简述如何配制0.02mol/l乙酸铵溶液

3 原理

试样中苯甲醛残留在过量铵离子存在的条件下与1，3-环己二酮反应生成荧光衍生物。样液过滤后用C18色谱柱分离，高效液相色谱荧光检测器测定。

4试剂和材料

样液过滤

除另有说明外，所用试剂为分析纯，试验用水为符合GB/T 6682规定的一级水。

4.1甲醇：色谱纯。

4.2 20%甲醇溶液：用甲醇(4.1)和水按体积比(1+4)配制。

4.3乙腈:色谱纯。

4.4浓盐酸:优级纯。

4.5乙酸铵:优级纯。

4.6 1,3-环己二酮:含量大于97%。

4.7 C18固相萃取柱:2000 mg，12 mL。

4.8苯甲醛标准物质：纯度大于99%。

4.9苯甲醛标准储备液：称取适量苯甲醛标准物质(4.8)到100 mL容量瓶，用甲醇溶解，并稀释至刻度。储备液浓度为1 000μg/mL，放入4℃冰箱中保存。

4.10苯甲醛标准工作溶液：吸取适量苯甲醛标准储备液(4.9)用20%甲醇水溶液(4.2)稀释为10μg/mL标准工作溶液。

4.11苯甲醛标准校准溶液：吸取适量的苯甲醛标准工作溶液(4.10)，用20%甲醇水溶液分别配制成0.012μg/mL，0.024μg/mL．0.12μg/mL，0.25μg/mL，0.50μg/mL的标准校准溶液。

4.12冰水浴：将冰块捣碎放入500 mL烧杯中与水混合。

4.13具塞比色管：10 mL,25 mL。

4.14针管式过滤器滤头：0.45μm。

4.15玻璃固相萃取装置。

4.16衍生剂。

4.16.1衍生剂的制备：称取25 g乙酸铵(4.5)和2gl,3一环己二酮(4.6)于150 mL三角瓶中，加入50 mL水，在磁力搅拌器上搅拌使其完全溶解。然后边搅拌边缓慢加入8 mL浓盐酸(4.4),再搅拌5min，使浓盐酸溶解时产生的白烟散尽。转入100 mL容量瓶中并用水稀释到刻度。

4.16.2衍生剂的提纯：将初制备的衍生剂(4.16.1)转入4支25 mL具塞比色管(4.13)中，盖好塞子放入60℃热水浴中60 min。取出比色管并放人冰水浴(4.12)中30 min。把一个C18固相萃取柱(4.7)连接到玻璃固相萃取装置(4.15)上，用10 mL甲醇和20 mL水预处理萃取柱，再用5 mL初制备的衍生剂洗涤萃取柱，弃去全部淋出液。用真空泵控制淋洗流速为每秒钟2滴，使初制备的衍生剂通过萃取柱，用干净的200 mL平底烧瓶接收提纯的衍生剂。

衍生剂需当天制备，从制备到使用一般不应超过24 h。如果衍生剂放置时间太长，会明显降低衍生效率。

5仪器

5.1 高效液相色谱仪配有荧光检测器。

5.2真空泵。

5.3 pH计:测量精度士0.02。

5.4液体混匀器。

5.5磁力搅拌器。

5.6 微量进样器：25μL，100μL。

5.7天平:精确到0.1 g。

6试样的制备与保存

6.1试样的制备

实验室样品，将其搅拌均匀。不得加热。制备好的试样置于样品瓶中密封，并做上标记。6.2试样的保存

将试样于常温下保存。

7分析步骤

7.1 样品的提取

称取10 g蜂蜜样品（精确到0.1 g）置于100 mL三角瓶中，加入10 mL甲醇，在液体混匀器上高速混合并放置30 min以上。转入50 mL容量瓶中，用水洗涤三角瓶，并入容量瓶中，再用水稀释至刻度。混合均匀后为样品提取溶液。

7.2样品提取液的衍生

准确吸取0.5 mL样品提取溶液(7.1)置于10 mL具塞比色管中，加入1 mL提纯的衍生剂

(4.16.2)盖好塞子，混合均匀，放入60℃热水浴中反应2.5 h。取出比色管放入冰水浴中30 min，然后放置到室温。衍生溶液用0.45μm滤膜过滤到5mL刻度离心管中，待测。

7.3测定

7.3.1 液相色谱条件

a) 色谱柱：Diamonsil C18 5μm，250 mm×4.6 mm(内径)或相当者；

b) 流动相：乙腈十水(30+70)；

c) 流动相流速：1.O mL/min；

d) 检测器波长：激发波长380 nm,发射波长450 nm；

e) 色谱柱温度：30℃；

f) 进样量：80μL。

7.3.2色谱测定

根据样品溶液中苯甲醛残留量，选择峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品溶液中苯甲醛响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品溶液等体积参插进样进行测定。在上述色谱条件下，苯甲醛的参考保留时间约为16 min。苯甲醛标准物质的色谱图参见附录A中的图A.1。

