怎么提纯乙醇酸钠

乙醇钠处理方法：密封阴凉干燥避风保存；用铁桶密封包装，每桶200kg或160kg。贮运中要防火、防水、防潮，按易燃有毒化学品规定贮运。

乙醇钠是一种有机物，化学式为C₂H₅ONa，分子量为68.05。为白色或微黄色吸湿性粉末，在空气中易分解，贮存中易变黑。 溶于无水乙醇而不分解。乙醇钠易燃，有腐蚀性。

应用领域：

1、主要用于医药及农药工业。

2、用作强碱性催化剂、乙氧基化剂以及作为一种凝聚剂和还原剂用于有机合成、医药合成中。

3、应用乙醇钠的医药产品有苯比妥、保泰松、扑痫酮、甲基多巴、丁卡因盐酸盐、易咳嗪、氨蝶呤、乙胺嘧啶、匹呋氨苄青霉素等。此外，还用于农药及作分析试剂。

以上内容参考：百度百科——乙醇钠

乙醇钠化学式：C2H5ONa，分子量：68。乙醇钠为白色或淡黄色吸湿性粉末，在空气中贮存时分解变黑，遇水分解成氢氧化钠和乙醇，溶于无水乙醇而不分解，应密闭、避光存放于阴凉处。用途：1、乙醇钠主要用于医药工业，用作强碱性催化剂、乙氧基化剂以及作为凝聚剂和还原剂用于有机合成2、少量用于农药生产3、用作分析试剂。由固体氢氧化钠溶于乙醇和纯苯溶液（或环己烷和乙醇溶液），加热回流，连续反应脱水而制得。制取方法：实验室制备乙醇钠可以采用钠丝与无水乙醇加热反应，蒸干乙醇制得乙醇钠。储存注意事项：乙醇钠应储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。防止阳光直射。包装密封。储区应备有合适的材料收容泄漏物。

1、化学清洗：羟基乙酸70%溶液主要用作清洁剂，2%的羟基乙酸和1%的甲酸混合酸是一种效率高、成本低的清洗剂，可以用作空调、锅炉、电厂输送管道、冷凝器、热交换器等的主要清洗原料。2、生物降解材料：广泛用于制备体内埋植型缓释药物系统、埋植型修复器械、生物吸收外科缝合线、人造骨胳和器官材料等，非常具有开发前景。聚乳酸和聚乙醇酸已成为新材料领域的开发重点。3、杀菌剂：由于羟基乙酸含有羟基和羧基的特殊结构，可与金属阳离子通过配位键形成亲水螯合物，因此对铁氧化细菌的生长具有明显的抑制作用，可用作杀菌剂，还可用在多种矿石浮选中作抑制剂。4、日用化工品：99%羟基乙酸是疗效较好的去除死皮和汗毛药剂，可合成抗皮肤衰老、美白化妆品原料果酸，可以达到保湿、滋润肌肤、促进表皮更新的功效。乙醇酸的分子量非常小，它可以有效地渗透皮肤毛孔，在短时间内解决皮肤老化，皱纹，黑斑，暗疮等问题，因此被医学美容界一致推崇。5、电镀表面处理：乙醇酸还可用于电镀行业，乙醇酸钠盐、钾盐可用作电镀添加剂，也可作电镀研磨、金属酸洗、皮革染色和鞣制剂的绿色化工原料。乙醇酸也是化学镀镍的络合剂，具有耐腐蚀、反应快、光洁度好等优点，是提高化学镀镍质量的最好配剂原料。另外，乙醇酸在纺织行业可以用于染整羊毛纤维及纤维素织品交联耦合剂或含羧基纤维织物的交联催化剂；还可用作粘接剂、石油破乳剂、焊接剂和涂料的配料及合成多种医药、农药和化学助剂等。

目录1 拼音2 英文参考3 羧甲基纤维素钠药典标准 3.1 品名 3.1.1 中文名3.1.2 汉语拼音3.1.3 英文名 3.2 CAS号3.3 来源及含量3.4 性状3.5 鉴别3.6 检查 3.6.1 酸堿度3.6.2 黏度3.6.3 氯化物3.6.4 乙醇酸钠3.6.5 干燥失重3.6.6 铁盐3.6.7 重金属3.6.8 砷盐 3.7 含量测定3.8 类别3.9 贮藏3.10 版本 附：* 羧甲基纤维素钠药品说明书 1 拼音

suō jiǎ jī xiān wéi sù nà

2 英文参考

carboxymethylcellulose sodium [21世纪双语科技词典]

