甲苯如何瓦解细胞膜

① 红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

②血红蛋白的释放

在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。

2．粗分离

①分离血红蛋白溶液

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

②透析

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。

活性炭吸附是物理吸附，这种物理吸附是由于分子间距离过近而产生的作用力发生的。活性炭依靠其自身发达的孔隙结构和表面积，可以很大程度的接触到周围空气，被动吸附一些污染物到自己的孔隙中，所以说活性炭的表面越大、孔径结构越发达吸附能力就越强。

活性炭的含炭量、比表面积、灰分含量及其水悬浮液的pH值皆随活化温度的提高而增大。活化温度愈高，残留的挥发物质挥发愈完全，微孔结构愈发达，比表面积和吸附活性愈大。

活性炭中的灰分组成及其含量对炭的吸附活性有很大影响。灰分主要由K2O、Na2O、CaO、MgO、Fe2O3、Al2O3、P2O5、SO3、Cl-等组成，灰分含量与制取活性炭的原料有关，而且，随炭中挥发物的去除，炭中的灰分含量增大。

复习提纲选修1课题1      果酒和果醋的制作一、实验原理1．酵母菌的细胞呼吸酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，表达式为：C6H12O6+O2→CO2+H2O+能量酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，表达式为：C6H12O6→C2H5OH+CO2+能量2．酵母菌发酵的最佳环境酵母菌在有氧和无氧的条件下都能生活：在有氧时，酵母菌大量繁殖，但是不起到发酵效果；在无氧时，繁殖速度减慢，但是此时可以进行发酵。在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖，再隔绝氧气进行发酵。20℃左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵的最佳温度是在18℃～25℃，pH最好是弱酸性。3．醋酸菌好氧性细菌，当缺少糖源时和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸。表达式为：C2H5OH→CH3COOH+H2O；当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。醋酸菌生长的最佳温度是在30℃～35℃二、实验步骤1.对发酵瓶、纱布、榨汁机、盛葡萄汁的器皿等实验用具进行清洗并消毒。先用温水反复冲洗几次,再用体积分数为75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。2. 取葡萄500 g，去除枝梗和腐烂的子粒。3. 用清水冲洗葡萄1～2遍除去污物，注意不要反复多次冲洗。4. 用榨汁机榨取葡萄汁后，将其装入发酵瓶中或将葡萄打成浆后，用洁净的纱布过滤至发酵瓶中，盖好瓶盖。如果没有合适的发酵装置，可以用500 mL的塑料瓶替代，但注入的果汁量不要超过塑料瓶总体积的2/3。5. 将发酵瓶置于适宜的温度下发酵。6. 由于发酵旺盛期CO2的产量非常大，因此需要及时排气，防止发酵瓶爆裂。如果使用简易的发酵装置，如瓶子（最好选用塑料瓶），每天要拧松瓶盖2～4次，进行排气。7. 10 d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工作。8. 当果酒制成以后，可以在发酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后将装置转移至30～35 ℃的条件下发酵，适时向发酵液中充气。如果找不到醋酸菌菌种或醋曲，可尝试自然接种，但效果不是很好。如果没有充气装置，可以将瓶盖打开，在瓶口盖上纱布，以减少空气中尘土等的污染。三、注意事项请分析此装置中的充气口、排气口和出料口分别有哪些作用。为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？结合果酒、果醋的制作原理，你认为应该如何使用这个发酵装置？充气口                          排气口出料口答：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。课题2    腐乳的制作一、 实验原理1．参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉。2．毛霉是一种丝状真菌，常见于土壤、水果、蔬菜、谷物上，具有发达的白色菌丝。3.毛酶等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。二、实验步骤1.将豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干块。所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。2.将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用。每块豆腐等距离排放，周围留有一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，以免湿度太高，不利于毛霉的生长。

    3.将平盘放入温度保持在15～18 ℃的地方。毛霉逐渐生长，大约5 d后豆腐表面丛生着直立菌丝。

    4.当毛霉生长旺盛，并呈淡黄色时，去除包裹平盘的保鲜膜以及铺在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅速散失，同时散去霉味。这一过程一般持续36 h以上。

    5.当豆腐凉透后，将豆腐间连接在一起的菌丝拉断，并整齐排列在容器内，准备腌制。

    6.长满毛霉的豆腐块（以下称毛坯）与盐的质量分数比为5∶1。将培养毛坯时靠近平盘没长直立菌丝的一面统一朝向玻璃瓶边，将毛坯分层盘立摆放在容器中。分层加盐，并随层加高而增加盐量，在瓶口表面铺盐厚些，以防止杂菌从瓶口进入。约腌制8 d。 〔注〕用盐腌制时，注意盐都用量。盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。

    7.将黄酒、米酒和糖，按口味不同而配以各种香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成卤汤。卤汤酒精含量控制在12％左右为宜。

   〔注〕酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。

    8.将广口玻璃瓶刷干净后，用高压锅在100 ℃蒸汽灭菌30 min。将腐乳咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料后，将瓶口用酒精灯加热灭菌，用胶条密封。在常温情况下，一般六个月可以成熟。三、注意事项1.酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐（白坯）上的生长。发酵的温度为15～18 ℃，此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。毛霉生长大约5 d后使白坯变成毛坯。前期发酵的作用，一是使豆腐表面有一层菌膜包住，形成腐乳的“体”；二是毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶，有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料（红曲、面曲、酒酿），使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。2.毛霉是一种低等丝状真菌，有多个细胞核，进行无性繁殖。毛霉是食品加工业中的重要微生物，它可以产生能够分解大豆蛋白的蛋白酶，常用于制作腐乳和豆豉。课题3  探讨加酶洗衣粉的洗剂效果一、实验原理1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。3．在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题：一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果有什么不同；二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好，三是添加不同种类的酶的的洗衣粉，其洗剂效果有哪些区别。二、实验步骤1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。

