃和4.8。该酶的活性能够被无机磷酸盐部分抑制，能够被钨酸盐完全抑制。

由于内酯酶在食品工业上的重要性，人们也研究了木霉菌株的内酯酶。内酯酶是合成一个完整纤维素酶系统的组成部分，它可以水解内酯化合物的内酯键产生羟基酸。从商品化的里氏木霉制剂中纯化一个内酯酶。这个酶能够在有1，5-葡萄糖酸内脂和纤维二糖酸内酯存在时表现活性（Bruchmann et al.，1987）。

蛋白质是由氨基酸经过缩合形成肽链，肽链经过不同形式折叠形成的。Wilhite等（2001）从绿木霉（T.virens）中克隆了一个5056 bp的编码肽合成酶（PSY1）的cDNA片段。基于EST数据库，从哈茨木霉（T.harzianum）CECT2413中分离获得一个编码的PTR家族二/三肽转运体的基因ThPTR2。分析ThPTR2蛋白质序列发现，其具有PTR转运体的保守基序和12个跨膜域。此外，ThPTR2 转化长枝木霉（T.longibrachiatum）T52，过表达ThPTR2，证明了该基因在肽转运中的作用。ThPTR2首次被实验证实为丝状真菌中PTR家族转运蛋白（Vizcaínoa et al.，2006）。蛋白质水解产生不同的氨基酸，Sanz等（2004）也利用18株木霉对5种公认的同工酶β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.39，EC3.2.1.58）、β-1，6-葡聚糖酶（EC3.2.1.75）、纤维素（EC3.2.1.4，EC3.2.1.21，EC3.2.1.91）、几丁质酶（EC3.2.1.30，EC3.2.1.52）和蛋白酶（EC3.4.11，EC3.4.13-19，EC 3.4.21-24，EC3.4.99）的活性进行了多态性分析。唐雯等（2008）利用生物信息学方法对里氏木霉（T.reesei）分泌组进行分析，其中，在188条水解酶序列中，属于蛋白水解酶的序列有33条，包括羧基肽酶（3.4%）、氨基肽酶（1.7%）和天冬氨酰蛋白酶（4.76%）等；在功能未知的水解酶中，发现具有潜在蛋白水解酶功能的序列9条（精氨酸酶、丝氨酸酶和金属钛酶）。

上文提到，在木霉中发现了大量的胞外蛋白水解酶，进行了蛋白质水解。Geremia等（1993）在木霉中鉴定了一个基本的蛋白酶（PRB1），蛋白酶经纯化和生化特征分析发现是一种31kDa大小，等电点为9.2的丝氨酸蛋白酶。Dunaevsky等（2000）确定哈茨木霉（T.harzianum）分泌的胞外蛋白酶是一种对Z-丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-pNa-枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的底物具有活性的蛋白酶。Kredics等（2004）对6个长枝木霉（T.longibrachiatum）菌株的胞外蛋白水解酶分析发现，其水解酶具有类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和类凝乳弹性蛋白酶的蛋白酶活性。一个编码细胞外天冬氨酰蛋白酶的基因papA从哈茨木霉（T.harzianum）CECT 2413中被分离鉴定。从过表达哈茨木霉 CECT 2413papA的转化酵母培养物中提取的蛋白酶活性相比野生型增加了四倍（Delgado-Jarana et al.，2002）。随后，新的天冬氨酰蛋白酶在哈茨木霉（T.harzianum）（Suáreza et al.，2005；Liu et al.，2007）、棘孢木霉（T.asperellum）（Yang et al.，2013）中被分离获得。里氏木霉（T.reesei）天冬氨酸蛋白酶（TrAsP）的晶体结构也被研究，TrAsP的三维结构与胃蛋白酶样家族的其他成员结构类似。每个分子都折叠成一个N-末端和C-末段相同大小的β-折叠片的结构（Nascimentoa et al.，2008）。同时，丝氨酸蛋白酶也从哈茨木霉（T.harzianum）（Suarez et al.，2004；Liu et al.，2013）、绿木霉（T.virens）（Pozo et al.，2004）、假康宁木霉（T.pseudokoningii）（Chen et al.，2009）中被分离，编码这些水解酶的基因被克隆。甲丝氨酸肽链内切酶已从绿色木霉（T.viride）培养物滤液中被纯化。确定的等电点为7.3。研究发现，类胰蛋白酶为绿色木霉（T.viride）中含有的特异性蛋白酶（Uchikoba et al.，2005）。Kredics等（2008）从 11 株木霉中筛选深绿木霉（T.atroviride）T221具有耐寒性，在含酪蛋白培养基上培养的深绿木霉（T.atroviride）T221培养液中分离获得一种分子量为24kDa的酶，该酶等电点为7.3，最佳 pH 值为6.2，反应最适温度为25℃并具有低温稳定性，是一个真正的冷适应性酶。底物特异性的数据表明，这种酶是一种优先作用于 Arg 或 Lys的 P1 位置的蛋白酶（Kredics et al.，2008）。Mattinen等（2008）在里氏木霉（T.reesei）中分离一种新的酪氨酸酶（TrTyr），具有催化氧化、氧化交联的牛血清白蛋白（BSA）和β-酪蛋白肽链中的L-酪氨酸和酪氨酸长链的活性。Dixit等（2011a）从绿木霉（T.virens）中克隆获得一个谷胱甘肽转移酶基因TvGST，TvGST转基因植物对重金属镉表现出更强的耐受性（Dixit et al.，2011）。

Saloheimo等（1999）在里氏木霉（T.reesei）中分离一个编码蛋白质二硫键异构酶的基因pdi1。里氏木霉（T.reesei）pdi1的 mRNA的水平受碳源调控，在含葡萄糖培养基中表达量最低，在含可以诱导胞外酶基因表达的碳源的培养基上表达量最高（Saloheimo et al.，1999）。

对木霉核型的研究集中于20世纪90年代，研究者利用分子生物学手段对几种典型木霉的染色体条带数量、大小及基因的定位进行了分析。另外，有学者对哈茨木霉（T.harzianum）中细胞核在不同位置及生长阶段的形态特征进行了详细报道。