3 羧甲基纤维素钠药典标准3.1 品名3.1.1 中文名

羧甲基纤维素钠

3.1.2 汉语拼音

SuojiajiXianweisuna

3.1.3 英文名

Carboxymethylcellulose Sodium

3.2 CAS号

[9004324]

3.3 来源及含量

本品为纤维素在堿性条件下与一氯醋酸钠作用生成的羧甲基纤维素钠盐。按干燥品计算，含钠（Na）应为6.5%～9.5%。

3.4 性状

本品为白色至微黄色纤维状或颗粒状粉末；无臭；有引湿性。

本品在水中溶胀成胶状溶液，在乙醇、乙醚或三氯甲烷中不溶。

3.5 鉴别

取本品1g，加温水50ml，搅拌使分散均匀，制成胶状溶液，放冷，备用。

（1）取上述溶液10ml，加硫酸铜试液1ml，即生成蓝色絮状沉淀。

（2）取上述溶液5ml，加等体积氯化钡试液，即生成白色沉淀。

（3）取上述溶液，显钠盐的火焰反应（2010年版药典二部附录Ⅲ）。

3.6 检查3.6.1 酸堿度

取本品0.5g，加温水50ml剧烈搅拌，至形成胶体溶液，放冷，依法测定（2010年版药典二部附录Ⅵ H），pH值应为6.5～8.0。

3.6.2 黏度

取本品4.0g（按干燥品计），置已称定重量的250ml的烧杯中，加热水150ml，置热水浴中保温30分钟，迅速搅拌，直到粉末充分湿透，放冷，加足量的水使混合物总重为200g，静置，时时搅拌至全部溶解。调节温度至25℃，用NDJ1型旋转式黏度计，依法测定（2010年版药典二部附录Ⅵ G第二法），应为标示黏度的75%～140%。

3.6.3 氯化物

取本品1.0g（按干燥品计），精密称定，置250ml锥形瓶中，加无水乙醇5ml，再加水150ml使溶解，加浓过氧化氢溶液5滴，缓缓煮沸10分钟，冷却，加铬酸钾指示液1ml，用硝酸银滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml硝酸银滴定液（0.1mol/L）相当于3.545mg的Cl。含氯化物不得过1.0%。

3.6.4 乙醇酸钠

避光操作。取本品0.5g（按干燥品计），精密称定，置烧杯中，加5mol/L醋酸溶液与水各5ml，搅拌至少30分钟至乙醇酸钠溶解，加丙酮80ml与氯化钠2g，搅拌使羧甲基纤维素完全沉淀，滤过，用丙酮定量转移至100ml量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，静置24小时，取上清液作为供试品溶液。取室温减压干燥12小时的乙醇酸0.310g，置1000ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。精密量取5ml，置100ml量瓶中，加5mol/L醋酸溶液5ml，静置30分钟，加丙酮80ml与氯化钠2g，摇匀，用丙酮稀释至刻度，摇匀，静置24小时，作为对照溶液。取供试品溶液和对照溶液各2.0ml，分别置25ml纳氏比色管中，水浴加热至丙酮挥去，放冷，精密加2，7二羟基萘硫酸溶液（取2,7二羟基萘10mg，加硫酸100ml使溶解，放置至颜色褪去，2天内使用）20ml，密塞，摇匀，置水浴中加热20分钟，冷却，供试品溶液与对照溶液比较，颜色不得更深。必要时，取上述两种溶液，照紫外－可见分光光度法（2010年版药典二部附录Ⅳ A），10分钟内，在540nm的波长处测定吸光度，计算，不得过0.4%。

3.6.5 干燥失重

取本品1.0g，在105℃干燥6小时，减失重量不得过10.0%（2010年版药典二部附录Ⅷ L）。

3.6.6 铁盐

取本品1.0g（按干燥品计），置坩埚中，缓缓炽灼至完全炭化，放冷；加硫酸0.5ml使残渣湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在550～600℃炽灼使完全灰化，放冷，加盐酸1ml与硝酸3滴，置水浴上蒸干，放冷，加稀盐酸16ml与水适量，使残渣溶解，移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀（必要时滤过），精密量取25ml，置50ml纳氏比色管中，依法检查（2010年版药典二部附录Ⅷ G），与标准铁溶液4.0ml用同一方法制成的对照液比较，不得更深（0.016%）。