②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。

③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。

④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。

⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件①在3个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。

②取3块大小相等的白棉布，用滴管在每块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。

③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。

④称取5克加酶洗衣粉3份，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。

⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。

3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉油渍汗渍血渍观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。

三、注意事项1．变量的分析和控制影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量，衣物的质料、大小及浸泡时间和洗涤的时间等。在这些因素中，水温是我们要研究的对象，而其他因素应在实验中保持不变。选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来确定水温，通常情况下，冬季、春季、秋季和夏季可分别选取5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，因为这4个水温是比较符合实际情况的，对现实也有指导意义。2．洗涤方式和材料的选择。在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式，应考虑其中哪一种比较科学？哪一种更有利于控制变量？再有，洗衣机又可以分为半自动和全自动两种，相比之下，采用全自动洗衣机比较好，并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机，其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣物作实验材料并不理想，这是因为作为实验材料的衣物，其大小、颜色、洁净程度等应该完全一致，而这并不容易做到；此外，人为地在衣物上增加污物，如血渍、油渍等，也令人难以接受。因此，选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时，可以控制布料的大小、颜色以及污物的量，使其相同；同时，也便于洗涤效果的比较。3．水量、水质和洗衣粉用量的问题。水的用量和布料的大小是成正比的。做实验用的布料不易过大，水量不易过多，但应该让布料充分浸泡在水中。水量和洗衣粉的用量可以参考下表。实验时可根据表中的数据换算出实际用量。如果在实验中使用手洗的方法，如课本中图4-4所示，使用1 000 mL的烧杯作为容器，可以用500 mL的水，洗衣粉的用量可以用1 g或1.5 g。洗涤方式机洗手洗水量0.5 L0.5 L洗衣粉量0.5 g1 g或1.5 g其他相关问题简述如下。实验中可以用滴管控制污物的量，待污物干燥后再进行实验；布料应放在洗衣粉溶液中浸泡相同的时间；采用玻璃棒或筷子搅拌的方式模拟洗衣过程；模拟搅拌的时间、次数和力量应基本相同。课题4 酵母细胞的固定化一、实验原理1．使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。2．固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。固定化酶优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用。固定化细胞优点：成本更低，操作更容易，可以催化一系列的化学反应。二、实验步骤1。细胞的活化称取lg干酵母，放入50 mL的小烧杯中，加人蒸馏水10 mL，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化。 【注】活化：让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态2。配制物质的量浓度为0.05mo1/L的CaCl2溶液

   称取无水CaCl2 0.83g。放人200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。

3。配制海藻酸钠溶液

   称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中。加人10mL水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10 mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。

4。海藻酸钠溶液与酵母细胞混合

   将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加人已活化的醉母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。 【注】冷却至室温的目的：防止杀死酵母菌5。固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右。 【注】CaCl2溶液的作用：使胶体聚沉6 使用固定化酵母细胞发酵 a) 将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2-3次。 b) 将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25℃下发酵24h。

三、注意事项1.配制海藻酸钠溶液：小火、间断加热、定容，如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。2.海藻酸钠溶液与酶母细胞混合：冷却后再混合，注意混合均匀，不要进入气泡3.制备固定化酵母细胞：高度适宜，并匀速滴入4．刚形成的凝胶珠应在CaCL2溶液中浸泡一段时间，以便Ca2+与Na+充分交换，形成的凝胶珠稳定。检验凝胶珠是否形成，可用下列方法：用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果不容易破裂，没有液体流出就表明成功地制成了凝胶珠，还可以用手将凝胶珠在实验桌上用力摔打，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。5．凝胶珠的颜色和形状如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。课题5    DNA的粗提取与鉴定一、实验原理提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。1．DNA的溶解性  DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。2．DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性   蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。3．DNA的鉴定    在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验设计1． 实验材料的选取   凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。2． 破碎细胞，获取含DNA的滤液  动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。注意：①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。3． 去除滤液中的杂质  方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。注意：①为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。②方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。4． DNA的析出与鉴定    将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。三、实验步骤—以洋葱为实验材料1．称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液，充分研磨。洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。2．研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。3．向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中，切忌震动和搅拌（不震动易于分层，我们就能很容易观察到上清液中的丝状物；搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出）。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了。4．鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL，向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。四、注意事项1．以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。4．DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。5．盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。课题6    血红蛋白的提取和分离一、实验原理蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。1．凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（3）分离过程： 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子＊ 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。（4）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。2．缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。3．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。二、实验步骤1．样品处理① 红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。②血红蛋白的释放   在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。2．粗分离①分离血红蛋白溶液    将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。②透析    取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。3．纯化调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝↓        胶面平齐，关闭出口。加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，∣         打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，↓         关闭出口。调节缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度↓洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。↓收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。4.纯度鉴定------SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）三、注意事项1. 电泳技术电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。2.  红细胞的洗涤如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。4．为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。6．G-75“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。7．装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密8．加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。9．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。10．如何检测血红蛋白的分离是否成功如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

基本骨架是有磷脂双分子层构成的，其中嵌有蛋白质，分为跨膜蛋白质和镶嵌蛋白质，在膜外的一侧蛋白质上还具有多糖链，形成糖蛋白，具有分子识别功能。也就是说蛋白质也是骨架的一部分，蛋白质溶解了，那细胞就解体了。

常见的室内污染物有：甲醛、苯、TVOC、氨和氡。

甲醛（化学分子式HCHO，分子量：30.03）是一种无色，有强烈刺激型气味的气体。易溶于水、醇和醚。甲醛在常温下是气态，通常以水溶液形式出现。其40%的水溶液称为福尔马林，此溶液沸点为19℃，故在室温时极易挥发，随着温度的上升挥发速度加快。