Mantyla等（1992）利用CHEF（Contour-clamped Homogeneous Electric Field）凝胶电泳方法对长枝木霉（T.longibrachiatum）进行了核型分类研究，发现野生型T.longibrachiatum菌株QM6a具有7条染色体电泳条带，大小为2.8～6.9Mb，估计整个基因组的大小为33Mb，研究还发现纤维素酶编码基因cbh1，cbh2和egl2位于同一个连锁群（野生型的染色体Ⅱ上），而内切葡聚糖酶编码基因egl1则位于另外一条染色体上（野生型的染色体Ⅵ上）。Carter等（1992）利用脉冲场凝胶电泳技术研究了里氏木霉（T.reesei）菌株QM6a及其几个衍生菌株的染色体，也发现菌株都具有7条染色体，全基因组大小为33Mb；每条染色体的大小为3.2～6.2Mb。Herrera-Estrella等（1993）利用CHEF和旋转电极电泳技术研究了T.harzianum，T.viride和T.reesei三种木霉的染色体及相关基因的定位。在T.harzianum和T.reesei中发现了6条染色体带，在T.viride中发现了5条。这些染色体的大小为2.2～7.4Mb，估计全基因组大小在31～39Mb之间。Hayes等（1994）发展了木霉核型分类技术，能够从活的原生质体中分离并观察完整的染色体。利用该技术研究了T.harzianum菌株T12 his-2和T95 lys-1，以及两者的原生质体原养型融合子1295-22，发现T95 lys-1有4条染色体，大小为2.2～5.4Mb，而菌株T12 his-2和1295-22则只有两条染色体，三个菌株各自的最大染色体相似，大小为5.4Mb左右。Go-mez等（1997）利用CHEF凝胶电泳方法研究了T.harzianum菌株的遗传多样性及菌株之间的营养体相容性，发现全基因组大小为29.6～56.1Mb。同一核型之间能产生菌丝融合。研究者利用脉冲场电泳技术发现5个种类的木霉（含钩状木霉T.hamatum）都含有6条染色体，大小为3.7～7.7Mb，全基因组大小为30.5～35.8Mb，还发现42 KDa几丁质酶编码基因位于不同的木霉属染色体位置上（Csaba et al.，1996；杨合同，2009）。

研究表明，几乎所有的木霉细胞是多核的（Harman，1993），Kubicek等（1998）利用吉姆萨（Giemsa）染色法（Shirane et al.，1989）观察了已市场化的生防木霉T.harzianum菌株1295-22的菌体内细胞核，并对其核内特定信息进行报道。研究中，为了取得良好的细胞核和菌丝染色特征差异，对不同的样品采用了多样化的染色时间（图9.1）。染色结果显示，细胞核的大小和数量在菌体内的不同部分有显著的不同。研究者在对生长于葡萄糖琼脂培养基上成熟菌丝的边缘及分生孢子刚刚开始形成的区域进行了重新测试，观察发现菌丝具有明显大小不同的尺寸，较大的大约有直径10μm，而较小的只有大约3μm（图9.1 A，B），还有几个菌丝直径大小介于两者之间为5μm。这种菌丝的多样性之前在木霉中描述过，其中只有小菌丝涉及重寄生。这些菌丝都是多核的：较小的菌丝每个细胞含有5～6个细胞核，而较大的细胞有非常多的细胞核，有的细胞会超过50个（图9.1A，B）。此外，不同位置的细胞核组具有不同的外观。有一些呈圆形，而其他的，大多是组合在一起的，外形显著拉长（图9.1C）。这些拉长的细胞核均面向菌丝的长轴，并排列成V字形。在其他真菌中也存在这样被拉长的细胞核，是由于细胞骨架分子的行动导致运动型细胞核迁移到其他地方（Aist et al.，1967），在哈茨木霉中很可能是同样的情况（图9.1C）。其中，瓶梗柄含有较少密集型核子簇，只在支撑菌丝的交界处和瓶梗的最低端有一到两个。分生孢子形成的烧瓶状细胞中包含一个单一的细胞核（图9.1D），显然是为了给新形成的孢子提供一个单一的细胞核。新生的分生孢子大多是单核的（图9.1E），虽然比较成熟的分生孢子可能是多核的（Stasz et al.，1988b），然而，这些细胞内可以看到细胞核有丝分裂，而且有丝分裂后的分生孢子会进行细胞分裂生成两个分生孢子（图9.1E）。这种细胞分裂并没有在木霉或者其他真菌分生孢子中被描述过。研究还观察到萌发孢子形成了新的菌丝，这些新形成的菌丝都是直径较小和胞内多核的，每个细胞都有两到三个细胞核（图9.1F）。然而，在菌丝尖端细胞核的数量要大于菌丝链的其余部分，而且根据它们的大小和染色的密度，菌丝尖似乎具有多个细胞核（图9.1F）。

木霉与真菌的关系主要表现在木霉对植物病原真菌的防治作用上。木霉至少对腐霉菌、镰刀菌、丝核菌、核盘菌、齐整小核菌等18个属29种重要植物病原真菌有拮抗作用（Weindling，1932；李淼等，2009）。目前已将木霉广泛用于防治多种由真菌引起的植物病害，特别是对立枯丝核菌、镰刀菌、齐整小核菌、疫霉菌、腐霉菌、链格孢子菌等引起的幼苗立枯病、猝倒病，白绢病、疫霉病等土传病害具有较好的防治效果（李卫平等，2000；郭润芳等，2002）。另外，木霉对食用真菌具有侵染作用，是蘑菇栽培和菌种生产过程中的主要病原真菌。

2.8.1.1 木霉与植物病原菌的关系

木霉与其他真菌的竞争性相互作用情况比较复杂，包括竞争作用、重寄生作用、水解酶的作用、抗生作用及协同拮抗作用等。

（1）竞争作用。包括空间位点竞争和营养竞争。木霉的生长速度远比一般土传病原真菌快，是空间和营养源的有力竞争者。但许多环境因素，例如土壤pH值或对木霉有毒害作用的化学杀菌剂均能影响木霉的竞争能力。用适量的土壤消毒剂CS2能使假蜜环菌活力变弱，提高木霉的竞争优势而成为假蜜环菌的拮抗剂。木霉的竞争能力受土壤性质的影响。Hubbard等（1983）研究发现，土壤中含有低剂量的铁离子或吸附铁的荧光假单孢菌（产生含铁细胞）能降低哈茨木霉的生物防治活性。Sivan等（1989）的研究证明，木霉的竞争作用在镰刀菌病害的防治中有重要作用（Sivan et al.，1989），Ahamad等（1987，1988）也研究得出相类似结论。