3.6.7 重金属

取本品1.0g（按干燥品计），依法检查（2010年版药典二部附录Ⅷ H第二法），含重金属不得过百万分之十。

3.6.8 砷盐

取本品0.67g（按干燥品计），加氢氧化钙1.0g，混合，加水2ml，搅拌均匀，干燥后，以小火烧灼使炭化，再以500～600℃炽灼使完全灰化，放冷，加盐酸8ml与水23ml，依法检查（2010年版药典二部附录Ⅷ J第一法），应符合规定（0.0003%）。

3.7 含量测定

取干燥失重项下的本品约0.25g，精密称定，置150ml锥形瓶中，加冰醋酸50ml，摇匀，加热回流2小时，放冷，移至100ml烧杯中，锥形瓶用冰醋酸洗涤3次，每次5ml，合并洗液于烧杯中，照电位滴定法（2010年版药典二部附录Ⅶ A），用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于2.299mg的Na。

3.8 类别

药用辅料，崩解剂和填充剂等。

3.9 贮藏

密封，在干燥处保存。

3.10 版本

吲哚（indol）试验：有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为吲哚试验阳性。

原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对位二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚。

培养基：邓亨氏蛋白胨溶液

试剂：常用下述两种。

1．欧立希氏（Ebrlich′s）吲哚试剂

对位二甲基氨基苯甲醛（P-dimethyl aminobenzaldehyde） 1g

纯乙醇 95ml

浓盐酸 20ml

先以乙醇溶解试剂，后加盐酸，要避光保存。

2．Kovacs试剂

对位二甲基氨基苯甲醛5g

戊醇（聚异戊醇）75g

浓盐酸 25ml

方法：以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白胨溶液中， 37℃培养24～48小时后（可延长4～5天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3ml，摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入试剂2毫升。在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。

也可将一指头大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏试剂，再在同处加滴两滴高硫酸钾（K2S2O4）饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸，置烧杯内水浴煮沸为止，脱脂棉上出现红色为阳性。此法略繁，但省试剂且准确，因为将试剂加到液体中，吲哚和粪臭素均呈阳性，而用此法，只是吲哚（它能挥发）呈阳性反应。