甲醛为较高毒性的物质，在我国有毒化学品优先控制名单上甲醛高居第二位。甲醛已经被世界卫生组织确定为致癌和致畸形物质，是公认的变态反应源，也是潜在的强致突变物之一。 研究表明：甲醛具有强烈的致癌和促癌作用。大量文献记载，甲醛对人体健康的影响主要表现在嗅觉异常、刺激、过敏、肺功能异常、肝功能异常和免疫功能异常等方面。其浓度在每立方米空气中达到 0.06--0.07mg/m3 时，儿童就会发生轻微气喘。当室内空气中的甲醛含量为 0.1mg/m3 时，就有异味和不适感；达到 0.5mg/m3 时，可刺激眼睛，引起流泪；达到 0.6mg/m3 ，可引起咽喉不适或疼痛。浓度更高时，可引起恶心呕吐，咳嗽胸闷，气喘甚至肺水肿；达到 30mg/m3 时，会立即致人死亡。

苯是一种无色具有特殊芳香气味的液体，沸点为80.1℃，甲苯、二甲苯属于苯的同系物，都是煤焦油分馏或石油的裂解产物。目前室内装饰中多用甲苯、二甲苯代替纯苯作各种胶.油漆.涂料和防水材料的溶剂或稀释剂。因为苯具有易挥发、易燃、蒸气有爆炸性的特点。人在短时间内吸入高浓度的甲苯、二甲苯时，可出现中枢神经系统麻醉作用，轻者有头晕、头痛、恶心、胸闷、乏力、意识模糊，严重者可致昏迷以致呼吸、循环衰竭而死亡。如果长期接触一定浓度的甲苯、二甲苯会引起慢性中毒，导致再生障碍性贫血。女性主要表现为月经过多或紊乱，胎儿的先天性缺陷。同时可使人出现头痛、失眠、精神萎靡、记忆力减退等神经衰弱等症候。所以苯化合物已经被世界卫生组织确定为强烈致癌物质。

VOC是指沸点范围在 50 ～ 100 ℃到 240 ～ 260 ℃之间的化合物。TVOC即总挥发性有机物. TVOC 在施工中大量挥发，使用中缓慢释放。 一般认为，正常的、非工业性的室内环境 TVOC 浓度水平还不至于导致人体的肿瘤和癌症。当 TVOC 浓度为 3.0-25 mg/m3 时，会产生刺激和不适，与其他因素联合作用时，可能出现头痛；当 TVOC 浓度大于 25 mg/m3 时，除头痛外，可能出现其他的神经毒性作用。

在由于室内装饰装修材料造成的室内空气污染中，挥发性有机气体是一种很普遍且对人体危害较大的一类污染物。英国材料、建筑物研究所测定了 100 户住宅在 28 天中室内 TVOC 的浓度水平，研究结果再次证实室内 TVOC 浓度高于室外，室内 TVOC 浓度为室外的 2. 4 倍。室内 TVOC 的均值为 121.8ug/m3 。它的特点是：种类多、成份复杂、长期低剂量释放、对人体危害大。总体来说，它的释放主要是使用了大量有机溶剂的溶剂型涂料以及家装使用的各种板材粘合剂。

氨是一种无色且具有强烈刺激性臭味的气体，比空气轻（比重为 0.5 ），氨是一种碱性物质，它对所接触的皮肤组织都有腐蚀和刺激作用，可以吸收皮肤组织中的水分，使组织蛋白变性，并使组织脂肪皂化，破坏细胞膜结构。浓度过高时除腐蚀作用外，还可通过三叉神经末梢的反向作用而引起心脏停搏和呼吸停止。

部分人长期接触氨可能会出现皮肤色素沉积或手指溃疡等症状；短期内吸入大量氨气后可出现流泪、咽痛、声音嘶哑、咳嗽、痰带血丝、胸闷、呼吸困难，可伴有头晕、头痛、恶心、呕吐、乏力等症状，严重者可发生肺水肿、成人呼吸窘迫综合症，同时可能发生呼吸道刺激症状。所以碱性物质对组织的损害比酸性物质深而且严重。

氡是从放射性元素镭衰变而来的一种无色、无味的放射性惰性气体，氡及其子体在衰变时释放出α、β、γ等射线，易溶于脂肪，可通过呼吸过程进入人体。由于氡与人体的脂肪有很高的亲和力，氡能在脂肪组织、神经系统、网状内皮系统和血液中广泛分布，对细胞造成损伤，最终诱发癌变。氡被WHO（世界卫生组织）公布为19种主要环境致癌物之一，且被国际癌症研究机构列入室内主要致癌物。氡不仅会增加患癌尤其是肺癌、败血症等疾病的可能，而且会因为对人体细胞的机质性损伤带来对子女甚至第三代的潜在伤害。

常温下氡及子体在空气中能形成放射性气溶胶而污染空气，由于它无色无味，很容易被人们忽视，但它却容易被呼吸系统截留，并在局部区域不断累积。长期吸入高浓度氡最终可诱发肺癌