（2）重寄生作用。重寄生作用是寄生性真菌拮抗病原真菌的主要机制，它不是一个偶然现象，而是包含了对病原菌的趋向（target location）、识别（recognition）、接触与穿透（contact and penetration）、营养获得（nutrient acquisition）等一系列连续步骤的复杂过程。趋向：多数学者认为重寄生菌在到达寄主真菌之前，其菌丝的生长方向、孢子的萌发及芽管的伸长存在向性反应，即趋向性。Lutchmeah等（1984）认为这种趋向性是重寄生菌对寄主真菌菌丝或菌核向外分泌的化学刺激物的反应。Elad等（1983b）认为，重寄生菌孢子萌发和芽管生长的趋向性，是由寄主真菌分泌的多种专一性物质刺激作用的结果，这些物质可能是非挥发、耐热、高分子量的蛋白质，且浓度梯度方向正好决定了重寄生菌的生长方向。但也有学者认为，重寄生菌并不存在这样的趋向性，重寄生菌到达寄主真菌的过程和方向是随机的。识别：重寄生菌到达寄主真菌后，两者发生识别反应。研究表明，重寄生菌与其寄主真菌之间的识别和寄主真菌细胞表面的凝集素（agglutinin）有关，重寄生菌细胞壁上的糖残基可以与寄主真菌表面的凝集素进行专一性结合以达到相互识别的目的。Elad等（1983 b）研究了死体营养型重寄生菌哈茨木霉（T.harzianum）和钩状木霉（T.hamatum）与其寄主真菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的相互作用过程，首次证明了寄主真菌细胞表面的凝集素在识别中所起的重要作用。该研究还发现，收集制备的寄主真菌细胞表面的凝集素可以使B型大肠杆菌凝集，但在反应体系中加入20 nmol/L的墨角藻糖溶液，可显著抑制凝集反应。对墨角多糖有特异性结合反应的凝集素，也可以和哈茨木霉的菌丝和孢子结合，说明哈茨木霉的细胞壁上存在墨角多糖。之后Barak等（1985）再次以哈茨木霉和钩状木霉为研究对象，利用分子筛层析法纯化了另一寄主真菌齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）细胞表面的凝集素，证明这种凝集素是一种糖蛋白（glycoprotein），其中的蛋白残基和糖残基都可能参与了凝集反应。Inbar等（1992，1995）曾将纯化的齐整小核菌的凝集素结合到尼龙纤维上，结果发现哈茨木霉可以特异性地缠绕在尼龙纤维上，也进一步证明了凝集素在识别中的作用。接触、穿透及营养获取：重寄生菌与寄主真菌一旦相互识别，在外部形态和内部结构上均会发生不同形式的变化。重寄生菌的表现通常为：菌丝在寄主真菌上迅速生长，产生分枝，缠绕寄主真菌的菌丝，但并不穿透寄主菌丝；菌丝穿透寄主真菌的菌丝，并在寄主菌丝的细胞内伸长；产生附着胞后再产生侵染丝，侵染丝穿透并进入寄主真菌的细胞内，然后发育形成吸器，建立起寄生关系。寄主真菌由于受木霉重寄生作用的影响，表现为菌丝生长停止、菌丝变形、干瘪甚至消解，菌丝细胞的细胞质凝结、液泡化或消失，甚至发生原生质团溢出等现象。据不完全统计，木霉至少对18个属的29种病原真菌在体外或在活体上表现有拮抗作用。一种木霉或一个木霉菌株往往至少对两种以上病原真菌有拮抗作用（徐同等，1990）。在木霉与病原菌互作的过程中，寄主菌丝分泌一些物质使木霉趋向寄主真菌生长，一旦寄主被木霉寄生物所识别，就会建立寄生关系。Müller等（1981）和Elad等（1983a）已证明寄主真菌细胞表面的特定外源凝集素在识别中起一定作用，决定了木霉与寄主真菌之间的转化关系。目前，已有凝集素得到纯化的报道。木霉和寄主真菌识别后，木霉菌丝沿寄主菌丝平行生长和螺旋状缠绕生长，并产生附着胞状分枝吸附于寄主菌丝上，通过分泌胞外酶溶解细胞壁，穿透寄主菌丝，吸取营养。Elad的实验证实了这种寄生现象，并且发现移除寄生菌丝后，在病原菌丝上有溶解位点和穿入孔。大多数人认为是因为拮抗木霉菌在重寄生过程中产生了一系列降解病原菌细胞壁的水解酶，如几丁质酶、葡聚糖酶。