亦可以滤纸片浸湿1%的二甲基苯丙烯甲醛的10％浓HCl溶液，然后以接种环刮取一环琼脂的纯培养物涂布于该滤纸上。

细菌涂印周围呈蓝色者为阳性，细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。

厌氧菌用蛋白胨水

蛋白胨 20g

葡萄糖 10g

硫乙醇酸钠 1g

Na2HPO4（无水） 2g

琼脂 1g

蒸馏水 1000ml

加热溶解，调整pH至7.4～7.6，过滤，分装小试管，15磅高压15分钟。

在生物帮那里就有这方面的信息，我看到过的，也有丰富的视频教程。蛮不错的琼脂又名卡拉胶系用一种稀有而珍贵的热带海洋红藻—麒麟菜为原料，经科学方法取制而成。它属于关乳糖硫酸脂，含碳水化合物约75%，此外还含有人体不可缺少的无机物质—钙、碘、铁、钠等。 琼脂是一类从石花菜及其它红藻类植物提取出来的藻胶，在我国及日本已有三百多年的历史。因其有特殊的凝胶性质，已被广泛使用于食品、医药、化工、纺织、国防、科研等领域，被国际上称为“新奇的东亚产品”。 成分胰蛋白胨(tryptone) 　17.0g大豆胨 　3.0g葡萄糖 　6.0g氯化钠 　2.5g硫乙醇酸钠 　0.5g琼脂 15.0gL-胱氨酸-盐酸(L-Cys?HCl) 0.25g亚硫酸钠 0.1g1%氯化血红素溶液 0.5mL1%维生素K1溶液0.1mL2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC) 0.4g蒸馏水　 1000mL可以参考：please click to connect www.bio1000.com/zt/focus/agar.html .hope that i can help you制法1　除1%氯化血红素、维生素K1和TTC外，将其他成分混合，加热溶解。L-胱氨酸先用少量氢氧化钠溶解后加入，校正pH7.2，然后加入预先配成的氯化血红素和维生素K1，充分摇匀。装瓶，每瓶100mL。121℃高压灭菌15min，备用。2　临用前，溶解基础琼脂，每100mL基础培养基中，加入TTC40mg，充分摇匀，倾注无菌平板。3　说明将可疑空肠弯曲菌接种于平板上，在微氧环境下，于43℃培养48h。阳性菌落呈紫红色，空肠弯曲菌呈阳性反应胎儿和肠道弯曲菌呈阴性反应。1%氯化血红素溶液和1%维生素K1溶液配法：称取氯化血红素1g和1mol/L氢氧化钠5mL混合。再用蒸馏水稀释到100mL，即为1%氯化血红素溶液。称取维生素K11g和纯乙醇99mL混合，或用维生素K1针剂。琼脂卡拉胶不仅广泛应用于食品，具有清热凉肺、开胃健脾，增进食欲等功能，并可防治便秘和治疗高血压病。由于琼脂、卡拉胶溶液的胶凝性的凝胶稳定性而使琼脂广泛应用在食品工业中，可作为食品食品的稳定剂。琼脂、卡拉胶比其它胶类作出的食品味道好得多，口感更隹。琼脂除了可作稳定剂外，还可以防止包装粘连。琼脂的浓度达到0.5%至1.0%时，可作为油饼透明糖衣的稳定剂，同时提高了黏度和表面的黏着力，快速凝固并增加食品柔韧性，减少表面缺陷和裂纹。在凝胶熔化温度提同时，减少了食品的吸液软化倾向。

文献资料 - 医学书籍 - 中国生物制品规程

生物制品无菌试验规程

生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。各种生物制品的无菌试验除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。

1　抽样

1.1原液及半成品

原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为0.1%，但不得少于1.0ml。

1.1.1　大罐稀释的制品抽样数量不得少于10ml。

1.1.2　原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。

1.2　成品

每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过程的前、中、后样品）。

1.2.1分装量在100支（瓶）或以下者抽检不少于5支，101～500支（瓶）者抽检不少于10支（瓶），501～10000支（瓶）者抽检不少于20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽检40支（瓶）。

1.2.2每瓶装量20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶。6～20ml抽检量加倍。5ml和5ml以下者按1.2.1项抽检。

1.3凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品可不再做。

2　无菌试验用培养基（培养基处方可附录1）

2.1　检查制品中本菌是否存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品时检查，有专门规定者除外）。

2.2　检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。

检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。

检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含量，做成斜面。

2.3　检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。

2.4　生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。

2.5　无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210株）应达到10-8，短芽胞杆菌（7316株）和生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）应达到10-7，白色念珠菌（ATCc 10231）和腊叶芽枝霉应达到10-6。

2.6　生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵敏度试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵敏度试验法见附录2、3）。

2.7　各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定所应定期抽检各所的无菌试验培养基。

3　无菌试验方法

3.1　无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进行，无菌操作室应经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。

3.2　菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品应用直接接种法进行无菌试验。人白蛋白及人丙种球蛋白（包括各种剂型及应用途径的制品）应用薄膜过滤法进行无菌试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直接接种法进行。

3.3　直接接种法

3.3.1　菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品

3.3.1.1　每安瓿装量5.0ml以上者（不含5.0ml）取样不应少于1.0ml，装量在5.0ml以下者（含5.0ml）取样不得少于0.5ml，装量不足0.5ml者，全部吸取。

3.3.1.2　含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1:50。先按此比例接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，于20～25℃培育3～4天后移种至硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁培养基各2管，每管0.5ml。将硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面各1管置30～35℃培育，其余各管置20～25℃培育，培育时间除有专门规定者外共为8天。

3.3.1.3　不含防腐剂制品，装量在5.0ml以下者（包括5.0ml）每10支安瓿混合，装量在5.0ml以上者每7支安瓿混合，将混合后的样品直接接种一组培养基，分别置20～25℃、30～35℃培育，培育时间共为8天。