对人体的危害香蕉水=天那水(甲苯) 香蕉水属于有机溶剂,手皮肤接触到会有脱脂作用,皮肤会干燥,严重时会皲裂. 吸入香蕉水,尽管有芳香的味道但是非常有害. 短时间吸入高浓度会觉得眼鼻刺激感,流泪. 由于香蕉水是亲脂性的,特别容易与神经细胞结合, 出现神经损害.如疲劳、记忆力下降、注意力不集中、失眠、头晕等。严重时可昏迷。 如果经常接触同样要进行防护,保持良好的通风,尽量避免大剂量吸入以及直接皮肤接触, 因为 有机溶剂一般都有比较强的渗透性.最好配戴手套! 健康危害侵入途径 吸入、食入、经皮吸收。 健康危害 对眼和粘膜有刺激作用，高浓度吸入可引起中枢神经系统损害，甚至肝肾损害。急性中毒可出现急性结膜炎、咽喉炎、支气管肺炎、肺水肿。 长期接触，有流泪、咳嗽、喉干、疲劳等症状，重者伴有头痛、恶心、呕吐、胸闷、心悸、食欲不振等。可致皮肤干裂、皮炎或湿疹；可致贫血，嗜酸粒细胞增多。所以大家记住要保持良好的通风,尽量避免大剂量吸入以及直接皮肤接触,因为 有机溶剂一般都有比较强的渗透性.最好配戴手套! 危险特性其蒸气与空气形成爆炸性混合物遇明火高热能引起燃烧爆炸。与氧化剂能发生强烈反应。其蒸气比空气重，能在较低处扩散到相当远的地方，遇到明火源引起着回燃。若遇到高热度体内压力大，有开裂和爆炸危险。 具有爆炸的危险，所以要小心，切不可马虎大意。 [编辑本段]五、应急处理措施皮肤接触：脱去污染的衣着，用流动清水冲洗。如有不适感，就医。 眼睛接触：提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗。如有不适感，就医。 吸 入：迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，给输氧。呼吸、心跳停止，立即进行心肺复苏术。就医 食 入：饮足量温水，催吐。就医。 消防措施：

挥发性有机化合物（VOC）是指环境监测中以氢焰离子检测器测出的非甲烷烃类物质的总称，其中包括含氧烃类、含卤烃类，广义场合包括甲烷、丙烷、氯烃、氟烃及醇、醚、酯、酮、醛等含氧烃、胺等含氮烃、二硫化碳等含硫烃。如：甲醛和丙烯酸，苯、甲氯乙烯、三氯乙烷、三氯乙烯和甲醛。

中国华西医科大学公共健康学院1995年冬天对刚装修的两个居民房进行了两个半月的VOC测量，发现这些房中产生不同程度的甲醇、乙醇、戊烷、已烷、苯、庚烷、环已烷、甲苯、二甲苯、乙基苯。其中最主要的有机物是甲醇，苯，甲苯和二甲苯。中国预防医学科学院环境卫生监测所对一个办公室空气污染进行测量，发现办公室内主要有机物是苯、甲苯、二甲苯、乙苯和甲醛，浓度从0.1mg/m3到0.96 mg/m3。

淋滤试验是在挥发试验和吸附试验的基础上进行的，在通过挥发试验和静态吸附试验掌握了BTEX的挥发和吸附行为之后，主要通过土柱试验探讨BTEX的厌氧条件下微生物的降解性能，进而将这三种迁移转化机理联系起来，系统揭示BTEX在经过河流渗滤系统的过程中被净化的机理和效果，并预测污染河水中的BTEX对地下水的潜在危害。

理论上，在厌氧条件下，当河流渗滤系统中存在电子受体的情况下，BTEX各组分在模拟的河流渗滤系统中（除挥发以外的部分）将发生吸附和微生物降解两种环境行为，其中吸附机理已通过静态吸附试验进行了研究，详见本书第二章，在土柱试验结果的基础上主要探讨吸附对于微生物降解的影响。由于河流渗滤系统中氧气消耗很快，多处于厌氧状态下，因此淋滤试验主要模拟BTEX在河流渗滤系统中的厌氧微生物降解。厌氧生物降解性是指有机化合物在厌氧条件下被微生物所利用，通过厌氧微生物的作用，使其改变原来的结构和物理化学性质，在一定时间内完全矿化为H2O、CO2或CH4的过程。有机物的厌氧生物降解性可以从以下三个方面来考察降解程度：

（1）根据反应前后基质浓度的变化；

（2）根据反应前后电子受体浓度的变化；

（3）根据反应前后微生物的活性变化。

基质浓度的降低、电子受体浓度的变化、微生物数量的增多等都可视为有机物被降解的表现。降解速度越快、降解程度越大，则表明该有机物厌氧生物降解性能越好。本次试验选择对环境危害较大且污染较为普遍的BTEX四种组分作为试验基质，定性研究在两种不同电子受体的情况下，BTEX在河流渗滤系统中发生的环境行为，并定量分析BTEX各组分在厌氧条件下的生物降解性能。从而确定河流渗滤系统的BTEX污染的去除效果。

有机污染物在厌氧条件下生物降解的通式为：有机污染物＋微生物＋电子受体＋营养物→CO2 ＋ H2O＋微生物＋副产物。本次试验中有机污染物为试验中添加的苯、甲苯、乙苯和间二甲苯，微生物为土柱渗滤系统中的土著微生物，电子受体为淋滤液中加入的 和 ，营养物质也是系统中固有的营养物质，包括常量元素和痕量元素。

淋滤试验开始于2010年7月15日，从7月16日开始进行样品采集和测定，试验结束于2010年9月1日，判断试验结束的主要依据是渗出液中几种主要目标组分浓度上升，主要是两种电子受体的浓度大幅上升至初始浓度附近，并在一段时间内保持稳定，证明经过一段时间的持续淋滤作用，河流渗滤系统中的土壤达到吸附饱和，并且微生物活性受到抑制，吸附作用和微生物降解作用都已不能再发挥净化作用，大部分污染物已穿透包气带进入地下水含水层。淋滤试验共进行了48d，共采集到样品168个，通过测定获取有效数据840个，记录了在淋滤过程中的BTEX四种单组分的输入浓度和输出浓度，以及渗出液中 和 的浓度，并绘制出各目标组分的浓度变化历时曲线，所得数据能够反映在淋滤的过程中各目标组分浓度随时间变化的情况。本项研究主要通过淋滤试验前后基质即BTEX各组分浓度变化、电子受体浓度的变化及两者之间的相关性，以及微生物活性的变化来研究BTEX在河流渗滤系统中的微生物降解作用。

（一）淋滤试验结果

1.基质和电子受体浓度的变化

淋滤试验历时48d，记录了在淋滤的过程中BTEX四种组分和两种电子受体浓度变化的过程，并绘制了各组分浓度变化历时曲线。在以 作为电子受体的系统中，BTEX各单组分浓度变化历时曲线如图3 -31～图3 -34所示， 浓度变化历时曲线如图3 -35所示。