（3）水解酶的作用。木霉在侵染、穿透寄主真菌的过程中，能够产生真菌细胞壁降解酶，包括几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶等，这些酶类对重寄生作用的发生及后续的发展发挥直接作用，其中又以几丁质酶和葡聚糖酶最为重要。木霉在其代谢过程中能分泌产生各种酶，主要是一系列水解酶，其中包括几丁质酶、纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶及蛋白酶等。拮抗木霉菌与生防作用有关的胞外酶主要是几丁质酶类和β-1，3-葡聚糖酶，其中，几丁质酶分为外切几丁质酶（外切几丁质酶N-乙酰-氨基葡萄糖基酶）和内切几丁质酶（内切几丁质酶几丁二糖酶）两类。已有研究表明，上述酶类对植物病原真菌的细胞壁具有强烈的水解作用，从而抑制病原菌孢子萌发并引起菌丝和孢子崩溃，而且它们之间具有协同作用，同时具有与杀菌剂及细菌等生防因子协同作用的功效。Lorito等（1993a）从哈茨木霉菌株中提纯内切几丁质酶和几丁二糖酶测定其对多种植物病原菌的活性，发现对大多数病原真菌上述两种几丁质酶的ED分别为35～135μg/mL。这主要是由于酶作用于病原菌细胞壁及原生质膜，有助于抗生素扩散到作用位点上（Harman et al.，1993；Lorito et al.，1996a）。β-1，3-葡聚糖是所有真菌细胞壁的主要成分（Jones et al.，1988；Sentandreu et al.，1994）。而且β-1，3-葡聚糖酶直接参与哈茨木霉与其寄主真菌之间的重寄生互作。β-1，3-葡聚糖酶包括外切β-1，3-葡聚糖酶和内切β-1，3-葡聚糖酶（Ramot et al.，2000）。Vázquez-Garcidueñas等（1998）从IMI206040中分离到7种 β-1，3-葡聚糖酶，而且有两种编码β-1，3-葡聚糖酶的基因已经被克隆。有研究表明，几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶对病原真菌细胞壁具有强烈的水解作用。当两种酶共同存在时，抗菌活性急剧升高。Sela-Buurlage等（1993）所做的体外试验及Van Den Elzen等（1993）的基因工程植物都证明了这一点。除几丁质酶和葡聚糖酶外，蛋白酶也起重要作用。哈茨木霉在植物病原真菌菌丝或细胞壁诱导下可以产生蛋白酶。Elad等（1999）在研究哈茨木霉T-39对灰霉病菌的生防中发现哈茨木霉产生了一种蛋白酶，这种酶能使消解植物细胞壁的病原菌降解，从而认为哈茨木霉产生的这种蛋白酶直接毒害病原菌的萌发，使病原菌的酶钝化，阻止了病原菌侵入植物细胞。

（4）抗生作用。木霉菌在代谢过程中可以产生抗生物质，它是由木霉菌次生代谢生成的。对康宁木霉、钩状木霉、哈茨木霉液体培养中产生的次生代谢产物的研究表明，上述木霉菌可以产生8种代谢物质。Lorito等（1996b，1996c）通过测定哈茨木霉73菌株的液体培养代谢产物发现，生物合成相关的代谢产物均对小麦全蚀病有拮抗作用。许多木霉菌株产生挥发性或非挥发性的抗菌素类物质，主要有木霉素、胶霉素、绿木霉素、抗菌肽等（Bertagnolli et al.，1998；Sivasithamparam et al.，1998）。朱天辉等（1994）在研究哈茨木霉对立枯丝核菌的抗生现象时发现，F060菌株产生的代谢物质能抑制立枯丝核菌的菌落生长，降低其菌丝干重，而且非挥发性代谢物具热稳定性，这些代谢物可以破坏菌丝细胞壁，使细胞内物质外渗，引起立枯丝核菌菌丝的原生质凝聚，菌丝断裂解体。Cutler等（1986）的研究表明，哈茨木霉防治立枯丝核菌的主要机制之一，是产生一种挥发性的抗生素，具有椰子香味。经过鉴定该抗生素为六戊烷基吡喃。Brückner等（1983）从长枝木霉和绿色木霉中分离提纯了一组特殊的抗菌肽，分别为triehobraehin和triehovirin，并测定了其氨基酸序列。Dennis等（1971a）还报道了木霉产生的一种挥发性乙醛对病原真菌具有抗性。这些次生代谢产物的纯化为农用抗生素的开发和利用提供了基础。但是某些抗生素性质不稳定，在一定条件下可转化为不具抗菌活性的化合物，如胶霉毒素在酶的作用下或在代谢过程中可以转化为二甲基胶霉毒素而丧失活性。

（5）协同拮抗作用。木霉的拮抗作用可能是两种或三种机制同时或顺序作用的综合结果（徐同等，1991）。Lifshitz等（1986）的研究资料表明，用木霉处理菜豆种子后，木霉对腐霉的作用包括产生抗生素及重寄生作用两种机制。木霉在产生抗菌素的同时，产生各种降解细胞壁的胞外酶以抑制土传植物病原菌的菌丝生长和孢子萌发。Di Pietro等（1993）从绿色木霉和终极腐霉相互作用的培养中提取胶霉毒素，发现每升培养液中增加75mg几丁质酶可以减少50%的胶霉毒素用量而产生同样的效果。Jones等（1988）提出胶霉毒素与细胞壁降解酶协同效应模型，认为细胞壁降解酶的作用在于使毒素快速传递并作用于原生质膜的特定位点，起到增效作用。另外，不同的细胞壁降解酶之间也存在协同作用（De La Cruz et al.，1993）。

2.8.1.2 木霉菌与大型食用真菌的关系

木霉菌是食用菌生产中一个主要的竞争性杂菌和病原菌，可侵染香菇、银耳、杏鲍菇、毛木耳、灵芝等多种食用菌，在各种食用菌的菌种、菌筒、栽培料和子实体上均可发病。主要表现为产生绿色、青绿色或者黄绿色霉层。菌筒或培养料被污染时，导致出菇率下降；子实体受污染后，可导致子实体萎缩和腐烂，尤其在香菇栽培过程中，菌袋成品率低的现象普遍存在（张绍升，2004）。

国外关于木霉污染食用菌的报道比我国早很多。1937年Beach首次在食用菌菌盖上发现一种产生绿色孢子的真菌，该真菌能够污染食用菌，经鉴定其为木霉。1953年，美国科学家在食用菌上发现木霉的污染，在培养料和子实体上均可发现，经鉴定污染类型为绿色木霉和康宁木霉（Morris et al.，1995；Castle et al.，1998）。20世纪80年代，在欧洲和北美洲，木霉菌对双孢蘑菇的危害虽一度流行，但并不是蘑菇上的主要病原菌。但是，1985年之后，研究者在北爱尔兰发现大量蘑菇染有绿霉，造成严重的经济损失，经检查鉴定该绿霉为哈茨木霉，此时污染食用菌的木霉的种类已经报道的有3种，木霉菌作为食用菌上的一种严重的病原菌，开始引起人们的重视（Seaby，1996）。Samuels（1996）还从双孢蘑菇上分离到具有生防作用的哈茨木霉，并将其作为生防菌，进行应用。Park等（2006）研究了韩国平菇床上的木霉种类，分别为哈茨木霉K1和K2型，发现木霉的不同菌株对食用菌的危害具有差异。