作者：天使也美丽2006-2-24 16:39 　 回复此发言

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2 生物制品无菌试验规程

3.3.1.4　支原体培养基临用时将半固体煮沸10～15分钟后，冷却到56℃左右，加入未灭能马血清或灭能小牛血清和酵母浸液（培养基、血清、酵母浸液之比为7:2:1），并可酌情加入适量青霉素或醋酸铊，充分摇匀，等冷至35～37℃时种入待检样品0.5～1.0ml，共接种2支培养基，置35～37℃培育14天。

3.3.1.5 混浊和接种后不能判定结果的制品，可取规定量的样品接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，3～4天后移种。培养基种类和支数、培育温度同3.3.1.2项，共培育8天后判定结果。

3.3.2　血液制品

3.3.2.1　取规定抽样数，按下列规定，从每瓶抽取样品，并全部接种完。

样品每瓶装量不足1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取1.0ml以上，每支装量为15ml的培养基，接种1.0ml。

样品每瓶装量以下者（不含）抽取5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽样，每支装量为40ml的培养基，接种5.0ml。

应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马丁培养基支数之比为2:1。

接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的1/2置30～35℃培育，其余置20～25℃培育，改良马丁培养基置20～25℃培育，培育时间不少于14天。

3.4　薄膜过滤法

滤膜孔径为0.22～0.3μm。

取规定抽检样品数，每瓶装量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上者取半量加入灭菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。如为含汞防腐剂者，在样品过滤后，应用灭菌生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。过滤后，无菌取出滤膜，分别放入硫乙醇酸盐培养基2支及改良马丁培养基1支（每支装量不少于40ml，高度不得低于7cm）。如果使用一个过滤装置，则将该膜剪成三等分，分别放入规定培养基中。将滤膜放入培养基后，一支硫乙醇酸盐培养基置30～35℃培育，其余各支培养基置20～25℃培育。培育时间不少于7天。

最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器，要求每支培养器培养装量为100ml。

3.5　检查厌氧性杂菌用培养基需加热驱氧者，必须冷却到45℃以下再行接种。

3.6　冻干制品按使用说明书或瓶签规定的稀释量稀释后进行无菌试验。

4　判定

4.1　无杂菌生长判为合格（有专门规定者除外）。

4.2　无菌试验发现杂菌生长，可复试。该制品量应加倍。若复试仍有同样杂菌生长，该制品判为不合格。如为不同杂菌生长，可第二次复试，复试样品为第一次复试量的2倍，若仍有杂菌生长该制品判为不合格。支原体阳性者不复试，该批制品判为不合格。

4.3　成品无菌试验不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量检定部门会同有关部门根据具体情况，全部或部分废弃。

附录 1无菌试验培养基处方

1硫乙醇酸盐培养基

　

胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg） 15g

酵母浸出粉（或酵母透析液200ml） 5g

葡萄糖

5g

氯化钠

2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）

0.5g

硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）

0.5g

琼脂

0.65～0.75g

新鲜配制的0.1%刃天青溶液（或0.2%美蓝溶液0.5ml）

1.0ml

去离子水（或蒸馏水）

加至1000ml

最后pH7.1±0.2

　

2　硫乙醇酸盐培养基（不含琼脂）

　

胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）

15g

酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）

5g

葡萄糖

5g

氯化钠

2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）

0.5g

硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）

0.5g

去离子水（或蒸馏水）

加至1000ml

最后pH7.1±0.2

　

3 改良马丁培养基

　

葡萄糖

20g

蛋白胨

5g

酵母浸出粉（或酵母透析液100ml） 2g

磷酸氢二钾

1g

硫酸镁（含7分子结晶水）

0.5g

去离子水（或蒸馏水）

菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。 ? {cF'RB.

在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选： 4jis\W}%L3

（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 ^5u}

（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。 O|%><I?I

（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。 rN$_(%m_N

菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。 8*4X%a=O f

第一节 含微生物样品的采集 Q?7U iTZ

自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。 G+^HZ4jg

一、从土壤中采样 $0D]d.w=

土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 M*8Ef^-U`t

（一）根据土壤特点 8_8 R$ =V

1．土壤有机质含量和通气状况 &'c1"%*%8>

一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。 VCNg`6!x

从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。 \@GA~x.b

2.土壤酸碱度和植被状况 -fT]}T6=

土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。由于植物根部的分泌物有所不同，因此，植被对微生物分布也有一定的影响。如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌。葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌数量比其他植被下占优势。 m:)v>vu

3．地理条件 bh3}[O,L A

南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。原因是南方温度高，温暖季节长，雨水多，相对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。 +06.PK

4．季节条件 75jq+O_:

不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。但就南方来说，春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良，即使有微生物所需的温度、湿度，也不利于其生长繁殖。随后经过夏季到秋季，约有7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多，因此，秋季采土样最为理想。 /3L1Un*

（二）采样方法 zVd2kuI&?