图3-31 以 为电子受体条件下苯的浓度变化历时曲线

在以 作为电子受体的系统中，BTEX各单组分浓度变化历时曲线如3-36～图3-39所示， 浓度变化历时曲线如图3-40所示。

试验过程中淋滤液按照BTEX各组分80mg/L、 为400mg/L、 为400mg/L的浓度配制，输入模拟的河流渗滤系统，每日定时采集样品，测定输入浓度和渗出液浓度。从BTEX四种单组分在两套不同的系统中的淋滤过程浓度变化历时曲线来看，从淋滤试验开始至结束，渗出液中四种组分的浓度均比输入浓度有大幅度降低，特别是在试验初期至中期的25d之间，浓度下降最为明显，后期均有所上升。其中在两种不同的电子受体的情况下下降最明显的都是间二甲苯，下降幅度为10.41 ～75.70mg/L，平均降幅为50.91mg/L；苯的浓度降幅最小，下降幅度为10.84～68.57mg/L，平均降幅为39.67mg/L。另外，两种电子受体的浓度也出现较为相近的变化，均在试验初期的几天内虽略有下降，但仍保持较高水平，几天后迅速降低，其中从第五天开始 降低，而 从第八天开始降低，两种电子受体浓度下降幅度非常明显，从初始浓度400mg/L左右降到未检出的水平，后期（25d开始）大幅度上升至初始浓度附近。因此可以通过土柱试验结果来模拟河流渗滤系统中BTEX污染迁移转化的过程，并通过分析BTEX四种组分和两种电子受体浓度变化历时曲线及其相关关系探讨河流渗滤系统中BTEX的污染去除机理并判断其净化效果。

图3-32 以 为电子受体条件下甲苯浓度变化历时曲线

图3-33 以 为电子受体条件下乙苯浓度变化历时曲线

图3-34 以 为电子受体条件下间二甲苯浓度变化历时曲线

图3-35 浓度变化历时曲线

图3-36 以 为电子受体条件下苯的浓度变化历时曲线

图3-37 以 为电子受体条件下甲苯的浓度变化历时曲线

图3-38 以 为电子受体条件下乙苯的浓度变化历时曲线

图3-39 以 为电子受体条件下间二甲苯的浓度变化历时曲线

图3-40 浓度变化历时曲线

2.土壤微生物变化

野外采集的河流细粒沉积物中生长着大量的土著微生物，这些土著微生物能够有效地降解污染河流中的污染组分BTEX，并最终将其转化成环境可以接受的物质CO2和H2O等。降解过程伴随着新的微生物的生长，这可以通过观察土柱渗滤系统中细粒沉积物颜色的变化来初步判断。试验前后土柱颜色从原来的土黄色变成墨绿色，试验开始时土柱中并没有出现这些颜色，而试验结束将土柱拆除时可以观察到墨绿色密密麻麻占满整个土柱，这说明微生物数量不断增长，反映微生物在淋滤试验中的生长过程。由此可以初步判断经过BTEX淋滤的土柱渗滤系统中的微生物环境已不同于最初未加入BTEX渗滤液的微生物环境。

为了更精确地了解淋滤前后土壤中微生物环境的变化，淋滤试验结束后将土柱内土壤立即取出进行微生物指标测定，并与未经淋滤土壤进行了对比。主要测定的微生物指标包括：细菌、放线菌、真菌总数，以及硝化细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌菌数。其中真菌、放线菌均未发现。细菌总数发生变化较大，硝化细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌菌数出现了一定的变化。微生物指标测定结果详见表3-20～表3 -24。

表3-20 土样水含量的测定（80℃烘干24h）

表3-21 土样细菌菌落数

注：菌数＝ ［（A1＋A2＋A3）/3×10n×10］/（1-样品水分百分数），其中A1、A2、A3为平板计数的三个平行数；10n为稀释梯度，10为稀释倍数。

表3-22 土样硝化细菌菌落数

续表

表3-23 土样亚硝化细菌菌落数

表3-24 土样反硝化细菌菌落数

（二）BTEX在河流渗滤系统中的环境行为

根据各组分浓度发生的变化以及微生物指标的变化可以初步判断在河流渗滤系统中，当存在电子受体和土著微生物的情况下，河流沉积物在一段时间内能够有效地去除BTEX，除去挥发过程，溶解在水中的BTEX发生的主要迁移转化过程是吸附和微生物降解，下面将就这两种环境行为进行讨论。

1.BTEX的降解行为

反硝化条件下，BTEX的微生物降解是反硝化细菌在厌氧条件下利用BTEX作为自身生长繁殖的碳源和能源，同时以 、 等作为电子受体，将BTEX降解为无害产物如CO2和H2O等的过程。 、 是普遍的地下水污染物，而地下水环境中溶解氧消耗非常快，因此自然就形成了以反硝化细菌为主体的厌氧环境，反硝化微生物在厌氧沉积层中占主导地位，数量也非常庞大，因此当存在电子受体和土著微生物时就会发生反硝化作用和硫酸盐的还原反应。

在以 作为电子受体的情况下，BTEX污染河水在经过河流渗滤系统时发生了反硝化作用，BTEX（以苯为例）的生物降解反应式为

河流渗滤系统污染去除机理研究

在以 作为电子受体的情况下，BTEX污染河水在经过河流渗滤系统时发生了硫酸盐的还原反应，BTEX（以苯为例）的生物降解反应式为

河流渗滤系统污染去除机理研究

从本次淋滤试验的结果来看，BTEX四种单组分的渗出浓度在整个试验期间与输入浓度相比都出现了一定程度的下降，但其降低的过程还表现出一定的阶段性特点，而且其变化过程与两种电子受体浓度变化历时曲线的波动之间存在较大关联，可以根据两者在不同阶段波动的情况来推测在试验期间模拟的河流渗滤系统中BTEX各单组分发生的环境行为。