20世纪80年代，我国食用菌种植业迅猛发展，针对木霉对食用菌危害的报道在国内零星出现。1986年起，三明真菌研究所采自香菇、木耳、蘑菇、灵芝等食用菌上的木霉菌株共20株，经鉴定有6个菌种，其中，绿色木霉与哈茨木霉是优势菌种（王富良，1994）；康素珍（1989）调查上海食用菌病害，发现有木霉侵染。邱贵根等（1992）对江西省食用菌上的绿霉种类进行研究，鉴定结果为绿色木霉（T.viride），该菌可以危害香菇、蘑菇、木耳、平菇、金针菇等多种食用菌。程丽云等（2006c）对采集自土壤、线虫虫体、食用菌3种基质的木霉菌株进行鉴定，将其分为绿色木霉（T.viride）、哈茨木霉（T.harzianum）、康宁木霉（T.koningii）、假康宁木霉（T.pseudokoningii）、长枝木霉（T.longibrachiatum）5种，其中，康宁木霉（T.koningii）和假康宁木霉（T.pseudokoningii）为食用菌上优势种。我国食用菌上木霉的发生具有地域的广泛性，种类的多样性，且不同地区木霉的优势种类不同。福建省是食用菌种植大省，程丽云等（2006c）在调查食用菌木霉发生情况时发现，木霉在银耳上的危害严重，个别菇房中银耳子实体木霉病发生率可达10%～30%，导致食用菌损失严重。吴小平等（2008）从福建省采集的食用菌上分离到了深绿木霉，从广州食用菌上分离到了棘孢木霉（T.asperellum），福建省以哈茨木霉（T.harzianum）和长枝木霉为优势种。邵凌云等（2008）对北京地区的食用菌木霉进行调查，共鉴定 4个种：绿色木霉（T.viride）、哈茨木霉（T.harzianum）、康宁木霉（T.koningii）和长枝木霉（T.longibrachiatum），其中，哈茨木霉（T.harzianum）和康宁木霉（T.koningii）为主要的优势种，发病率较高。贺字典等（2008）对河北省食用菌上采集的木霉菌株进行鉴定，共鉴定6种：康宁木霉（T.koningii）、假康宁木霉（T.pseud-okoningii）、哈茨木霉（T.harzianum）、橘绿木霉（T.citrinoviride）、长枝木霉（T.longi-brachiatum）和非钩木霉（T.inhamatum）；而且首次从白灵菇的培养基质上分离到了假康宁木霉（T.pseudokoningii）、康宁木霉（T.koningii）和非钩木霉（T.inhamatum）。

根际的概念是由德国科学家Heltener于1904年首次提出，即指植物根周数毫米的区域。根际作为根系、土壤界面的微环境，是根系-微生物-土壤三者紧密结合且相互影响的场所。木霉的根际定殖，即木霉菌能随着根一起生长延伸。木霉在植物的根际分泌一些物质或溶解植物根周围的一些营养物质，同时，分解许多难降解的物质，为植物提供所需要的营养物，从而促进植物的生长。Avni等（1994）分别用100μg/mL的苯来特诱变绿色木霉和康宁木霉菌株，获得对苯莱特具有耐药性的木霉菌株，也意外地提高了这些木霉菌株的根际定殖能力：根际定殖能力强的木霉菌株能有效地利用复杂的碳水化合物如棉绒、纤维素、木质素及木聚糖作为碳源，菌丝在根表面生长较快，能随着根的生长进行拓展。未经诱变的木霉菌株只能拓展到根长的3cm以内，而经过诱变的获得强根际定殖能力的木霉菌株则拓展到整个根部，直至根尖。其后，Björkman等（1998）发现，根际定殖能力强的哈茨木霉菌株在植物根部竞争和拓展能力显著强于其他菌株，菌丝能随着玉米根部拓展到22cm处。用该菌株处理玉米后，玉米根部比未经处理健壮，根及茎生长量比对照组平均提高66%，提示刺激植物生长是木霉菌株对植物种子或幼苗直接作用的结果，并不是在抑制其他病原菌过程中所产生的结果。Altomare等（1999）发现，哈茨木霉菌株T22具有溶解可溶性或微溶性矿物质的能力，通过螯合或降解作用来溶解金属氧化物，如MnO2，Zn，Fe及磷酸钙的溶解，促进了植物对矿物质的吸收，从而促进植物的生长。黄有凯等（2003）的研究也表明，哈茨木霉H-13能促进水稻生长与提高水稻植株硝酸还原酶活力，增强水稻植株对N，P，K的吸收力。

木霉能抑制土壤中的病原菌，使植物充分生长。生长在自然条件下的植物因为受到病原菌的抑制，不能达到它的生长极限，在植物的根际土壤中接入了木霉，抑制了病原菌对植物的侵害，而使植物的生长潜能得以发挥。Calvet等（1993）观察了黄绿木霉（T.aureoviride）和一种菌根菌（Glomus mosseae）混合处理对植物的刺激生长作用。结果表明，单独使用深绿木霉对终极腐霉（Pythium ultimum）无抑制作用，但它与菌根菌混合后，能抑制终极腐霉，促进植物的生长，证明植物根际微生物菌根菌在深绿木霉促进植物生长过程中起着关键作用。Dandurand等（2000）在用哈茨木霉防治豌豆根腐病的试验中发现，哈茨木霉的防病促生作用与豌豆根际土壤中存在的荧光假单胞（Pseudomonas fluo-rescens）密切有关。燕嗣皇等（2005）将广谱拮抗木霉菌株接入辣椒根际，分析其对根际微生物区系和种群数量的影响，以及不同类型根际微生物与木霉菌和病原尖孢镰刀菌、青枯假单孢菌（Pseudomonas solanacearum）的互作。研究结果证实，木霉生防菌对辣椒根际大多数真菌有抑制作用或重寄生作用，或两者皆有，并主要引起真菌种群数量的减少和区系组成变化，多数根际优势细菌对木霉产孢有较强的促进作用，但也受放线菌（Actinomy-ces）和少数真菌和细菌的抑制。上述研究提示，木霉对植物的促生长作用与木霉和根际微生物的相互作用密切有关。