7.4平行试验

按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.5空白试验

不称取蜂蜜样品，以20%甲醇水溶液作为空白样品按上述步骤操作。

7.6标准溶液测定

苯甲醛标准校准溶液(4.11)，按上述步骤操作。

8结果计算

结果按式(1)计算：

…………………………….（1）

式中：

X——试样中苯甲醛的残留含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

h——样品溶液中苯甲醛的峰高，单位为毫米(mm)；

hs——标准溶液中苯甲醛的峰高，单位为毫米(mm)；

c——标准溶液中苯甲醛的浓度，单位为微克每毫升(μm/mL)；

V——样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL)；

m——最终样品溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。

注：计算结果需将空白值扣除。

9精密度

本部分精密度数据是按照GB/T 6379的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度计算。

9.1重复性

在重复性条件下，蜂蜜中苯甲醛的含量在0.060 mg/kg～0.50 mg/kg时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，本部分的重复性限按方程式(2)计算：

lgr=1.055 llgm -0.967 6 ……………………………………（2）

式中：

m——两次测定值的平均值，单位为毫克每千克(mg/kg)。

如果差值超过重复性，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.2再现性

在再现性条件下，蜂蜜中苯甲醛的含景在0.060 mg/kg～0. 50 mg/kg时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R),本部分再现性限按方程式(3)计算：

lgR=0.9580lgm -0.921 4 ………………………………………(3)

式中：

m——两次测定值的平均值，单位为毫克每千克( mg/kg)。

1水相流动相每次使用前必须更换，所有流动相更换后必须超声2min。

2更换色谱柱时要小心操作，右边“细线易断”。

3每次方法平衡时，“波动”需<50才可运行，纯有机相一般需5min，有水相和缓冲液需平衡至少20min。

4在“AB”软件界面，勿点击“四”标。

5样品运行完毕后，需①冲洗色谱柱,在 UPLC操作界面,如方法用到甲酸和水,用100%甲醇(A 1)0.2ml/min流速冲30min如方法用到乙酸铵,先用90%水10%甲醇冲洗色谱柱30min流速0.2ml/min,再用100%甲醇冲洗30min。 ②灌注水路和缓冲液路,将水路/缓冲液路管路放在甲醇中,灌注该路5min。

据中国国内文献报道，酸性橙II的测定方法有纸层析法和分光光度法等，这些方法操作时间长，定量精度差。经过大量实验摸索，建立了高效液相色谱（HPLC）法测定食品中酸性橙Ⅱ的方法，本方法快速、准确，适用于食品中合成食用色素与非食用色素酸性橙II的同时测定。

原理：食品中非食用色素酸性橙Ⅱ经提取制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性，采用外标法进行定量。

仪器：高效液相色谱仪:Waters515泵，Waters紫外可见波长检测器，KQ-100DB型数控超声波清洗器，离心机。

试剂：重蒸馏水、乙酸、甲醇（色谱纯）、聚酰胺粉（过200目筛）、乙酸铵溶液（0.02mol/L）、柠檬酸溶液、无水乙醇-氨水-水溶液。酸性橙Ⅱ:美国Aldrich公司柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄:国家标准物质中心。

酸性橙Ⅱ标准溶液：准确称取干燥的酸性橙标样0.1000g，蒸馏水溶解，定容至100ml，此溶液1ml含1.00mg酸性橙Ⅱ。临用时，用蒸馏水稀释至1ml含10mg的酸性橙Ⅱ标准使用液。混合着色剂标准溶液:准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、酸性橙Ⅱ各0.100g，置100ml容量瓶中，加pH6水到刻度，配成水溶液（1.00mg/ml），临用时，用水稀释经0.45μm滤膜过滤，配成每毫升含各种标准物质10μg的混合着色剂标准使用液。

高效液相色谱参考条件

色谱柱：Diamonsil TM （钻石）C 18 5μm，200mm4.6mm色谱柱（迪马公司产品）；

流动相：甲醇（A）：0.02mol/L醋酸铵（B）；

流速：1.0ml/min，梯度洗脱如表1所示；

进样量：20μl；

柱温：室温；

紫外可变波长检测器：λ=484nm。

试样制备及测定

结果判断示意图液体样品：饮料实验前，对于含二氧化碳试样应预先加热驱除二氧化碳；配制酒类加热驱逐乙醇，可不经稀释，过0.45μm滤膜后测定。

固体样品：糕点类、卤制品类、灌制品类、辣椒面等样品，称样5.00～10.00g，粉碎混匀，加无水乙醇-氨水-水（70+1+29）溶液20ml，振摇0.5h，过滤，洗滤渣2次，合并滤液，用水（pH=6）定容，过0.45μm滤膜测定。

奶制品：可称量5.00g试样，按GB5009.23-2003聚酰胺吸附法提取色素，经0.45μm滤膜过滤测定。

色谱条件对测定的影响：酸性橙II在波长484nm测定，样品中常见的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、咖啡因、维生素C、乙酸、柠檬酸等（1mg/ml）在可见波长下无响应，不干扰测定。

流动相的选择：采用甲醇+醋酸铵体系作流动相，试剂价格便宜、易得，采用梯度洗脱可以同时测定柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄。

线性范围：对酸性橙Ⅱ在0.00～200μg/ml的范围内配制标准溶液系列9点，每标样进3针，以标样的峰面积的平均值为纵坐标，以标样的浓度为横坐标，绘制标准曲线，并利用最小二阶乘法进行线性回归，得到在0.00～100μg/ml范围内的线性方程为:A=85339.63C+105139.37，相关系数r=0.9997，酸性橙Ⅱ的检出限为0.05μg。柠檬黄、苋菜红、胭脂红及日落黄在0.00～50μg/ml范围内的线性方程分别为:A=74329.36C+5351.26，相关系数r=0.9987A=85428.98C+125212.42，相关系数r=0.9982A=85268.23C+112145.94，相关系数r=0.990A=929123.47C+152372.68，相关系数r=0.9972。

精密度：将酸性橙II试样（卤鸡爪）溶液应用本方法分别连续进样8次（n=8）。可以看出此方法精密度高，其变异系数为5.91%。

检出限：进样量10.0μl，酸性橙II的最小检出量为0.10μg，结果相对允许偏差<10%。