试验期间电子受体浓度变化与BTEX浓度变化并非同步，试验初期的几天内，两套系统中的电子受体的浓度均略有下降，其中 浓度下降到300mg/L左右， 也下降到250mg/L左右，而BTEX四种组分浓度均迅速下降，其中苯、甲苯和乙苯都下降到10mg/L左右，而间二甲苯浓度迅速下降到4mg/L左右，说明在此期间起到净化效果的并不是微生物降解作用，而是吸附作用。 和 两种电子受体在试验初期的几天内均略有下降，是由于此过程中河流沉积物中原有的一些有机化合物参与到反硝化作用和硫酸盐的还原反应中，使一部分 和 被还原，但是由于两种电子受体浓度较高，少量有机化合物不足以将其全部还原，因此试验初期两种电子受体浓度均有下降，但降幅有限。另外，两种电子受体的浓度变化也反映了系统中微生物活性的变化过程。试验初期，BTEX的输入可能对原有系统中的微生物具有毒性，使原来环境中的微生物逐渐死亡，而有利于BTEX降解的微生物菌群需要一定的时间才能够形成并发挥作用。随着原有菌群逐渐死亡和土壤中所含有机化合物的数量减少，两种电子受体浓度均上升至初始浓度400mg/L附近。因此试验初期的几天内，在吸附作用和BTEX的毒性作用下，厌氧微生物降解作用并未发挥很好的净化效果。

经过这段滞后期，其中以 为电子受体的系统中滞后5d，而以 为电子受体的系统中滞后8d。随着吸附作用的去除效果逐渐降低，以及在淋滤液的作用下利于BTEX降解的微生物逐渐生长，淋滤试验进行到中期后较长的一段时间内，土柱当中微生物以BTEX作为生长基质，以 、 作为电子受体，促使两者之间发生了上述氧化还原反应，并大量繁殖，导致BTEX四种组分和两种电子受体的浓度均出现大幅度下降，其中间二甲苯下降幅度最大，介于10.41～75.70mg/L之间，平均降幅为50.91mg/L；苯的浓度降幅最小，下降幅度介于10.84～68.57mg/L之间，平均降幅为39.67mg/L，而两种电子受体的浓度也降到了未检出的水平。所以可以推测，当存在电子受体的情况下，污染河水中的BTEX能在河流渗滤系统中发生吸附作用和微生物降解作用而被净化，且去除率较高。在两种不同电子受体的系统中BTEX四种组分的去除率可以用下面的方法计算：

河流渗滤系统污染去除机理研究

式中：R为去除率；C0为初始浓度，mg/L；Ce为渗出液浓度，mg/L。两种不同的电子受体情况下，BTEX各组分的去除率见表3-25和表3-26。

表3-25 以 为电子受体条件下BTEX各组分去除率 单位：％

表3-26 以 为电子受体条件下BTEX各组分去除率 单位：％

从去除率的比较来看，两套系统中，间二甲苯的平均去除率都最高，分别为85.5％和82.4％，其次是乙苯，平均去除率分别为72.8％和73.9％，再次是甲苯，平均去除率分别为71.9％和65.9％，去除率最差的是苯，平均去除率分别为68.5％和63.5％。但是前人研究发现，一般情况下，苯与甲苯相比，甲基的引入提高了化合物的可生物降解性。与甲苯相比，二甲苯和三甲苯的生物降解性随甲基数量的增加而变得困难。甲苯和乙苯相比，微生物降解甲苯的驯化期短，平均降解速率也大。说明取代基碳链越长，生物降解越困难。另外，Dou et al.（2008a，b）运用驯化的反硝化混合菌群进行了BTEX的厌氧降解试验。他们给出了混合细菌属在硝酸盐和硫酸盐还原条件下对BTEX六种测试基质的厌氧降解速率的顺序是：甲苯>乙苯>间二甲苯>邻二甲苯>苯>对二甲苯。而本次试验的结果显示，利用黄河花园口区采集的河流沉积物模拟的河流渗滤系统中，苯的平均降解效率最低，符合一般规律，这说明苯的结构稳定是决定土著微生物对其降解效率低的决定性因素，但苯的最高去除率也高达94.2％。由吸附试验证明，土壤对苯的吸附作用较为强烈，因此吸附作用对于苯的去除效果贡献也较大。但随着试验的进行，由于苯降解较为微弱，而随着水的流动速率增加，苯的不可逆吸附部分减少（Kim et al.，2006），所以导致试验后期渗出液中苯的浓度较高，总的去除效率较低。甲苯与乙苯、间二甲苯的降解效率相比，所得的结论与前人的研究并不一致，甲苯的平均去除率在两套系统中分别为71.9％和65.9％，均低于相同条件下乙苯和间二甲苯的平均去除率，其中在以 为电子受体的系统中，乙苯和间二甲苯的平均去除率分别为72.8％和85.5％，而在以 为电子受体的系统中，乙苯和间二甲苯的平均去除率分别为73.9％和82.4％。这可能有两方面的原因，一方面本次试验所采用的土壤中的土著微生物并非以甲苯作为优先利用的基质；另一方面可能是由于土壤对甲苯的吸附作用比其他两种物质强烈，而甲苯的解吸过程比较微弱，因此不能够有效地为微生物所利用，造成了降解效率较低。而后期随着土壤吸附逐渐饱和，以及水的流动性使甲苯迁移性增强，出水的甲苯浓度也逐渐升高，导致甲苯总的去除效率较低。因此从本次试验中各组分的去除率来看，在河流渗滤系统中能够有效去除BTEX污染的机制包括吸附作用和微生物降解作用，但是在渗滤过程中对于不同组分两种去除机理产生的影响程度有所不同，而吸附作用会对降解产生一定的影响，关于这一点将在后面进行讨论。