与其他生物类似，糖类是木霉中的主要能源物质，木霉的生长需要碳源，最适合的碳源为糖类（详见第4章）。木霉细胞外的碳源通过不同途径转化成葡萄糖，进入细胞内，然后葡萄糖分解代谢提供木霉生长所需的能量。如图5.1 所示，木霉可以通过葡糖淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶等对环境中的淀粉、纤维素进行降解，产生葡萄糖，或者培养基中含有的葡萄糖可以通过葡萄糖转运进入细胞内，葡萄糖的转运有一活跃的转运系统进行，其他真菌，例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和链孢霉（Neurospora crassa）的糖转运系统已被充分研究（Boles et al.，1997；Lagunas，1993；Marger et al.，1993；Özcan et al.，1999；Rand et al.，1980a，1980b）。Delgado-Jarana等（2003）从哈茨木霉（T.harzianum）CECT 2413中分离了一个编码葡萄糖转运蛋白的基因gtt1.，该基因编码含12个跨膜结构域和若干典型的糖转运域的葡萄糖转运蛋白。其表达受高葡萄糖抑制，受pH影响，说明木霉内葡萄糖转运受 pH 影响（Delgado-Jarana et al.，2003）。里氏木霉（T.reesei）的ΔTrhxt1突变体表现出葡萄糖积累的表型，鉴于此，Ramos等（2006）在里氏木霉（T.reesei）中分离了一个预测编码葡萄糖转运蛋白的基因Trhxt1，并发现该基因的表达受高葡萄糖浓度的抑制，并受氧浓度的调控（Ramos et al.，2006）。Trhxt1在不存在葡萄糖的情况下，其表达在微摩尔水平，当里氏木霉（T.reesei）在含纤维素的培养基上生长时，纤维素的降解使葡萄糖浓度达到微摩尔水平时也诱导该基因的表达，并且该基因在缺氧情况下表达明显下调（Ramos et al.，2006）。

图5.1 葡萄糖的合成和代谢

葡萄糖或者其他单糖的胞外氧化，在其他真菌中常有报道，但在木霉和粘帚霉中则还未见。里氏木霉（T.reesei）和深绿木霉（T.atroviride）中没有葡萄糖氧化酶，但是黑曲霉（Aspergilus niger）的葡萄糖氧化酶能够在深绿木霉（T.atroviride）和里氏木霉（T.reesei）中表达并具有活性（Mach et al.，2004；母敬郁等，2006）。有报道发现，在木素木霉（T.lignorum）、绿色木霉（T.viride）和钩状木霉（T.hamatum）中有抗坏血酸氧化酶（Hatsutori et al.，1994；Nakanishi，1995）。

微生物可以利用不同的碳源，而且不同微生物对碳源的选择和利用效率存在很大差异。当优先选择的碳源存在时，其他碳源的代谢会被一种复杂而严谨的过程抑制，这就是所谓的碳代谢阻遏。为了研究木霉中碳代谢阻遏，利用兼并引物从里氏木霉（T.reesei）和哈茨木霉（T.harzianum）中克隆获得了葡萄糖阻遏基因 cre1，cre1 编码包含锌指的C2H2型DNA结合蛋白，CRE1蛋白与构巢曲霉（A.nidulans）中葡萄糖阻遏基因creA的编码产物相似度为46%。cre1 启动子中包含一些与先前验证的构巢曲霉（A.nidulans）creA基因中结合位点一致的序列元件，creA/CRE1的结合位点是由紧密相连的两个5′-SYGGRG-3′基序组成，并且直接抑制作用仅发生在这种双结合位点（Cubero et al.，1994；Strauss et al.，1995；Ilmén et al.，1996；Takashima et al.，1996a，1996b）；另外，在一小段保守的碱性区域内的色氨酸磷酸化也调节CRE1的DNA结合能力（Cziferszky et al.，2002）。里氏木霉（T.reesei）QM9414中cre1mRNA水平受碳源的影响，在含有葡萄糖的培养基上，cre1mRNA水平降低。这些结果表示cre1的表达可以自我调控。有趣的是，里氏木霉（T.reesei）含有突变体Rut-C30，cre1基因被切断，突变体内cre1基因片段（cre1-1）仅编码含有一个锌指的95个氨基酸，其碳降解物阻遏因此得到解除，它的葡萄糖透过酶活性非常低下，可以超量生产纤维素分解酶，与QM9414不同，Rut-C30可以在含有葡萄糖的培养基上产生纤维素酶mRNAs，将cre1全长转入Rut-C30菌株可以造成cbh1表达的葡萄糖抑制，说明cre1调控纤维素酶的表达（Ilmén et al.，1996）。

碳代谢阻遏抑制表达的基因模型系统已被用于大多数真菌中碳代谢阻遏的研究，而对消除碳代谢阻遏后的基因表达变化很少有人研究。creA/cre1敲除突变体表现出减慢生长、菌丝形态和产孢异常等表型（Shroff et al.，1997；Nakari-Setälä et al.，2009）。Portnoy等（2011）对里氏木霉（T.reesei）的Δcre1突变体和野生型中基因表达差异进行了芯片分析，首次对真菌碳代谢阻遏的分子生理反应进行全面的研究（Portnoy et al.，2011）。如图5.2所示，按照基因表达情况将其分为不同的集群，其中在Δcre1突变体中高表达的基因又因为受生长速率的影响表现为不同的集群：在Δcre1突变体中高表达并不受生长速率影响的C组包含16个基因，仅在具有高生长速率的Δcre1突变体中高表达的基因为E组50个，G组26个基因，Δcre1突变体中的高表达抵消高生长速率抑制表达的影响，26个H组基因在低生长速率的Δcre1突变体中上调表达。而在Δcre1突变体中抑制表达的基因可进一步分为高生长速率诱导表达（F组，36个基因）和低生长速率诱导表达两组（D组，36个基因）。