用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25处的土样10～25，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3～4撒到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。 &Op, ?\

二．根据微生物生理特点采样 wbyY?tH

1.根据微生物营养类型 %r=uS.+hrF

每种微生物对碳\氮源的需求不一样,分布也有差异。研究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所，容易分离到产生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。在油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株。Hartman等人曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到一株以乙烯氯化物为碳源和能源的分枝杆菌。含1%乙烯氯化物的空气通过该菌培养可除去93%的毒性。也有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为惟一碳源的3株石油降解菌菌株，分别为动胶菌属（Zoogloea sp.）、氮单胞菌属（Azomonas sp.）和假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。当然，也可将一种需要降解的物质作为样品中微生物的惟一碳源或氮源进行富集，然后分离筛选。 X2}\i5{

此外，不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉或其他糖类物质获得能源而生长。以石油等碳氢化合物为碳源的油田微生物，也可以利用一些糖类为碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他样品中也会存在。不过数量较少。 \ ExM.T

2.根据微生物的生理特性 w-C ~ Ik

在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压，如从海中筛到一株水活微球菌（Micrococcus aquivivus）,它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。 AE={P*g

三、特殊环境下采样 @{iws@.

1．局部环境条件的影响 jr bEJ.

值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外，还要受局部环境条件的影响。如北方气候寒冷，年平均温度低，高温微生物相对较少。但在该地区的温泉或堆肥中，却会出现为数众多的高温微生物。氧气充足的土层中按理只适合于好氧菌生长，实际上也有一些嫌气菌生活，原因是好气菌生长繁殖消耗了土层中大量氧气，为嫌气菌创造了局部生长的有利环境，故一般土壤中也能分离到嫌气菌。 X/ gIH/

海洋对于微生物来说是一个特殊的局部环境，尽管许多微生物也是经河水、污水、雨水或尘埃等途径而来，但由于海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件，使海洋微生物具备特殊的生理活性，相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物。前苏联学者发现，20%～50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物。此外，美国马里兰大学也曾从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质。日本发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌，80%以上的菌株可以生产EPA 和DHA，最高产量可达36%和24%。笔者从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌，产EPA14.78mg/L，在15℃培养时EPA占脂肪酸的12.7%。日本也从海洋Thraustochvtrium aureum中筛选到一株产DNA达290mg/L的菌株。从海洋中采样时，可参考其中不同种类微生物的分布规律：表层多为好气异养菌，底层由于有机质丰富，硫化氢含量高，厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多，两层中则多为紫硫菌。 u_*Ay

具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。如得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的，能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物，其原因是这里生活这2000万只蝙蝠，它们每晚吃钓5万lb（磅）昆虫，其排泄物造成了洞内0m深的丰富营养层，这种特殊的环境对该种微生物起了选择和富集的作用。还有人从侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物。从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌，这可能因为考拉专吃含有高萜烯的桉树类植物，给该种微生物创造了一个适宜的生长环境。美国从用硝酸处理过的花生壳中分离到一株节杆菌，该菌以木质素为唯一碳源，它对处理过的花生壳的消化率可达到63%，再加入酿酒酵母使其蛋白质含量达到13.6%，可作为牛、猪、鸡饲料的添加剂。 |NJe4lw+?

2．极端环境条件的影响 MqGF~h|+

微生物一般在中温、中性pH条件下生长。但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。生活所处的特殊环境，导致它们具有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能，因而在冶金、采矿及生产特殊酶制剂方面有着巨大的应用价值。 Z.am^Q^Y!