本次试验结果显示，除了乙苯在以 为电子受体的系统中的平均去除率73.9％略高于在以 为电子受体的系统中的平均去除率72.8％以外，其余各组分的平均去除率都显示，在以 为电子受体的系统中较高。通过比较两套系统中BTEX各组分的降解效率，可以发现厌氧条件下河流渗滤系统中在其他条件相同的情况下，以 为电子受体的模拟河流渗滤系统中各组分的降解速度比以 为电子受体的系统快，降解效率也较高。因此可以说，相比于硫酸盐，硝酸盐是一种更佳的电子受体。

需要说明的是，因为本次试验是为了模拟河流渗滤系统的自然净化过程，试验过程中并没有采取一定的方法去除溶液中的溶解氧，因此不排除试验初期存在好氧微生物降解，但由于土柱密封性能良好，而且试验期间均保证是在饱水状态下进行的，而氧在水中的溶解度低，会很快被消耗，正如自然地下水系统中的污染区多处于厌氧状态，因此好氧降解对污染去除特别是在初期可能会起到一定的作用，但随着溶解氧的迅速消耗，起到主要作用的仍然是吸附作用和厌氧条件下的微生物降解作用。

在淋滤试验后期，特别是25d以后，系统各目标组分的渗出浓度均出现上升，BTEX四种单组分浓度均有一定幅度的上升，其中在两套系统中上升最明显的都是苯和甲苯，而电子受体的浓度上升到初始浓度附近，并在到试验结束的这段时间中保持较为稳定的状态。前人的研究表明，几乎所有的高浓度有机污染物对微生物都有毒性。通常，BTEX各组分中苯对微生物的毒性比其他化合物更大，并且其结构较为稳定，只在很小的浓度范围内能够被降解。

目前，关于BTEX对微生物毒性的阈值并未形成一致的意见。在Alvarez et al.（1991）的研究中发现，如果BTEX污染物总量达到200mg/L，在好氧含水层物质中能够被降解。1995年有报道指出，浓度高达80mg/L的甲苯能够被已驯化的反硝化菌降解（Alvarez et al.，1995）。豆俊峰等（2006）在对BTEX在硝酸盐还原条件下的生物降解性能的研究中也发现，在30d内，初始浓度分别为80mg/L的苯、甲苯、乙苯和间二甲苯浓度分别下降到40mg/L、0mg/L、0mg/L和40mg/L，而高浓度的BTEX对降解混合菌群存在抑制作用。在某含水层物质的富集培养试验中，甲苯单独存在时，7d内其浓度由28mg/L降至0.01mg/L；浓度为30mg/L的BTEX共同存在时，27d后甲苯开始降解，40d后能够被完全去除，均认为是BTEX对微生物的抑制作用（Hutchins et al.，1991）。

本次试验结果显示，在模拟的河流渗滤系统中连续不断地输入BTEX污染河水，试验后期渗出液中BTEX各组分浓度都出现不同程度上升，另外两种电子受体浓度也均上升至初始浓度附近并在一定时段内保持稳定，这可能是由于淋滤液的持续作用，土柱中累积的污染物浓度不断升高，土壤中的微生物活性受到抑制，反硝化作用和硫酸盐的还原反应趋于终止所导致的。

本次试验所配制的淋滤液浓度较高，试验结果表明，在BTEX污染较高的浓度范围内，河流渗滤系统能够在污染发生后一段时间内有效去除BTEX各组分，特别是试验中期对间二甲苯的去除率高达90％以上，对乙苯的去除率在80％以上，但这样的去除效果并不能维持较长时间，而且从试验期间的平均去除率来看，也并不能将污染物完全去除。因此，虽然河流渗滤系统由于存在吸附作用和微生物降解作用能够有效降低BTEX污染物浓度，对地下水环境具有一定的保护作用，但是其净化效果只能局限于一定浓度范围和一定时间内。当土壤吸附达到饱和、微生物活性受到抑制的情况下，BTEX能够穿透包气带进入含水层，对地下水产生危害。通常，石油污染场地的地下水中苯的检出值远低于在实验室或现场测定的浓度，这表明野外天然条件下，BTEX对微生物的毒性不足以阻碍BTEX的微生物降解。

从微生物指标的变化来看，经过淋滤作用的各种土壤样品中细菌菌落总数均比未经淋滤的土壤明显增加，分别上升了1～3个数量级，说明在淋滤试验中，微生物以BTEX作为生长基质大量繁殖，因此也说明在河流渗滤系统中存在微生物降解作用，能够有效去除BTEX污染。其中，硝化细菌是硝化作用的主要功能细菌，在未经淋滤的三种土样中，硝化细菌均占据了一定的优势，而在淋滤试验中主要发生的是反硝化作用，且淋滤液中的BTEX组分对土壤中原有菌群具有毒性，因此硝化细菌数在淋滤试验后总的趋势是受到抑制而大量死亡。而从反硝化细菌的试验结果来看，其在淋滤试验结束后也大量减少，只有在粗砂柱2中的反硝化细菌数量有一定程度增长，由于试验条件的限制未能实现在试验中期也就是降解作用发挥的过程中取出一定量的土样进行微生物指标测定，因此只能推测反硝化细菌在淋滤试验中期可能大量繁殖，而试验后期由于BTEX在土柱中累积的数量越来越多，对于反硝化细菌也产生了毒性，导致其大量死亡。同时这也说明在试验过程中可能存在其他的微生物菌群参与到BTEX降解过程中。

2.BTEX的吸附行为

在河流渗滤系统中，BTEX主要发生吸附和降解两种环境行为，而两者之间存在一定的相互影响。一般说来，吸附行为是影响有机污染物降解的主要制约因素，污染物的吸附性越强，则其存在于沉积物水溶液中的质量百分比越小，那么它的生物降解性能就越差（刘凌等，2000）。在河流渗滤系统中，有机污染物要发生微生物降解作用，必须暴露给微生物，也就是说，只有能够直接接触到微生物的那部分有机污染物，才可能被其作为生长基质所利用，从而发生降解作用。