图5.2 表达集群间的基因分布

注：根据芯片数据，按CRE1的不同调控分为9个集群（CRE1诱导，CRE1抑制，CRE1非依赖）。颜色表示生长率的影响，黑色和深灰色集群表示基因仅受较高生长速率影响，其中深灰色（B、F、G）为表达上调，黑色（A、E）为表达下调，浅灰色（D、H）表示低生长速率上调表达的基因，阴影（C）表示表达不受生长速率影响的基因

（Portnoy et al.，2011）

其中图5.2各集群中的基因包含细胞组分合成、细胞防御、细胞信号、细胞转运、蛋白活性调控、具有结合功能蛋白、蛋白命运、转录、能量、次生代谢、脂类代谢、碳代谢、氨基酸代谢、一般代谢、特异蛋白、假定蛋白等相关基因。

胞内的葡萄糖通过糖酵解（Glycolysis）和戊糖磷酸途径（Pentose Phosphate Pathway）进行分解代谢（图5.1，图5.3），以下主要从糖酵解和戊糖磷酸途径两方面对糖类分解代谢进行总结。

5.1.2.1 糖酵解作用：将葡萄糖转变成丙酮酸

糖酵解作用是葡萄糖转变成丙酮酸的一系列反应，该途径中的关键酶为己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶（图5.3）。有人研究了里氏木霉（T.reesei）中己糖激酶和葡糖激酶及它们在糖类分解代谢中的可能作用（Kubicek-Pranz et al.，1991），发现在不同碳源基质上培养时，能够检测到分别对葡萄糖和果糖具有活性的酶，表明该菌至少能够产生一种己糖激酶和一种葡萄糖激酶。然而，Samuels等（1994）利用电泳技术检测了几种木霉和肉座菌的同工酶，只发现了一个己糖激酶。这种分歧还需要进一步澄清，但两种酶在碳降解物阻遏被解除的里氏木霉（T.reesei）突变株Rut-C30 及F4 或F5 中活性没有改变（Labudova et al.，1983），在两个2-脱氧葡萄糖抗性突变株中也没有改变，表明己糖激酶或者葡萄糖激酶在木霉的葡萄糖调控中没有作用，后来利用构巢曲霉（A.nidulans）进行的研究也得出了类似结论（Ruyter et al.，1996）。

图5.3 碳代谢的主要途径：糖酵解途径和磷酸戊糖途径

对其他糖酵解酶类在基因水平上进行了研究，由于这些酶类理论上的表达很强，对表达工具的构建具有潜在的应用价值。甘油醛-3-磷酸脱氢酶已经从康宁木霉（T.koningii）中分离纯化，其编码基因也已克隆得到（Sakai et al.，1990）。该酶有两种同工酶，它们的区别在于对康宁酸（Koningic Acid）的敏感性不同，康宁酸是由康宁木霉（T.koningii）产生的一种抗生性代谢产物。研究认为氨基酸残基的差别是造成两种酶对康宁酸敏感性不同的原因，其中一种酶的氨基酸残基在174和181为丙氨酸和丝氨酸，而另一种酶在174和181位分别为苏氨酸和苏氨酸（Watanabe et al.，1993）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因也已经从哈茨木霉（T.harzianum）中克隆得到，而且在光诱导的产孢过程中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gpd）mRNA 水平下调，在分生孢子梗和分生孢子中含量最低（Puyesky et al.，1997）。Vanhanen等（1989）和Goldman等（1992）分别从里氏木霉（T.reesei）和绿色木霉（T.viride）中克隆到了编码3-磷酸甘油酸激酶的基因，其5′-端序列含有保守的结合位点，该位点可结合环腺苷控制因子、一种催化蛋白质和碳分解物阻遏抑制因子cre1（Vanhanen et al.，1989；Goldman et al.，1992b）。里氏木霉（T.reesei）的3-磷酸甘油酸激酶基因pgk1还包含一个热激共有序列，对热胁迫没有反应（Vanhanen et al.，1991）。丙酮酸激酶的编码基因也已经从里氏木霉（T.reesei）中克隆到，其蛋白质结构与黑曲霉（A.niger）和构巢曲霉（A.nidulans）的丙酮酸激酶高度相似（Schindler et al.，1993）。在里氏木霉（T.reesei）中，同工酶电泳结果发现了2～3个丙酮酸激酶条带，但点杂交却只发现了一个基因（Schindler et al.，1993）。有证据表明，丙酮酸激酶存在磷酸化现象，这可能就是发现两个电泳迁移条带的原因。

木霉也能够在非糖类碳源中生长，Jackson（1973）研究了绿色木霉（T.viride）对丙烯基乙醇的降解代谢途径，发现进一步的产物为丙烯酸和乙酸，后者进一步代谢为丙酮酸酯，可累积到原始底物量的50%（w/w）（Jackson，1973）。Tye等（1977）通过在甲醇培养基上连续培养，研究了木素木霉（T.lignorum）生长情况，发现最适生长速率较低（μ＝0.026），而且只在低浓度甲醇条件下（0.16%）才能生长。

5.1.2.2 磷酸戊糖途径

另一种常见的糖类分解代谢是磷酸戊糖途径（图5.3）。葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）被转化成果糖-6-磷酸（Fructose-6-phosphate）和甘油醛-3-磷酸（Glyceraldehydes-3-phosphate），反馈进糖酵解途径内。糖酵解途径的主要产物为丙酮酸，戊糖磷酸循环则可以为核酸和核苷酸合成提供戊糖，还可以为辅酶、能量载体等提供NADPH，也可以提供赤藓糖磷酸（Erythrose Phosphate）借莽草酸途径（Shikimic Acid Pathway）合成芬芳族氨基酸（Aromatic Amino Acids）。该路径的关键酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）。