嗜冷菌（thermophiles）的最适生长温度为15℃，在0℃也可生长繁殖，最高温度不超过20℃。主要分布于寒冷的环境中，如南北两极地区、冰窟、高山、深海和土壤等低温环境中。这类微生物在低温发酵时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染。最适生长pH在8.0以上，通常在pH9～10之间的微生物，称之为嗜碱菌（alkaliphiles）。大量不同类型的嗜碱菌已经从土壤、碱湖、碱性泉甚至海洋中分离得到。由于大部分碱湖伴有高盐，许多嗜碱菌同时也是嗜盐菌。该类菌所产生的酶如耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶可作为洗涤剂的舔加成分，也可将碱性淀粉酶用于纺织品工业。嗜碱菌中的基因还可以用来调节其他细菌中基因产物的表达和分泌。嗜热微生物是嗜热菌最好的来源。有人从温泉和海底火山口分离出了极端嗜热菌。从意大利境内的喷硫磺气的火山口中分离到一种原始的微生物，在pH2和90℃时生长最好，其代谢类型极不寻常，既能作为耗氧型自养菌将硫氧化成硫酸，使自己增殖，又能作为厌氧菌用氢还原硫，生成H2S。 l=8)_z~D

第二节 含微生物样品的富集培养 $#2ik~]>

富集（enrichment）培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。 v_)a=I%o&2

富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。一般可从以下几个方面来进行富集。 ZHKTOoK

一、控制培养基的营养成分 )67_yHW

微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。如果环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该物质的微生物也较多。因此，在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。当然，能在该种培养基上生长的微生物并非单一菌株，而是营养类型相同的微生物群。富集培养基的选择性只是相对的，它只是微生物分离中的一个步骤。 sDT(3{)L7

现举两例，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。此时分离将得到所需的微生物。又如要分离耐高渗酵母菌，由于该类菌在一般样品中含量很少，富集培养基和培养条件必须严密设计。首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样。富集培养基为5%～6%的麦牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃温度下进行培养，可以达到富集的目的。 , mEFp_a+

在富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基，如淀粉琼脂培养基通常用于丝状真菌的增殖，配方为（%）：可溶性淀粉4，酵母浸膏0.5，琼脂2，pH6.5～7.0。在配制时要特别注意酵母浸膏加量，过多会刺激菌丝生长，而不利于孢子的产生。 Y:[WwX|

根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养数次。同时将苯胺浓度逐步提高，便可得到降解苯胺占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。移种的时间既可根据底物的降解情况，也可通过微生物的生长情况确定。如在分离环己烷降解菌时，样品经环己烷为惟一碳源的培养基富集后，培养液由原来的无色变为浑浊的乳白色。同时锥行瓶壁上也可观察到微生物的生长情况。此时可以2%的接种量移入新鲜的富集培养基中继续培养。连续富集培养的方法虽耗时较长，有时甚至需要6～7个月，但效果较好。通过该方法分离DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌，也都取得了满意的结果。 W6ZXb_X

二、控制培养条件 OSk:njyC[

在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。因此，富集培养基的pH值调节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。 P1T-.X~&

分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20分钟，有利于孢子的萌发，可以较大的增加放线菌数目，达到富集的目的。 ,cPNZ-%

筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性，设计适宜的培养条件，达到富集的目的。 3p{N7/z(

一般所筛选的微生物通常是好氧菌，但有时也需分离厌氧菌。因严格厌氧菌不仅可省略通气、搅拌装置，还可节省能耗。这时除了配置特殊的培养基外，还需准备特殊的培养装置，创造一个有利于厌氧菌的生长环境，使其数量增加，易于分离。 WJ=DTON

三、抑制不需要的菌类 vA@Kb3 ,

在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集微生物的数量以有利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。 Kdh(vNB>

从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀死，要在121℃才能彻底死亡。可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。在富集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性无抑制作。分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。 9+"D8 J7

筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品的比例提高，从中便于分离到所需的菌株；分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml，以及丙酸钠10μg/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长。另外据报道，重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌。在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100℃保温1h，可减少细菌和链霉菌的数量。分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间，杀死非目的微生物后再进行分离。 LO]D XW 9

对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养以提高分离工作效率是十分必要的。但是如果按通常分离方法，在培养基平板上能出现足够数量的目的微生物，则不必进行富集培养，直接分离、纯化即可。 3{RuR+yi

第三节 微生物的分离 }uo5rB5D

经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。例如同样一群以油脂为碳源的脂肪酶产生菌，有的是细菌，有的是霉菌，有的是芽孢杆菌，有的不产芽孢，有的生产能力强，有的生产能力弱等等。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。 Mm`jk%:%]