影响有机污染物生物降解性能的主要制约因素是其与微生物之间的物理性分隔。Leh-ninger（1975）指出，微生物的新陈代谢作用发生于细胞质中，而细胞质与外部环境之间通过细胞膜相隔，对大多数有机污染物来说，这些细胞膜是不可渗透的。因此要使污染物通过细胞膜，必须利用特殊的蛋白质作为载体，由于这些蛋白质载体只有在水溶液中才能够有效地发挥作用，因此微生物也只能有效地降解能够溶解于水中的有机污染物。

在土壤水环境系统中，有机污染物的存在方式并不仅仅是存在于土壤颗粒外部水相中这一种状态，它还可能吸附在土壤颗粒的内部，天然条件下土壤颗粒中包含了许多大小不同的内孔隙（Schwarzenbach et al.，1992）。Ball et al.（1991）通过对美国波顿流域采集的土壤颗粒分析发现，大约有超过50％的土壤颗粒的内孔隙小于0.1μm，大约有12％的土壤颗粒的内孔隙大于1μm，只有5％的土壤颗粒的内孔隙大于2μm。由于土壤中存在的大多数土著微生物的长度介于0.5～1μm之间（Alexander et al.，1977），并且微生物能够进入的土壤内孔隙的直径必须大于2μm（Jones et al.，1993）。因此，大多数土壤中的土著微生物将被阻挡在土壤颗粒内孔隙之外，也就是只能存在于颗粒外部水溶液中。那些吸附在土壤颗粒内部的有机污染物，由于不能直接接触到微生物，因而也不能直接发生微生物降解作用。污染物必须首先从颗粒内部固定相上被解吸下来，进入内孔隙水相，然后再通过扩散作用，扩散到外部的水溶液中，才能够被外部水溶液中的微生物降解。Smith etal.（1992）通过试验研究发现，被土壤吸附的喹啉，其生物降解速度比纯水相中喹啉的生物降解速度慢30倍，所以吸附作用是影响有机污染物在河流渗滤系统中微生物降解作用的制约因素。

从本次试验的结果来看，从淋滤试验开始，土壤对BTEX的吸附作用即开始发挥，因为四种BTEX单组分浓度迅速降低，而 、 的浓度并未与BTEX同步下降，其中从第五天开始 降低，而 从第八天开始降低，说明在试验初期的几天内，微生物降解作用并未有效去除BTEX，而导致BTEX浓度下降的主要原因是吸附作用。吸附在土壤颗粒内部的有机污染物，必须通过解吸和扩散过程传输到土壤颗粒外部的水溶液中，然后才能被微生物降解。因此微生物降解作用相对于BTEX浓度变化存在一个滞后期。

在河流渗滤系统中，吸附过程发生于土壤颗粒的各个表面与有机污染物之间，在一定的温度与压力条件下，吸附过程是一个动态的可逆平衡过程，有机污染物在土壤中的浓度q与在水相中的浓度Ce之间呈线性关系，两者之间的比例系数称为有机污染物的土壤-水吸附分配系数，用Kd表示，单位为L/kg。本次试验的结果表明，BTEX在粉土和细砂中的吸附过程符合上述线性吸附模型。吸附试验也获得了BTEX四种组分在粉土和细砂中的分配系数Kd，可以看到这两种土壤对苯的吸附能力最强，甲苯次之，乙苯和间二甲苯相对较小。而淋滤试验的结果表明，在存在电子受体的情况下，降解作用对间二甲苯的去除率最高，其次是乙苯、甲苯，去除率最差的是苯，这也说明了在河流渗滤过程中有机污染的吸附过程很大程度上制约着化合物被微生物降解的效率。

当吸附达到平衡时，有机污染物在土壤水溶液中所占的质量百分比fw可用下式计算（刘凌等，2000）：

河流渗滤系统污染去除机理研究

式中：Vw为土壤水溶液的体积，L；Ms为土壤固体的质量，kg。

土壤水环境的土水比表示土壤固体质量Ms与土壤水溶液体积Vw之比，其在饱和土壤水环境中的计算式为

河流渗滤系统污染去除机理研究

式中：ρs为土壤的容重；n为土壤的总孔隙率。

将式（3-20）带入式（3-21）可得

河流渗滤系统污染去除机理研究

由此可知，如果有机污染物在土壤的吸附性越强，也就是其土壤-水分配系数越大，则有机污染物存在于土壤水溶液的质量百分比就越小，发生生物降解作用的可能性越低。据此可以将吸附试验获得的BTEX四种组分在粉土和细砂中的土壤-水分配系数Kd代入式（3-22），计算出BTEX各组分在土壤水溶液中所占的质量百分比fw，计算结果见表3-27。

表3-27 BTEX四种组分在土壤水溶液中所占的质量百分比fw 单位：％

由表3-27可知，BTEX各组分中土壤吸附性最强的是苯，其次是甲苯，而淋滤试验中所获得的去除率结果与此恰好相反，这说明在河流渗滤过程中吸附作用对于BTEX污染物的降解过程确实存在较大的影响。对于吸附性较强的苯、甲苯而言，在达到吸附平衡后，相当一部分会被滞留在土壤颗粒内部，解吸过程明显滞后，不能直接接触微生物，降低了其可利用性，因此不能直接发生微生物降解作用。但是动态的淋滤试验与静态吸附试验有所不同，由于水的流动性的增强会减少BTEX各组分的不可逆吸附部分，因此在试验后期一部分目标组分被解吸出来，且由于试验后期微生物活性受到抑制而并未参与微生物降解过程，而随着渗出液流出，导致试验后期各组分的输出浓度上升。