已知真菌对葡萄糖-6-磷酸的分解代谢涉及糖酵解和戊糖磷酸途径，两者所起作用的比例依细胞需要而异。对于戊糖磷酸途径来说，在长枝组的木霉种类中发现了至少2种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的同工酶（Samuels et al.，1994），但Stasz等（1988a）在绿色木霉（T.viride）、哈茨木霉（T.harzianum）、绿木霉（T.virens）、康宁木霉（T.koningii）、钩状木霉（T.hamatum）和多孢木霉（T.polysporum）的菌株中仅检测到单一酶。Stasz等（1988a）检测的是不同菌株的同工酶，因此在方法上是能够发现同工酶差异的，因此他们与Samuels等（1994）结果的差别，很可能是由所使用的菌株不同造成的。Neto（1993）分离纯化并研究了糖酵解途径的磷酸果糖激酶2，该酶在调控方面具有重要意义，发现它不为环腺苷依赖型的磷酸化所调解控制，只为底物的可利用性所调控，这种现象与酵母不同，但与早期关于黑曲霉（A.niger）的报道一致（Harmsen et al.，1992）。

磷酸戊糖途径是NADPH的主要来源，NADPH是许多生物分子尤其是脂类合成所必需的（Berg et al.，2002）。它也为合成氨基酸提供中间产物：组氨酸由核糖-5-磷酸合成，赤藓糖-4-磷酸是合成芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的前提（Berg et al.，2002）。因此，磷酸戊糖途径在蛋白质的合成中起重要作用，被认为与蛋白质高效生产的生物系统相关。磷酸戊糖途径中间产物核糖-5-磷酸也是核酸和核苷酸合成所必需的。磷酸葡萄糖异构酶（PGI）催化糖酵解途径的第二步，使葡萄糖-6-磷酸转变成果糖-6-磷酸。这一酶位于糖酵解和磷酸戊糖途径的第一个结合点，PGI的失活导致代谢流转向磷酸戊糖途径，使产生更多的NADPH。在大肠杆菌（Escherichia coli）中发现PGI的突变株pgi能够产生更多的核苷酸和氨基酸前体（Canonaco et al.，2001）。里氏木霉（T.reesei）中pgi基因被克隆，并且通过里氏木霉数据库分析发现没有与其同源的ORFs（Limón et al.，2011）。

5.1.2.3 葡萄糖代谢命运

糖酵解途径最终将葡萄糖降解成丙酮酸，丙酮酸可以通过有氧呼吸最终产生 CO2，H2O和ATP，也可以通过厌氧途径生成乳酸（图5.1）。研究表明，关键基因的调控变化，控制里氏木霉（T.reesei）中糖酵解途径产物丙酮酸进入有氧或是厌氧途径（Chambergo et al.，2002）。Chambergo等（2002）建立了丝状真菌里氏木霉（T.reesei）的EST数据库。Derisi等（1997）利用的互补DNA芯片技术分析了葡萄糖耗尽时的基因表达谱，并与酿酒酵母（S.cerevisiae）发酵过程中基因时空表达模式进行了比较（图5.4）。里氏木霉（T.reesei）被选为这项研究的材料，因为它的自然栖息地和对营养的要求与酿酒酵母（S.cerevisiae）明显不同。酿酒酵母（S.cerevisiae）一般需要一个高糖浓度的生长环境，而里氏木霉（T.reesei）可以在营养缺乏的环境中生长，并利用胞内水解酶，例如纤维素酶对周围环境中多糖进行水解获得葡萄糖（Beguin，1990）（图 5.1）。对里氏木霉（T.reesei）在葡萄糖耗尽时基因表达模式的分析发现，糖酵解途径最终产物丙酮酸进入有氧而非厌氧途径。而且，在里氏木霉（T.reesei）表达谱中发现了编码三羧酸循环中酶和电子传递链中蛋白质的基因的表达，表明丙酮酸的氧化是通过三羧酸循环进行的，而不是通过发酵产生乙醇，而且乙醛被氧化生成醋酸，而不是还原产生乙醇，从而防止NADH的再生（Chambergo et al.，2002）。

氧气是决定丙酮酸进入有氧途径还是厌氧途径的关键因子，同时，氧气还影响丙酮酸生成的糖酵解途径中关键酶基因的表达。Bonaccorsi等（2006）证明，短暂的缺氧可以抑制糖酵解途径中关键酶基因的表达，并比较了不存在氧时里氏木霉（T.reesei）和酿酒酵母（S.cerevisiae）中糖酵解途径中基因的表达变化（Bonaccorsi et al.，2006）。

5.1.2.4 葡糖异生途径

真菌虽然通过糖酵解途径，可以利用多样的碳源，但如果真菌生长在醋酸培养基上，真菌就要通过糖异生途径合成各种碳水化合物（图5.1）。所谓糖异生，是指非糖的前体物质（例如，乳酸、氨基酸、甘油等）合成葡萄糖的过程。糖异生途径不是糖酵解途径的简单逆转，因为糖酵解作用的激酶（己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶）是不可逆的。糖异生途径为：丙酮酸羧化转变成草酰乙酸，然后磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶将之脱羧和磷酸化生成磷酸烯醇丙酮酸，在经糖酵解途径中的可逆反应转变成果糖-1，6-焦磷酸，提供给寡糖和多糖的合成（图5.1）。

图5.4 当葡萄糖消耗完时，里氏木霉（T.reesei）和酿酒酵母（S.cerevisiae）中编码参与在关键代谢过程中酶的基因表达谱的比较

注：↑和↓的框架分别表示葡萄糖耗尽时表达量升高和降低的基因，→表示表达不受影响的基因，*表示尚未从木霉中分离获得的基因，ADH基因在木霉中没有获得，但是在木霉培养物种乙醇脱氢酶的活性被检测到（Beutler，1984）。其中，FBA：果糖-1，6-二磷酸醛缩酶；TPI：磷酸甘油醛异构酶；TDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶；PGK：磷酸甘油酸激酶；GPM：磷酸甘油酸变位酶；ENO：烯醇化酶；PYK：丙酮酸激酶；PDA：丙酮酸脱氢酶；PCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶；PDC：丙酮酸脱酸酶；ALD：乙醛脱氢酶；ADH：乙醇脱氢酶；ACS：乙酰辅酶A合成酶；CIT：柠檬酸合成酶；ACO：顺乌头酸酶；IDH：异柠檬酸脱氢酶；KDH：a-酮戊二酸脱氢酶；YGR：琥珀酸硫激酶；SDH：琥珀酸脱氢酶；FUM：延胡索酸酶；MDH：苹果酸脱氢酶

（Chambergo et al.，2002）